Method Article

Manipolazione e analisi dei processi dipendenti dal ciclo cellulare nel lievito in gemmazione

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive in dettaglio due metodi di arresto del ciclo cellulare di lievito e rilascio opzionale, ed elabora l'uso della microscopia a fluorescenza per studiare i processi dipendenti dal ciclo cellulare in S. cerevisiae.

Abstract

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Le cellule eucariotiche seguono un ciclo cellulare conservato che regola diversi processi, tra cui il mantenimento del DNA e l'omeostasi degli organelli. Lo studio dei processi cellulari in modo dipendente dal ciclo cellulare è spesso necessario per interpretare correttamente i risultati sperimentali. Sono disponibili metodi chimici e genetici per produrre la sincronizzazione del ciclo cellulare in cellule coltivate in un'ampia gamma di organismi, compresi i modelli di vertebrati, consentendo lo studio dei processi dipendenti dal ciclo cellulare. Tuttavia, tra gli organismi modello, il lievito in gemmazione rimane una centrale elettrica per l'analisi del ciclo cellulare grazie ai suoi metodi di sincronizzazione particolarmente robusti, al breve tempo di generazione e alla trattabilità genetica. Il lievito condivide il meccanismo principale del ciclo cellulare con altri eucarioti, il che ha permesso scoperte fondamentali nella regolazione del ciclo cellulare. Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi per l'analisi del ciclo cellulare nel lievito, concentrandosi sugli esperimenti di arresto-rilascio G1 e arresto-rilascio mitotico, tra cui la costruzione del ceppo, la preparazione della coltura e la microscopia. Vengono presentati i metodi di marcatura PCR per la produzione di ceppi adatti per l'arresto del ciclo cellulare e la microscopia a fluorescenza. Un arresto G1 si ottiene utilizzando il feromone peptidico α-fattore e brevi lavaggi provocano un rilascio sincrono e una progressione del ciclo cellulare. I campioni vengono prelevati in diversi momenti dopo il rilascio nel ciclo cellulare e fissati per la microscopia. Un secondo metodo arresta le cellule di lievito in mitosi esaurendo il regolatore del ciclo cellulare Cdc20 per ottenere una popolazione arrestata in metafase, nonché il rilascio opzionale in anafase. I campioni vengono fissati e preparati per l'imaging prima e dopo il rilascio, e vengono ripresi e analizzati. L'analisi delle immagini si concentra sulla catalogazione della localizzazione dinamica e sui cambiamenti di abbondanza della popolazione delle proteine nel ciclo cellulare. Questi metodi di sincronizzazione sono adatti per diverse manipolazioni del ciclo cellulare e, sebbene il loro utilizzo nell'imaging di cellule fisse sia qui evidenziato, possono essere adattati per molte altre analisi, tra cui l'imaging di cellule vive e saggi biochimici e molecolari.

Introduction

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La divisione cellulare eucariotica è altamente regolata attraverso un programma chiamato ciclo cellulare. I processi altamente conservati e dinamici che si verificano nel ciclo cellulare lo rendono interessante da studiare in sé e per sé, ma hanno anche implicazioni diffuse che informano le indagini su altri processi biologici cellulari: ad esempio, molti organelli subiscono un drammatico rimodellamento durante la divisione cellulare e l'abbondanza e la localizzazione di molte proteine è altamente regolata in tutto l'1,2,3. Sebbene ci siano a....

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Protocol

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1. Costruzione di ceppi per l'analisi del ciclo cellulare e l'imaging

  1. Progettare primer per marcare C-terminale il gene di interesse utilizzando i plasmidi di marcatura Pringle (plasmidi pFA6a)24. In breve, progettare primer F2 e R1 che, se utilizzati con un plasmide della serie pFA6a, producono un prodotto PCR che può essere trasformato direttamente in lievito per generare una versione "marcata" del gene di interesse. Utilizzare le coppie di primer e i plasmidi contenuti nella Tabella 1 per marcare i geni di interesse in questo protocollo. Le strategie di progettazione di plasmidi ....

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Results

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L'analisi dei cambiamenti nella localizzazione delle proteine dipendente dal ciclo cellulare mediante microscopia a fluorescenza può essere facilmente realizzata utilizzando i metodi che descriviamo qui. Il nostro gruppo è da tempo interessato alla regolazione dinamica e alla funzione del fuso mitotico. Nel lievito, i corpi dei poli del fuso (contrassegnati dal componente Spc110) funzionano come centri organizzativi dei microtubuli da cui emanano i filame.......

