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Articolo metodologico

Manipolazione e analisi dei processi dipendenti dal ciclo cellulare nel lievito in gemmazione

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DOI:

10.3791/68887

⸱

26 settembre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive in dettaglio due metodi di arresto del ciclo cellulare di lievito e rilascio opzionale, ed elabora l'uso della microscopia a fluorescenza per studiare i processi dipendenti dal ciclo cellulare in S. cerevisiae.

Abstract

Le cellule eucariotiche seguono un ciclo cellulare conservato che regola diversi processi, tra cui il mantenimento del DNA e l'omeostasi degli organelli. Lo studio dei processi cellulari in modo dipendente dal ciclo cellulare è spesso necessario per interpretare correttamente i risultati sperimentali. Sono disponibili metodi chimici e genetici per produrre la sincronizzazione del ciclo cellulare in cellule coltivate in un'ampia gamma di organismi, compresi i modelli di vertebrati, consentendo lo studio dei processi dipendenti dal ciclo cellulare. Tuttavia, tra gli organismi modello, il lievito in gemmazione rimane una centrale elettrica per l'analisi del ciclo cellulare grazie ai suoi metodi di sincronizzazione particolarmente robusti, al breve tempo di generazione e alla trattabilità genetica. Il lievito condivide il meccanismo principale del ciclo cellulare con altri eucarioti, il che ha permesso scoperte fondamentali nella regolazione del ciclo cellulare. Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi per l'analisi del ciclo cellulare nel lievito, concentrandosi sugli esperimenti di arresto-rilascio G1 e arresto-rilascio mitotico, tra cui la costruzione del ceppo, la preparazione della coltura e la microscopia. Vengono presentati i metodi di marcatura PCR per la produzione di ceppi adatti per l'arresto del ciclo cellulare e la microscopia a fluorescenza. Un arresto G1 si ottiene utilizzando il feromone peptidico α-fattore e brevi lavaggi provocano un rilascio sincrono e una progressione del ciclo cellulare. I campioni vengono prelevati in diversi momenti dopo il rilascio nel ciclo cellulare e fissati per la microscopia. Un secondo metodo arresta le cellule di lievito in mitosi esaurendo il regolatore del ciclo cellulare Cdc20 per ottenere una popolazione arrestata in metafase, nonché il rilascio opzionale in anafase. I campioni vengono fissati e preparati per l'imaging prima e dopo il rilascio, e vengono ripresi e analizzati. L'analisi delle immagini si concentra sulla catalogazione della localizzazione dinamica e sui cambiamenti di abbondanza della popolazione delle proteine nel ciclo cellulare. Questi metodi di sincronizzazione sono adatti per diverse manipolazioni del ciclo cellulare e, sebbene il loro utilizzo nell'imaging di cellule fisse sia qui evidenziato, possono essere adattati per molte altre analisi, tra cui l'imaging di cellule vive e saggi biochimici e molecolari.

Introduzione

La divisione cellulare eucariotica è altamente regolata attraverso un programma chiamato ciclo cellulare. I processi altamente conservati e dinamici che si verificano nel ciclo cellulare lo rendono interessante da studiare in sé e per sé, ma hanno anche implicazioni diffuse che informano le indagini su altri processi biologici cellulari: ad esempio, molti organelli subiscono un drammatico rimodellamento durante la divisione cellulare e l'abbondanza e la localizzazione di molte proteine è altamente regolata in tutto l'1,2,3. Sebbene ci siano alcuni livelli aggiuntivi di complessità presenti nei sistemi metazoici rispetto al lievito, tra cui una maggiore varietà di chinasi regolatorie e proteine, nonché ulteriori input da segnali esterni nei metazoi, la divisione cellulare è complessivamente molto conservata in tutti gli eucarioti 4,5. Nel lievito è stato svolto molto lavoro fondamentale per stabilire le intuizioni chiave sulla progressione del ciclo cellulare e sui passaggi regolatori cruciali, che rimane un organismo estremamente attraente per lo studio di questioni relative al ciclo cellulare per una moltitudine di motivi 6,7. Il principale tra questi è l'ampia gamma di metodi disponibili per manipolare il ciclo cellulare, consentendo l'arresto in varie fasi e la sincronizzazione delle cellule. Ulteriori vantaggi includono il breve ciclo cellulare del lievito (~90-150 minuti a seconda della temperatura e delle condizioni del terreno), la facilità della manipolazione genetica e l'ampia gamma di alleli condizionali che consentono lo studio in un contesto altrimenti wild-type.

