Presentazione della modifica della fosforilazione mediante l'elettroforesi su gel Phos-tag SDS-PAGE e il saggio della chinasi in vitro

Sommario

Questo protocollo descrive le procedure per rilevare i cambiamenti nelle modifiche della fosforilazione delle proteine bersaglio utilizzando l'elettroforesi su gel Phos-tag in campioni clinici e saggi di chinasi in vitro .

Abstract

La fosforilazione è una classica modifica post-traduzionale che regola la funzione delle proteine. Le proteine contengono tipicamente più potenziali siti di fosforilazione, che possono essere modificati da varie chinasi in posizioni diverse. Lo studio dei cambiamenti di fosforilazione delle proteine bersaglio nella malattia richiede spesso anticorpi fosfo-specifici. Tuttavia, le opzioni commerciali possono essere limitate a un singolo sito o del tutto non disponibili. In questo articolo, viene descritto un metodo per rilevare i cambiamenti nelle modifiche della fosforilazione delle proteine bersaglio nei campioni clinici utilizzando l'elettroforesi su gel Phos-tag e per identificare i siti di fosforilazione dettagliati attraverso saggi di chinasi in vitro . Le proteine fosforilate legate al Phos-tag mostrano tassi di migrazione più lenti nell'elettroforesi su gel SDS-PAGE, consentendo un'analisi semiquantitativa dei cambiamenti di fosforilazione nei tessuti malati in base all'intensità media dei pixel delle bande a migrazione lenta. Combinando Phos-tag SDS-PAGE con l'immunoblotting utilizzando anticorpi pan-specifici contro più proteine candidate, i ricercatori possono identificare in modo efficiente le proteine bersaglio con cambiamenti di fosforilazione. Dopo lo screening delle chinasi candidate, vengono eseguiti saggi di chinasi in vitro con la proteina bersaglio e i prodotti fosforilati risultanti vengono sottoposti a spettrometria di massa per un'identificazione precisa del sito. Questo metodo non richiede anticorpi specifici contro le proteine fosforilate, consentendo uno screening su larga scala di campioni di tessuto per identificare gli stati di fosforilazione alterati nella malattia. Inoltre, i siti di fosforilazione identificati possono essere utilizzati per sviluppare anticorpi specifici per l'analisi quantitativa e di localizzazione nei tessuti patogeni, fornendo informazioni più approfondite sui loro ruoli funzionali.

Introduzione

La fosforilazione è una modifica post-traduzionale chiave per modulare la localizzazione subcellulare, l'attività chinasica e l'attività trascrizionale delle proteine. Nel genoma umano sono stati trovati più di 500 geni protein chinasi, che sono coinvolti nella trasduzione del segnale, nell'espressione genica e nell'interazione proteina-proteina¹. La fosforilazione e la defosforilazione sono sotto il controllo di varie chinasi, che sono rapidamente reversibili per regolare l'adesione cellulare, la proliferazione cellulare e la differenziazione cellulare². Tuttavia, le modifiche anomale della fosforilazione delle proteine sono responsabili di molte malattie umane, tra cui la tumorigenesi, le malattie autoimmuni, la neurodegenerazione e la subfertilità ^3,4,5.

Il profilo fosfoproteomico dei campioni clinici produce più proteine fosforilate differenzialmente candidate⁶. Per rivelare le principali modificazioni della fosforilazione nelle malattie umane, è necessario un metodo semplice ed efficiente per rilevare lo stato di fosforilazione di specifiche proteine bersaglio. La fosforilazione in siti diversi potrebbe portare ad alterazioni funzionali distinte nella proteina. Pertanto, l'utilizzo di anticorpi specifici per la fosforilazione mirati a particolari siti di amminoacidi è senza dubbio il metodo migliore per rilevare i cambiamenti nella fosforilazione delle proteine. Tuttavia, gli anticorpi fosfo-specifici ben caratterizzati sono assenti per molte proteine. Inoltre, è necessario un approccio più adatto per identificare nuovi potenziali siti di fosforilazione. La fosforilazione in corrispondenza di specifici residui di amminoacidi spesso altera la velocità di migrazione di una proteina nell'elettroforesi su gel e le bande a migrazione più lenta possono riflettere i cambiamenti nello stato di fosforilazione⁷. Tuttavia, questi cambiamenti di mobilità sono solitamente sottili, il che li rende difficili da distinguere. Phos-tag è un composto chimico sintetizzato progettato a partire da un dominio catalitico di fosfatasi alcalina come modello, in grado di catturare residui fosforilati di Ser/Thr/Tyr e His/Asp/Lys. Pertanto, la coniugazione del phos-tag amplifica efficacemente le differenze di velocità di migrazione tra proteine fosforilate e non fosforilate, distinguendo anche le variazioni nel numero di siti di fosforilazione⁸.