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Discussion

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L'utilizzo della sincronizzazione del ciclo cellulare nel lievito in gemmazione consente di studiare meccanismi importanti per una varietà di processi cellulari. L'uso di rilasci di arresto G1 con il trattamento a fattore α consente la progressione sincrona di una popolazione di cellule attraverso le fasi del ciclo cellulare e, come abbiamo dimostrato, può rivelare modelli di localizzazione dinamica di regolatori cellulari come Stu236. Gli arresti del ciclo cellul.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

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Ringraziamo l'Università dello Utah Cell Imaging Core per aver mantenuto la struttura del microscopio Delta Vision. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni NIH F31CA2717405 (a M.G.S) e T32GM141848 (a M.G.S. e T.C.S.), 5 For the Fight (a M.P.M.), Pew Biomedical Scholars (a M.P.M.) e NIH grant R35GM142749 (a M.P.M.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
?-fattoreStruttura di Sintesi Core dell'Università dello UtahSequenza: WHWLQLKPGQPMY
Tubi Eppendorf da 1,5 mLAssigenoMCT-175-C
Mix dNTP 10mMThermo ScientificR0193
Tubi conici da 50 mLGreiner Bio-One227 261
5x buffer di reazione Phusion HFNew England BioLabsB0518S
Acido acetico, glacialeFisher ChemicalBP2401C-212
Sale di emisolfato di adeninaSigma-AldrichA9126-100G
Agar, granulatoApex Chemicals e Reagenti20-275
agarosioProdotti di Apex Bioresearch20-102GP
Sterilizzatore a vapore Autoclave Amsco CenturySterisSV-1262
Acqua DI autoclaviata
AuxinaSigma-AldrichCat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Cargille Laser LiquidLaboratori Cargille20130
D-SorbitoloSigma-AldrichS1876-500G
DAPI (40,6-Diamidino-2-Fenilindolo, Diidrocloruro)Sonde molecolariCat#D1306
Sale di sodio acido desossiribonucleico dai testicoli del salmoneSigma-AldrichD1626
DestrosioFisher ChemicalD16-10
Tetraacetato di etilenediamina disodicoFisher ChemicalS811-10
DMSOThermo Scientific20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Miscelatore a vortice a velocità fissaVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Microscopio fluorescente DV UltraLeicahttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwESerial #: NV01063. Non più supportato
FormaldeideFisher ChemicalCat#F79-500
Apparecchiatura gelThermo ScientificOwl EasyCast B1
GeneRuler DNA Ladder MixFermentasSM0333
Perline di vetroFisher Scientific11312A
Vetri in vetroVWR48300-026
Innova 2300 Platform ShakerNew BrunswickNB-2300
KimwipesKimtech06-666
Centrifuga di laboratorio per tubi da 1,5 mLEppendorf2525
Centrifuga da laboratorio per tubi da 50 mLEppendorf5804
Diidrato di acetato di litioSigma-AldrichL4158-250G
Master ciclista Nexus X2eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Micro-pipette p2, p20, p200 e p1000 con le corrispondenti punteRaininL-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Vetro di copertura per microscopioFisher Scientific12541014
NocodazoloCalbiochimicaCat#487928; CAS: 31430-18-9; Lot#B35705
Arancione GSigma-AldrichO7252
PIOLORicerca HamptonHR2-591
Peptone granulata Bioreagenti FisherBP9725-5
Phusion HF DNA polimerasiNew England BioLabsM0530L
Pipet-XRaininPX-100R
Fosfato di potassio, dibasicoThermo Scientific424195000
Fosfato di potassio, monobasicoThermo Scientific424200025
Fonte di alimentazioneBio-Rad23786
Inizia ad acquisire Ultra 1.2.2softWoRx CytivaOttieni con DV Ultra
Tris BaseBioreagenti FisherBP152-10
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
Rotatore a tuboVWR10136-084
Bagno d'acquaVWRWBE10A11B
Acqua, Ultra PuraProdotti di Apex Bioresearch18-194
Estratto di lievito granulatoBioreagenti FisherBP9727-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carlton, J. G., Jones, H., Eggert, U. S. Membrane and organelle dynamics during cell division. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (3), 151-166 (2020).
  2. Cai, Y., et al. Experimental and computational framework for a dynamic protein atlas of human cell division. Nat....

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