La progressione attraverso le diverse fasi del ciclo cellulare è guidata dall'attività di diverse chinasi chiave, tra cui l'onnipresente chinasi ciclina-dipendente (Cdk), la chinasi Polo-like e l'Aurora chinasi. I checkpoint del ciclo cellulare regolano la progressione attraverso il ciclo cellulare, assicurando che le cellule non progrediscano nella fase successiva della divisione a meno che non siano soddisfatte condizioni specifiche 8,9. Questi checkpoint, e le transizioni che regolano, possono essere dirottati dai ricercatori per ottenere un arresto a lungo termine, o un arresto e un rilascio transitori per sincronizzare una popolazione di cellule (Figura 1). Ad esempio, il checkpoint di impegno del ciclo cellulare (punto di restrizione o inizio nel lievito) assicura che la cellula abbia abbastanza nutrienti per impegnarsi nella divisione prima di iniziare la replicazione del DNA10. Questo checkpoint può essere manipolato nel lievito aploide per ottenere un arresto G1, sfruttando il programma di accoppiamento del lievito che interagisce con il ciclo cellulare. Nel lievito di birra (Saccharomyces cerevisiae), le cellule aploidi hanno uno dei due tipi di accoppiamento, MATa o MATα, che è geneticamente determinato da un locus di tipo di accoppiamento. I lieviti di un tipo di accoppiamento sono sensibili al feromone di accoppiamento dell'altro tipo di accoppiamento e rispondono attivando una cascata di segnalazione della MAP chinasi che alla fine fosforila e stabilizza l'inibitore di Cdk Far1, che impedisce l'ingresso nel ciclo cellulare legandosi al complesso Cln1/2-Cdk e bloccandone l'attività 11,12,13. Le cellule che rispondono ai feromoni di accoppiamento possono essere determinate visivamente dalla presenza di una proiezione di accoppiamento o shmoo (Figura 1). Pertanto, il fattore α sintetizzato chimicamente può essere aggiunto a colture di cellule MATa per ottenere un arresto G1. Un'altra transizione del ciclo cellulare che i ricercatori possono prendere di mira per sincronizzare le cellule di lievito è la transizione da metafase ad anafase. Durante la mitosi, il Spindle Assembly Checkpoint (SAC) monitora l'attaccamento dei cinetocori ai microtubuli e inibisce il complesso/ciclosoma promotore l'anafase (APC/C) sequestrando il suo attivatore, Cdc20, quando vengono rilevati cinetocori non attaccati. L'APC/C è un complesso ligasi E3 essenziale per l'ingresso in anafase. Quando il SAC è soddisfatto, Cdc20 lega l'APC/C e l'APC/C ubiquitina diverse proteine, principalmente la securina e la ciclina B, che le bersaglia per la degradazione, e promuove la segregazione cromosomica e l'uscita mitotica14,15. Sebbene Cdc20 in sé non sia un componente del SAC, la sua inibizione è l'obiettivo dell'attivazione del SAC; pertanto, la deplezione inducibile di Cdc20 può essere sfruttata per arrestare una coltura di lievito in metafase (Figura 1)16.

Questo protocollo comprende due metodi di manipolazione del ciclo cellulare del lievito, nonché un esempio di applicazione di ciascun metodo. Nel primo, il fattore α viene utilizzato per arrestare le cellule in G1, seguito da una fase di lavaggio per rilasciare le cellule dall'arresto, con conseguente rientro sincrono del ciclo cellulare. Le cellule sincronizzate continueranno per l'intero ciclo cellulare, consentendo ai ricercatori di tracciare e studiare le cellule in ogni fase del ciclo cellulare. In questo metodo, la localizzazione dinamica di una proteina di interesse marcata con GFP, Stu2, viene monitorata per tutto il tempo e viene tracciata la sua associazione con il fuso mitotico. Questo metodo sfrutta anche un componente del corpo dell'asta del mandrino (SPB) etichettato, Spc110-mCherry, che consente di misurare la lunghezza del fuso mitotico ed è un eccellente proxy per la progressione del ciclo cellulare17. Questo metodo dimostra come l'arresto e il rilascio del ciclo cellulare consentano la sincronizzazione delle popolazioni cellulari, facilitando lo studio di una proteina o di un altro componente di interesse durante il ciclo cellulare.