Questa metodologia basata su Phos-tag per rilevare le variazioni di fosforilazione delle proteine bersaglio nei campioni di tessuto offre vantaggi distinti rispetto agli approcci convenzionali. Fondamentalmente, elimina la necessità di anticorpi fosfo-specifici, utilizzando invece anticorpi specifici per la proteina WB-grade standard per il rilevamento. Le forme fosforilate e non fosforilate delle proteine bersaglio vengono risolte come bande distinte durante Phos-tag SDS-PAGE, consentendo una valutazione semiquantitativa delle alterazioni del livello di fosforilazione negli stati patologici attraverso l'analisi comparativa dell'intensità della banda. Il flusso di lavoro di questo protocollo include: (1) separazione Phos-tag SDS-PAGE di campioni proteici, (2) screening immunoblot per bersagli fosforilati, (3) saggi di chinasi in vitro con chinasi candidate verificate da anticorpi fosfo-Ser/Thr. La successiva analisi di spettrometria di massa (condotta da una piattaforma di servizi esterna) identifica i siti di fosforilazione per consentire lo sviluppo di anticorpi sito-specifici; La metodologia dettagliata non è inclusa nell'attuale protocollo. In particolare, questo approccio è stato applicato con successo per rilevare le variazioni della fosforilazione di Nur77 nei campioni clinici, identificando la chinasi Mst1 come regolatore a monte della fosforilazione di Nur77 e sviluppando un fosfo-anticorpo sito-specifico per la rilevazione clinica della fosforilazione alla treonina 366 di Nur77⁹. Pertanto, questo approccio si rivela particolarmente prezioso durante le fasi preliminari di ricerca quando si studiano più proteine candidate, in quanto consente lo screening su larga scala dei cambiamenti dello stato di fosforilazione in numerosi bersagli utilizzando anticorpi disponibili in commercio.

Protocollo

I comitati di revisione istituzionale dell'ospedale Nanjing Drum Tower hanno approvato la ricerca sull'essere umano (2013-408081-01). L'attuale protocollo è stabilito utilizzando il tessuto endometriale come modello rappresentativo. Con un'adeguata ottimizzazione, questa metodologia può essere estesa ad altri campioni clinici, inclusi, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, i tessuti tumorali per l'estrazione delle proteine e le successive analisi. La biopsia endometriale viene eseguita nella fase medio-secretoria da donne fertili (gruppo di controllo) e donne con fallimento ricorrente dell'impianto embrionale sottoposte a fecondazionein vitro-trasferimento di embrioni (gruppo di malattia). Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato prima della procedura di campionamento. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione dei campioni

1. Sciacquare due volte i campioni di tessuto fresco ottenuti con PBS pre-raffreddato per rimuovere le cellule del sangue e separare circa 100 mg di tessuto in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
2. Posizionare il tessuto in una provetta da 2 mL a fondo tondo contenente 1 mL di tampone per la lisi delle proteine tissutali (150,0 mmol/L NaCl, 1,0% NP-40, 50,0 mmol/L Tris pH 8,0, sodio desossicolato 0,5%, cocktail di inibitori della proteasi e cocktail di inibitori della fosfatasi 2 e 3).
3. Impostare la velocità del dispersore tissutale ad alta velocità al livello 5 (su 6 livelli) e macinare il tessuto per 10 s, seguiti da 30 s di incubazione su ghiaccio. Ripetere questo processo 5 volte per ottenere l'omogeneizzato tissutale.
4. Liare l'omogeneizzato ruotando lentamente su un agitatore a 4 °C per 30 minuti, quindi centrifugare a 4 °C e 13.000 × g per 10 minuti e raccogliere il surnatante.
5. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il metodo BCA.
6. Prelevare un totale di 300 μg di proteine, regolare a un volume uguale e mescolare con 4× tampone per campioni di proteine Laemmli. Denaturare la miscela riscaldandola a 95 °C per 8 minuti, raffreddandola a temperatura ambiente e caricandola per ulteriori analisi.
   NOTA: Prima della fase 2, si raccomandano le analisi convenzionali di Western blotting per rilevare la proteina di interesse utilizzando anticorpi totali per valutare i livelli di espressione.