Nel secondo metodo, un arresto mitotico viene effettuato tramite deplezione di Cdc20 utilizzando un sistema di degron inducibile dall'auxina (AID)18. Nelle cellule che esprimono TIR1 (una proteina F-box di origine vegetale), qualsiasi proteina con un tag AID sarà ubiquitinata e degradata con l'aggiunta di auxina. Qui, utilizziamo un Cdc20 marcato con AID per consentire la degradazione inducibile di Cdc20, causando così un arresto in metafase. Questa popolazione cellulare viene quindi monitorata per il reclutamento del componente SAC marcato Bub1-GFP nei cinetocori, utilizzando la proteina cinetocore marcata Mtw1-mCherry come marcatore fiduciale. Sebbene Bub1 svolga un ruolo indipendente dal SAC nei cinetocori e si localizzi nei cinetocori nelle prime mitosi, la sua persistente localizzazione dei cinetocori nelle cellule arrestate segnala attacchi impropri cinetocore-microtubuli19. Lo abbiamo dimostrato trattando le cellule con il veleno dei microtubuli, il nocodazolo, che interrompe gli attacchi cinetocoro-microtubuli. Questo esperimento evidenzia come i processi specifici di una fase distinta del ciclo cellulare possano essere studiati utilizzando metodi di arresto altamente sintonizzabili. Dimostriamo inoltre che l'auxina può essere lavata via dalle colture di cdc20-AID, consentendo il rilascio in anafase e l'ingresso in un nuovo ciclo cellulare, anche se nella nostra esperienza, queste colture non rilasciano in modo sincrono come un arresto-rilascio a α fattori. Questi due metodi di arresto-rilascio sono entrambi efficaci e facili da implementare, ma molti altri metodi sono disponibili per i ricercatori nel lievito per arrestare le cellule in diversi stadi del ciclo cellulare 20,21,22,23. Ulteriori dettagli su questi metodi possono essere trovati nella Discussione.

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Protocollo

1. Costruzione di ceppi per l'analisi del ciclo cellulare e l'imaging

  1. Progettare primer per marcare C-terminale il gene di interesse utilizzando i plasmidi di marcatura Pringle (plasmidi pFA6a)24. In breve, progettare primer F2 e R1 che, se utilizzati con un plasmide della serie pFA6a, producono un prodotto PCR che può essere trasformato direttamente in lievito per generare una versione "marcata" del gene di interesse. Utilizzare le coppie di primer e i plasmidi contenuti nella Tabella 1 per marcare i geni di interesse in questo protocollo. Le strategie di progettazione di plasmidi e primer per il marcaging C-terminale di geni di lievito sono descritte in dettaglio da Longtine et al.24.
    NOTA: Questo metodo può essere utilizzato per produrre proteine marcate in fluorescenza per l'imaging o proteine marcate con Auxin Inducible Degron (AID) per facilitare l'arresto del ciclo cellulare e altri esperimenti abilitati dalla degradazione di una proteina bersaglio18. Ad esempio, per marcare CDC20 con il tag AID (IAA7), il primer di marcatura diretta è costituito da 25-40 basi del gene CDC20 immediatamente prima del codone di stop, escludendo il codone STOP (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG 3'), e anche la sequenza adattatrice Pringle Plasmid F2 (5' cggatccccgggttaattaa 3') aggiunta all'estremità 3' per produrre la sequenza finale del primer (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3'). Il primer per la marcatura inversa CDC20 contiene il complemento inverso delle 25-40 coppie di basi immediatamente dopo il codone STOP (5' ATTATATGCCTTGACATGAA
    CTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTA 3') e la sequenza adattatrice R1 del plasmide di Pringle (5' gaattcgagctcgtttaaac 3') per produrre la sequenza finale del primer (5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTATTT
    TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'). È anche importante notare che l'uso di primer PCR più corti di 40 paia di basi ridurrà l'efficienza dell'integrazione nel genoma del lievito.
  2. Diluire i primer in acqua di biologia molecolare a 10 μM.
  3. Eseguire la PCR con la coppia di plasmidi F2 e R1 e il plasmide di marcatura appropriato utilizzando metodi standard, seguendo il programma del termociclatore contenuto nella Tabella 2, quindi confermare la dimensione del prodotto PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio.
  4. Inoculare il ceppo di lievito per trasformarlo in 25 ml di coltura di estratto di lievito Peptone Adenina Destrosio (YPAD) e crescere per una notte a 23 °C. Per la costruzione del lievito cdc20-AID (che degraderà Cdc20 dopo il trattamento con auxina), il ceppo trasformato può contenere già OsTIR1 espresso da un locus ectopico, oppure OsTIR1 può essere incrociato in un successivo18.
  5. La mattina seguente, controlla l'OD600 della coltura notturna. Se la coltura OD <2.0, procedere al passaggio 1.6. Se OD > 2,0, diluire a ~0,2-0,4 e consentire 2-3 cicli di crescita.
  6. Raccogliere le cellule a OD600 = ~0,4-2,0 per assicurarsi che siano in fase di crescita logaritmica. Raccogli 5 OD di cellule per trasformazione (ad esempio, 5 mL di OD600 = 1,0). Se si esegue più di una trasformazione dello stesso ceppo, le cellule possono essere combinate in questa fase. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3.000 x g per 5 minuti a 23 °C.
  7. Scartare il surnatante e lavare il pellet cellulare con 25 mL di acqua, quindi centrifugare a 3.000 x g per 5 minuti a 23 °C.
  8. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di acetato di litio (LiAc) 0,1 M e trasferirle in una o più provette da 1,6 mL. Se si esegue più di una trasformazione, dividere la risospensione da 1 mL in più provette (ad esempio, per 2 trasformazioni dividere 2x 500 μL; per 3 trasformazioni dividere 3x 333 μL, ecc.).
  9. Centrifugare le celle a 1.000 x g per 2 minuti a 23 °C e scartare il surnatante.
  10. Aggiungere quanto segue al pellet cellulare (in questo ordine): i) 240 μL di PEG (50%), ii) 36 μL di 1,0 M LiAc, iii) 20 μL = 50 μg di DNA spermatico di salmone pre-bollito per 5 minuti, iv) 54 μL di acqua.
  11. Aggiungere 10 μL di prodotto PCR (ottenuto nella fase 1.3) alle cellule e agitare per 1 minuto, assicurandosi che tutto sia ben miscelato.
  12. Incubare le cellule a 30 °C per 30 minuti in un tamburo a rulli in una stanza calda o in un thermoshaker a 1000 giri/min.
  13. Celle di shock termico a 42 °C per 15 minuti a bagnomaria.
    NOTA: Il tempo ottimale per lo shock termico potrebbe variare a seconda del ceppo di lievito di fondo. Questo protocollo è ottimizzato per il background del ceppo W303.
  14. Centrifugare le celle a 1.000 x g per 2 minuti a 23 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente in 100 μL di acqua.
  15. Per le trasformazioni con KanMX o la selezione di altri farmaci, piastrate le cellule su YPAD e incubate le piastre a 23 °C, quindi replicate la piastra su piastra del farmaco il giorno successivo.
    NOTA: Consentire un giorno di crescita su YPAD è fondamentale per consentire l'espressione dei geni di resistenza ai farmaci nelle cellule trasformate.
  16. Per trasformazioni che utilizzano marcatori auxotrofici (URA, HIS, ecc.), piastre le cellule direttamente su terreno selettivo.
  17. Incubare le piastre a 23 °C per 3 giorni per consentire la crescita delle colonie di lievito trasformante.
  18. Verificare il corretto tagging del gene mediante PCR genomica o western blotting. Questi metodi sono descritti in dettaglio da Burnette25 e Chu et al26.
    NOTA: Per la produzione di ceppi con alleli marcati multipli, la trasformazione ripetuta non è raccomandata senza reincrocio, poiché la trasformazione può essere un processo mutageno. Per produrre il ceppo contenente Stu2-GFP e Spc110-mCherry, ad esempio, si consiglia di trasformare i ceppi separatamente per produrre Stu2-GFP e Spc110-mCherry, quindi combinare questi alleli in un unico ceppo aploide mediante incrocio di lievito, sporulazione, dissezione tetrade e analisi genotipica. Ulteriori informazioni sugli incroci di lievito sono disponibili da Stansfield e Stark27 e Morin et al.28. Per eseguire un arresto-rilascio a α fattori, il ceppo aploide utilizzato deve essere MATa.