2. Preparazione del gel Phos-tag SDS-PAGE

1. Preparare 100 ml di soluzione mista al 30% p/v di acrilammide/N, N'-metilene-bisacrilammide aggiungendo 29,0 g di acrilammide e 1,0 g di N, N'-metilene-bisacrilammide.
   NOTA: Mantenere a 4 °C al buio.
2. Preparare la soluzione di Tris-HCl da 1,5 mol/L (pH 8,8), la soluzione di Tris-HCl da 0,5 mol/L (pH 6,8), la soluzione SDS al 10% p/v e la soluzione di persolfato di ammonio al 10% p/v come utilizzato nella SDS-PAGE convenzionale.
3. Preparare 5,0 mmol/L di soluzione Phos-tag e 10 mmol/L di MnCl₂ Soluzione specifica per Phos-tag SDS-PAGE gel.
4. Preparare la soluzione in gel risolutivo, in caso di preparazione della soluzione da 10 mL con gel di poliacrilammide 6 p/v% con soluzione Phos-tag 50 μM e 100 μM MnCl₂, miscelando 2 mL di soluzione mista di acrilammide/bis-acrilammide al 30% (p/v), 2,5 mL di soluzione Tris/HCl da 1,5 mL/L (pH 8,8), 0,1 mL da 5,0 mmol/L di soluzione Phos-tag, 0,1 mL di soluzione di MnCl₂ da 10 mmol/L, 0,1 mL di soluzione SDS al 10% (p/v), 10 μL di TEMED e 5,14 mL di acqua distillata.
5. Agitare delicatamente la soluzione di gel risolutiva preparata per garantire l'omogeneità, quindi posizionare la provetta della soluzione di gel in un essiccatore sottovuoto e applicare un vuoto (0,1 MPa) per 2 minuti fino a quando non rimangono bolle visibili.
6. Aggiungere 50 μl di persolfato di ammonio al 10% e mescolare delicatamente ma accuratamente.
7. Pipettare immediatamente la soluzione nella cassetta del gel assemblata fino a raggiungere ~1 cm sotto il bordo superiore della piastra corta. Evitare di introdurre bolle.
8. Sovrapporre con cura 0,5 ml di acqua distillata sopra il gel per escludere l'aria e garantire un'interfaccia piatta. Lasciare polimerizzare a temperatura ambiente per 20-30 min.
9. Allo stesso tempo, preparare una soluzione standard di gel di impilamento tamponato Tris-HCl (gel di poliacrilammide al 4,5% p/v) mescolando 0,6 mL di soluzione mista di acrilammide/bis-acrilammide al 30% (p/v), 1 mL di soluzione di Tris-HCl 0,5 mol/L (pH 6,8), 40 μL di soluzione SDS al 10% (p/v), 4 μL di TEMED e 2,33 mL di acqua distillata. Vorticare delicatamente e degassare.
10. Assicurarsi che il gel si sia completamente solidificato (inclinare la cassetta del gel per osservare l'inclinazione dello strato liquido superiore e confermare l'immobilità dell'interfaccia intermedia). Versare con cura il rivestimento dell'acqua, quindi scolare completamente.
11. Aggiungere 20 μl di persolfato di ammonio al 10% nella soluzione di gel da impilare preparata, mescolare delicatamente e pipettarla immediatamente sopra il gel risolutivo.
12. Posizionare con cura un pettine a 10 o 15 pozzetti nella soluzione di gel da impilare, evitando la formazione di bolle. Lasciare polimerizzare il gel da impilare a temperatura ambiente per 10 minuti.
    NOTA: Preparare sempre il gel appena prima dell'uso. Si prega di ottimizzare le concentrazioni di Phos-taged e acrilammide per ogni proteina di interesse.