2. Coltura di lieviti e sincronizzazione del ciclo cellulare: arresto-rilascio a α fattori

  1. Inoculare il lievito in 25 mL di coltura YPAD per una notte a 23 °C, con una dose di OD600 = 0,5-2,0 la mattina successiva.
    1. Se le cellule sono superiori a OD600 = 2,0 al mattino, diluirle nuovamente a OD600 = 0,2-0,4 e lasciarle crescere per almeno 1 ciclo cellulare (2-3 ore a 23 °C).
  2. Diluire nuovamente le cellule a OD600 = 0,5 e aggiungere il fattore α a una concentrazione finale di 1 μg/mL (stock 10 mg/mL in DMSO). Le cellule idealmente dovrebbero avere una mutazione bar1 (ad esempio bar1-1), che le rende più sensibili al fattore α. Le cellule wild type BAR1 sono meno sensibili al fattore α e richiedono una concentrazione di fattore α che è almeno un ordine di grandezza superiore per arrestarsi correttamente, il che è meno economico.
  3. A 2,5-3,5 ore dopo l'arresto, controllare il grado di arresto contando la percentuale di cellule non gemmate in scamo. Quando il 90-95% delle cellule viene colpito (arrestato in G1), si procede al rilascio. I tempi variano a seconda del ceppo di lievito, del mezzo di crescita e della temperatura.
  4. Rilasciare le cellule dall'arresto del fattore α centrifugando in centrifuga a 3.000 x g per 3-5 minuti a 23 °C, quindi versando il surnatante.
  5. Lavare le celle risospendendo il pellet in 25 mL di YPAD + 1% DMSO.
  6. Ripetere i passaggi 2.4-2.5 due volte per un totale di tre lavaggi, cambiando il tubo usato una volta dopo il primo lavaggio.
  7. Aggiungere YPAD alle cellule per portare il volume finale a 25 mL e trasferire le cellule in un nuovo pallone.
    NOTA: L'uso di un nuovo pallone è fondamentale per eliminare le tracce di fattore α rimasto che potrebbero impedirne il rilascio.
  8. Prelevare il campione del punto temporale (0 min) e fissarlo (vedere le istruzioni di fissazione nei passaggi da 4.1 a 4.4).
  9. Continuare a prelevare campioni di punti temporali ogni 15 minuti se la crescita avviene a 23 °C. Questa tempistica cambierà ad altre temperature in base alla velocità di crescita delle cellule.
  10. Al momento 60 minuti, giudicate la sincronia del rilascio controllando al microscopio ottico che le piccole gemme siano uniformi (dimensioni delle gemme < 25% delle dimensioni delle cellule madri).
  11. Facoltativo) A 60 minuti dal rilascio, aggiungere nuovamente il fattore α a una concentrazione finale di 1 μg/mL per prevenire la progressione nel ciclo cellulare successivo. Confermare il rilascio sincrono delle cellule verificando la morfologia uniforme delle piccole gemme prima dell'aggiunta.
  12. Continuare a prelevare campioni di punti temporali fino a 180 minuti o per il tempo desiderato. A 23 °C, la metafase si verifica ~45-60 minuti dopo il rilascio, l'anafase si verifica ~60-90 minuti dopo il rilascio e la maggior parte delle cellule sarà nel nuovo G1 entro 120 minuti dopo il rilascio.

3. Coltura di lievito e sincronizzazione del ciclo cellulare: arresto-rilascio di deplezione di Cdc20

  1. Inoculare una coltura notturna di lievito a 23 °C per ottenere un OD600 = 0,5-2,0 la mattina successiva.
    1. Se la mattina successiva le cellule sono superiori a OD600 = 2,0, diluirle nuovamente a OD600 = 0,2-0,4 e lasciarle crescere per almeno 1 ciclo cellulare (2-3 ore a 23 °C).
  2. Diluire nuovamente a OD600 = 0,5 e aggiungere auxina a una concentrazione finale di 500 μM da 1 M di stock (500x) a tutte le colture. Per le colture che ricevono altri farmaci (nocodazolo), aggiungerli in concomitanza con auxina alla concentrazione appropriata (ad esempio, ~10 μg/mL di nocodazolo).
  3. A 2 ore dall'arresto, controllare il grado di arresto contando la percentuale di cellule a gemma grande (la gemma grande è determinata come la presenza di gemme > 25% della dimensione della cellula madre). Quando il 90-95% delle cellule viene arrestato in mitosi, procedere alla raccolta dei campioni o al rilascio delle cellule dall'arresto, a seconda dell'applicazione sperimentale. Se il 90% delle cellule non viene arrestato, lasciare che la coltura continui a crescere e controllarla ogni 15-30 minuti. I tempi variano a seconda del ceppo di lievito, del mezzo di crescita e della temperatura.
    NOTA: Non è consigliabile lasciare che gli arresti procedano troppo a lungo (più di 4 ore) in caso di rilascio, poiché gli arresti prolungati possono ridurre la vitalità cellulare.
  4. Per il rilascio dall'arresto per deplezione di Cdc20, raccogliere la coltura mediante centrifugazione a 3000 x g per 3-5 minuti a 23 °C.
  5. Lavare le celle risospendendo il pellet in 25 mL di YPAD + 1% DMSO, quindi raccogliere per centrifugazione a 3.000 x g per 3-5 min a 23 °C.
  6. Ripetere i passaggi 3.4-3.5 per un totale di 2 lavaggi.
  7. Aggiungere YPAD alle cellule per portare il volume finale a 25 mL e trasferire le cellule in un nuovo matrasso.
    NOTA: L'uso di un nuovo pallone è fondamentale per rimuovere tracce di auxina che potrebbero impedirne il rilascio.
  8. Prendi il punto temporale 0 e correggi (vedi le istruzioni di fissazione nei passaggi da 4.1 a 4.4).
  9. Continua a prendere punti temporali ogni 10-15 minuti per la durata desiderata del corso temporale. A 23 °C, la maggior parte delle cellule si sarebbe liberata dall'arresto dopo 50-70 minuti.
    NOTA: Le cellule non si rilasciano in modo sincrono da questo arresto per deplezione di Cdc20 come fanno con l'arresto a α fattori. Tuttavia, può essere utile studiare l'anafase o gli eventi di uscita mitotica. Inoltre, una limitazione tecnica di questo arresto-rilascio è che nei punti temporali successivi al rilascio, è più difficile distinguere tra le cellule di metafase che non sono ancora state rilasciate e le cellule che hanno rilasciato prima e hanno raggiunto la metafase del loro ciclo cellulare successivo. Se necessario, questo può essere superato eseguendo l'imaging di cellule vive per tracciare le singole cellule mentre si liberano dall'arresto o aggiungendo un fattore α alla coltura (supponendo che le cellule siano MATa) per arrestare le cellule in G1 dopo l'uscita mitotica.

4. Fissazione del lievito

  1. Centrifugare 1 mL (o 0,5-1,5 OD) di coltura per 1 minuto alla massima velocità (~20.000 x g) a 23 °C.
  2. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 500 μL di soluzione fissativa (3,7% di formaldeide in 0,1 M di fosfato di potassio (KPi) pH 6,4).
  3. Incubare le cellule nella soluzione fissativa per 2-15 minuti a
    23 °C. Per gli esperimenti con andamento temporale, è generalmente consigliabile fissare le celle per 15 minuti per allineare i tempi di centrifugazione delle celle durante il prelievo dei campioni.
    NOTA: I tempi di fissazione devono essere ottimizzati per specifici fluorofori e proteine di interesse.
  4. Centrifugare le celle per 1 minuto alla massima velocità a 23 °C, aspirare il surnatante e risospendere in 500 μl di 0,1 M KPi (pH 6,4). Le celle in KPi possono essere conservate a 4 °C fino al momento dell'imaging.
    NOTA: Il segnale di fluorescenza cellulare fisso può durare fino a 2 settimane, a seconda del fluoroforo, tuttavia, per la quantificazione dei segnali fluorescenti, raccogliere le immagini entro 7 giorni.

5. Preparazione dei vetrini per l'imaging

  1. Una volta preparate per l'imaging, centrifugare le celle per 1 minuto alla massima velocità a 23 °C ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 10-100 μL di soluzione di Triton/DAPI/sorbitolo (1,2 M di sorbitolo, 1% di tritone, 0,1 M di KPi, pH 7,5, 2 μg/mL di DAPI).
  2. Pipettare ~0,8 μL di cellule direttamente su un vetrino coprioggetti pulito. Utilizzare la punta di una pipetta per distribuire delicatamente la gocciolina cellulare in un cerchio di circa 1 cm2 al centro del vetrino coprioggetti.
  3. Posizionare il vetrino coprioggetti su un vetrino per microscopia. Utilizzare un Kimwipe per premere delicatamente intorno al vetrino per distribuire il campione.
  4. Sigillare i bordi del vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie.
  5. Facoltativamente, conservare in un luogo fresco e buio per un massimo di 4-6 ore prima dell'imaging per aiutare le cellule a stabilizzarsi e prevenire movimenti eccessivi.