3. Elettroforesi del Phos-tag SDS-PAGE

1. Assemblare l'attrezzatura per l'elettroforesi e riempire le camere degli elettrodi con il tampone di corsa convenzionale Tris/Glicina/SDS.
2. Caricare 30 μg di campione di proteine in ciascun pozzetto utilizzando una micropipetta.
3. Eseguire l'elettroforesi in condizioni di corrente costante (30 mA/gel) fino a quando il blu di bromofenolo raggiunge il fondo del gel risolutivo.
4. Immergere i gel nel tampone di trasferimento SDS-PAGE privo di metanolo con 5 mM EDTA per 10 minuti due volte per rimuovere i cationi bivalenti.
5. Trasferire le proteine sulla membrana in PVDF a 90 V per 90 minuti utilizzando sistemi di blotting a umido/serbatoio.

4. Immunoblotting e analisi

1. Bloccare la membrana con una soluzione al 5% di latte scremato o polvere di albume di siero bovino (diluito in soluzione di 1×tris-borato-sodio Tween-20, TBST) a temperatura ambiente per 1 ora.
2. Diluire l'anticorpo primario contro la proteina bersaglio con un rapporto appropriato e incubare con la membrana a 4 °C per una notte.
3. Lavare la membrana 3 volte con TBST, 10 minuti per lavaggio, a temperatura ambiente con una leggera agitazione.
4. Incubare la membrana con un anticorpo secondario coniugato con HRP a temperatura ambiente per 1 ora.
5. Lavare la membrana 3 volte con TBST, 10 minuti per lavaggio, a temperatura ambiente con una leggera agitazione.
6. Incubare con il substrato di chemiluminescenza potenziato al buio per 1 minuto, seguito dall'esposizione.
7. Acquisisci le immagini utilizzando un sistema automatizzato di documentazione su gel e quantifica le bande target (proteina bersaglio fosforilata a migrazione lenta e proteina bersaglio non fosforilata a migrazione rapida) per l'intensità della scala di grigi utilizzando il software ImageJ.
   NOTA: I Western blot dei gel Phos-Tag non possono essere utilizzati per effettuare assegnazioni di peso molecolare.
8. Calcolare il rapporto tra le bande fosforilate a migrazione lenta e le bande non fosforilate a migrazione rapida per ciascun campione e analizzare la differenza statistica della percentuale di fosforilazione tra i gruppi.

5. Immunoprecipitazione della proteina bersaglio

1. Costruire plasmidi di espressione che codificano per fosfomutanti wild-type o sito-specifici della proteina bersaglio con tag FLAG (o tag di epitopi alternativi inclusi, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, HA, GFP, GST o His).
2. Trasfettare le cellule HEK293 con plasmidi di espressione utilizzando Lipofectamine 3000 secondo il protocollo del produttore.
3. Lisi le cellule in 1 mL di tampone di lisi delle proteine tissutali come descritto nella fase 1 per estrarre il surnatante proteico.
4. Incubare il surnatante con 20 μl di gel di affinità Anti-FLAG M2 per una notte a 4 °C con rotazione.
5. Centrifugare (1000 × g, 3 min), raccogliere le perle di agarosio e lavare con 10 volumi di colonna di TBS per rimuovere le proteine legate in modo non specifico.
6. Sciogliere il peptide FLAG in TBS fino a una concentrazione finale di 100 μg/mL.
7. Eluire la proteina di fusione FLAG legata dal gel di affinità anti-FLAG M2 mediante eluizione competitiva con cinque volumi di una colonna di soluzione peptidica FLAG (utilizzare una soluzione da 100 μL per 20 μL di perle di agarosio) per 5-10 minuti mescolando delicatamente.
8. Centrifugare (1000 × g, 3 min) e raccogliere il surnatante.
   NOTA: Se la chinasi è nota, procedere al passaggio 6; in caso contrario, identificare prima le potenziali chinasi attraverso lo screening a due ibridi di lievito o la previsione bioinformatica (ad esempio, utilizzando PhosphositePlus o Group-based Prediction System) prima di continuare con la fase 6.