6. Imaging

  1. Portare il vetrino su un microscopio dotato di un obiettivo a olio 60x/1,42 e di un set di filtri laser e rosso rosso, verde, blu, rosso lontano. È possibile utilizzare anche obiettivi con ingrandimento più elevato (fino a 100x).
  2. Focalizzare il microscopio sulle cellule di lievito aderenti al vetrino coprioggetti.
    NOTA: Se le cellule di lievito si muovono troppo, i vetrini possono essere lasciati in un luogo fresco e buio per 20-60 minuti a depositarsi.
  3. Una volta che il lievito è a fuoco, regolare le impostazioni di esposizione di ciascun canale per produrre un rapporto segnale/rumore di almeno 3:1, assicurandosi che i punti fluorescenti non siano sovraesposti.
    NOTA: Ad esempio, su un sistema di imaging che utilizziamo con una fotocamera CMOS scientifica, l'utilizzo di un obiettivo 60x 550 e di un olio da immersione con un indice di rifrazione di n = 1,516, l'impostazione del segnale massimo del canale rosso su 1000-2000 UA, il canale verde su 3000 UA, il canale blu su 3000 UA e il canale DIC su 4000-5000 UA produce immagini di alta qualità.
  4. Regolare le impostazioni di acquisizione per prendere 14-20 Z-stack da 0,2 μm per un totale di 2-4 μm.
  5. Per i microscopi dotati di moduli di post-elaborazione, selezionare Deconvoluzione e Proiezione rapida per ogni stack.
  6. Raccogli pile Z di celle, scattando immagini sufficienti per catturare ~100-200 celle per ogni condizione o punto temporale.
  7. Fare riferimento al File supplementare 1 per le istruzioni del software con schermate del software di imaging.

7. Analisi delle immagini

  1. Aprire le immagini proiettate in ImageJ e regolare la luminosità e il contrasto per visualizzare i diversi canali. Se il microscopio utilizzato per l'imaging non dispone di moduli di post-elaborazione, eseguire la proiezione massima degli Z-stack in questa fase.
  2. Per determinare la progressione del ciclo cellulare, contare 100 cellule per punto temporale e classificarle come contenenti uno o due nuclei. In alternativa, calcolare la lunghezza del fuso o la distanza tra i corpi dei poli del fuso per definire lo stato del ciclo cellulare. La distanza tra i focolai di Spc110 < 1,5 μm corrisponde alle celle di metafase e la distanza > 1,5 μm corrisponde alle celle di anafase.
  3. Per calcolare le intensità dei puncta proteici (ad esempio, Stu2-GFP), utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per disegnare intorno al confine del segnale di interesse. Aggiungi questo segnale al gestore ROI (Region of Interest) premendo T o utilizzando il Menu. In Gestione ROI , seleziona Misura per calcolare l'intensità di ogni punto selezionato. Per visualizzare le variazioni del segnale puncta nel tempo, tracciare l'intensità media con un intervallo di confidenza del 95% su un grafico a linee per ogni punto temporale.
  4. Per calcolare la percentuale di celle con punti Bub1-GFP, assicurarsi che le impostazioni di luminosità minima e massima del canale verde siano le stesse per le diverse immagini. Le cellule con un puncta Bub1-GFP che mostra sovrapposizione con un puncta Mtw1-mCherry sono contate come Bub1 localizzato al cinetocoro; In caso contrario, la cella viene conteggiata come negativa. Conta ~100 celle per condizione. Aravamudhan et al.29 contiene ulteriori informazioni sulla localizzazione di Bub1 nei cinetocore.
  5. Per calcolare la percentuale di cellule mononucleate a gemma grande, contare il numero di cellule con una gemma grande e un nucleo (un segnale DAPI) nella popolazione e dividere per il numero totale di cellule.
  6. Fare riferimento al file supplementare 1 per le istruzioni del software con schermate del software di imaging.

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Risultati

L'analisi dei cambiamenti nella localizzazione delle proteine dipendente dal ciclo cellulare mediante microscopia a fluorescenza può essere facilmente realizzata utilizzando i metodi che descriviamo qui. Il nostro gruppo è da tempo interessato alla regolazione dinamica e alla funzione del fuso mitotico. Nel lievito, i corpi dei poli del fuso (contrassegnati dal componente Spc110) funzionano come centri organizzativi dei microtubuli da cui emanano i filame...

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Discussione

L'utilizzo della sincronizzazione del ciclo cellulare nel lievito in gemmazione consente di studiare meccanismi importanti per una varietà di processi cellulari. L'uso di rilasci di arresto G1 con il trattamento a fattore α consente la progressione sincrona di una popolazione di cellule attraverso le fasi del ciclo cellulare e, come abbiamo dimostrato, può rivelare modelli di localizzazione dinamica di regolatori cellulari come Stu236. Gli arresti del ciclo cellul...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo l'Università dello Utah Cell Imaging Core per aver mantenuto la struttura del microscopio Delta Vision. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni NIH F31CA2717405 (a M.G.S) e T32GM141848 (a M.G.S. e T.C.S.), 5 For the Fight (a M.P.M.), Pew Biomedical Scholars (a M.P.M.) e NIH grant R35GM142749 (a M.P.M.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
?-fattoreStruttura di Sintesi Core dell'Università dello UtahSequenza: WHWLQLKPGQPMY
Tubi Eppendorf da 1,5 mLAssigenoMCT-175-C
Mix dNTP 10mMThermo ScientificR0193
Tubi conici da 50 mLGreiner Bio-One227 261
5x buffer di reazione Phusion HFNew England BioLabsB0518S
Acido acetico, glacialeFisher ChemicalBP2401C-212
Sale di emisolfato di adeninaSigma-AldrichA9126-100G
Agar, granulatoApex Chemicals e Reagenti20-275
agarosioProdotti di Apex Bioresearch20-102GP
Sterilizzatore a vapore Autoclave Amsco CenturySterisSV-1262
Acqua DI autoclaviata
AuxinaSigma-AldrichCat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Cargille Laser LiquidLaboratori Cargille20130
D-SorbitoloSigma-AldrichS1876-500G
DAPI (40,6-Diamidino-2-Fenilindolo, Diidrocloruro)Sonde molecolariCat#D1306
Sale di sodio acido desossiribonucleico dai testicoli del salmoneSigma-AldrichD1626
DestrosioFisher ChemicalD16-10
Tetraacetato di etilenediamina disodicoFisher ChemicalS811-10
DMSOThermo Scientific20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Miscelatore a vortice a velocità fissaVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Microscopio fluorescente DV UltraLeicahttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwESerial #: NV01063. Non più supportato
FormaldeideFisher ChemicalCat#F79-500
Apparecchiatura gelThermo ScientificOwl EasyCast B1
GeneRuler DNA Ladder MixFermentasSM0333
Perline di vetroFisher Scientific11312A
Vetri in vetroVWR48300-026
Innova 2300 Platform ShakerNew BrunswickNB-2300
KimwipesKimtech06-666
Centrifuga di laboratorio per tubi da 1,5 mLEppendorf2525
Centrifuga da laboratorio per tubi da 50 mLEppendorf5804
Diidrato di acetato di litioSigma-AldrichL4158-250G
Master ciclista Nexus X2eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Micro-pipette p2, p20, p200 e p1000 con le corrispondenti punteRaininL-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Vetro di copertura per microscopioFisher Scientific12541014
NocodazoloCalbiochimicaCat#487928; CAS: 31430-18-9; Lot#B35705
Arancione GSigma-AldrichO7252
PIOLORicerca HamptonHR2-591
Peptone granulata Bioreagenti FisherBP9725-5
Phusion HF DNA polimerasiNew England BioLabsM0530L
Pipet-XRaininPX-100R
Fosfato di potassio, dibasicoThermo Scientific424195000
Fosfato di potassio, monobasicoThermo Scientific424200025
Fonte di alimentazioneBio-Rad23786
Inizia ad acquisire Ultra 1.2.2softWoRx CytivaOttieni con DV Ultra
Tris BaseBioreagenti FisherBP152-10
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
Rotatore a tuboVWR10136-084
Bagno d'acquaVWRWBE10A11B
Acqua, Ultra PuraProdotti di Apex Bioresearch18-194
Estratto di lievito granulatoBioreagenti FisherBP9727-5

Riferimenti

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