6. Saggio in vitro della chinasi per l'identificazione degli amminoacidi fosforilati

1. Preparare il tampone chinasi (30 μL per reazione): 40 mM HEPES pH7.6, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 2,5 mM β-glicerofosfato, 200 μM ATP, 100 ng di chinasi attiva, proteina di fusione FLAG immunoprecipitata.
2. Incubare a 30 °C per 30 minuti in termomiscelatore con agitazione delicata.
3. Arrestare le reazioni aggiungendo 10 μl di tampone Laemmli 4× e denaturare a 95 °C per 5 minuti.
4. Eseguire l'elettroforesi convenzionale SDS-PAGE utilizzando la proteina di fusione FLAG immunoprecipitata che ha reagito con o senza chinasi attiva.
5. Sonda con anticorpo anti-fosfo-Thr e anticorpo anti-fosfo-Ser per identificare gli amminoacidi fosforilati. Sonda con anticorpo Anti-Flag come controllo (vedi Tabella dei materiali).
6. Completare l'immunoblotting e l'analisi come descritto al punto 4.

Risultati

Il profilo fosfoproteomico preliminare di campioni umani del gruppo di controllo e del gruppo malattia ha identificato Nur77 come proteina candidata fosforilata in modo differenziale. Per valutare l'efficacia di Phos-tag SDS-PAGE nel rilevare la fosforilazione della proteina Nur77, è stato eseguito un esperimento SDS-PAGE Mn²⁺-Phos-tag. Dopo l'estrazione totale delle proteine dai campioni di tessuto, 30 μg di proteine sono stati caricati e separati mediante elettroforesi su gel Mn²⁺-Phos-tag, seguit...

Discussione

L'approccio basato su Phos-tag per rilevare le variazioni di fosforilazione delle proteine bersaglio nei tessuti clinici offre vantaggi significativi per la ricerca sulla fosforilazione delle proteine. Le proteine fosforilate mostrano una ridotta mobilità elettroforetica a causa del legame con Phos-tag, consentendo uno screening ad alto rendimento dello stato di fosforilazione delle proteine candidate senza richiedere anticorpi fosfo-specifici. Ciò è particolarmente prezioso per la profi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10% Soluzione SDS	Sangon Biotech	B548118
10x Tris/Glicina/SDS	BIO-RAD
1610732 4&volte;   Campione di proteine Laemmli	BIO-RAD	1610747
Acrilammide	Sangon Biotech	A601032
Persolfato di ammonio	Sangon Biotech	A100486
Gel di affinità Anti-FLAG M2	Millipore	A2220
Kit di chemiluminescenza potenziata	ThermoFisher	32106
FLAG anticorpo	CST	14793
BANDIERA  Peptide	Millipore	F3290
Anticorpo secondario coniugato HRP	Bioworld Technology	BS13278
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015
Mini Trans-Blot Cell	BIO-RAD	1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell	BIO-RAD	1658005
Mst1	CST	3682
N, N'-metilene-bisacrilammide	Sangon Biotech	A600025
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED)	Sangon Biotech	A610508
Nur77 anticorpo	CST	3960
Cocktail di inibitori della fosfatasi 2	Sigma	P5726	Per l'inibizione delle fosfatasi proteiche tirosina, acido e fosfatasi alcaline
Cocktail di inibitori della fosfatasi 3	Sigma	P0044	Per l'inibizione della proteina fosfatasi 2A, fosfatasi alcaline, proteine fosfatasi 1 e 2A
Anticorpo fosfo-serina	Sigma	P5747
Anticorpo fosfo-treonina	Sigma	P6623
Phos-tag Acrylamide	Wako	304-93526	Per la preparazione di Phos-tag SDS PAGE gel
Pierce Kit per il dosaggio delle proteine BCA	Thermo	23227
Cocktail di inibitori della proteasi	Sigma	S8830	EDTA-Free, compresse, per l'inibizione della serina, della cisteina, dell'aspartico e delle metalloproteasi
Membrana PVDF.	Roche	3010040001
ThermoMixer	Eppendorf	2231001127
Dispersore di Tessuti	IKA	T 10	Per ottenere l'omogeneizzato tissutale
Tampone Tris-HCl (0,5 M, pH 6,8)	Sangon Biotech	B546020
Tampone Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8)	Sangon Biotech	B546019
Essiccatore sottovuoto	ThermoFisher	5311-0250	Per degassare la soluzione in gel
β-Mercaptoetanolo	Sigma	M3148