Manipolazione e analisi dei processi dipendenti dal ciclo cellulare nel lievito in gemmazione

La divisione cellulare eucariotica è altamente regolata attraverso un programma chiamato ciclo cellulare. I processi altamente conservati e dinamici che si verificano nel ciclo cellulare lo rendono interessante da studiare in sé e per sé, ma hanno anche implicazioni diffuse che informano le indagini su altri processi biologici cellulari: ad esempio, molti organelli subiscono un drammatico rimodellamento durante la divisione cellulare e l'abbondanza e la localizzazione di molte proteine è altamente regolata in tutto l'1,2,3. Sebbene ci siano alcuni livelli aggiuntivi di complessità presenti nei sistemi metazoici rispetto al lievito, tra cui una maggiore varietà di chinasi regolatorie e proteine, nonché ulteriori input da segnali esterni nei metazoi, la divisione cellulare è complessivamente molto conservata in tutti gli eucarioti ^4,5. Nel lievito è stato svolto molto lavoro fondamentale per stabilire le intuizioni chiave sulla progressione del ciclo cellulare e sui passaggi regolatori cruciali, che rimane un organismo estremamente attraente per lo studio di questioni relative al ciclo cellulare per una moltitudine di motivi ^6,7. Il principale tra questi è l'ampia gamma di metodi disponibili per manipolare il ciclo cellulare, consentendo l'arresto in varie fasi e la sincronizzazione delle cellule. Ulteriori vantaggi includono il breve ciclo cellulare del lievito (~90-150 minuti a seconda della temperatura e delle condizioni del terreno), la facilità della manipolazione genetica e l'ampia gamma di alleli condizionali che consentono lo studio in un contesto altrimenti wild-type.

La progressione attraverso le diverse fasi del ciclo cellulare è guidata dall'attività di diverse chinasi chiave, tra cui l'onnipresente chinasi ciclina-dipendente (Cdk), la chinasi Polo-like e l'Aurora chinasi. I checkpoint del ciclo cellulare regolano la progressione attraverso il ciclo cellulare, assicurando che le cellule non progrediscano nella fase successiva della divisione a meno che non siano soddisfatte condizioni specifiche ^8,9. Questi checkpoint, e le transizioni che regolano, possono essere dirottati dai ricercatori per ottenere un arresto a lungo termine, o un arresto e un rilascio transitori per sincronizzare una popolazione di cellule (Figura 1). Ad esempio, il checkpoint di impegno del ciclo cellulare (punto di restrizione o inizio nel lievito) assicura che la cellula abbia abbastanza nutrienti per impegnarsi nella divisione prima di iniziare la replicazione del DNA¹⁰. Questo checkpoint può essere manipolato nel lievito aploide per ottenere un arresto G1, sfruttando il programma di accoppiamento del lievito che interagisce con il ciclo cellulare. Nel lievito di birra (Saccharomyces cerevisiae), le cellule aploidi hanno uno dei due tipi di accoppiamento, MATa o MATα, che è geneticamente determinato da un locus di tipo di accoppiamento. I lieviti di un tipo di accoppiamento sono sensibili al feromone di accoppiamento dell'altro tipo di accoppiamento e rispondono attivando una cascata di segnalazione della MAP chinasi che alla fine fosforila e stabilizza l'inibitore di Cdk Far1, che impedisce l'ingresso nel ciclo cellulare legandosi al complesso Cln1/2-Cdk e bloccandone l'attività 11,12,13. Le cellule che rispondono ai feromoni di accoppiamento possono essere determinate visivamente dalla presenza di una proiezione di accoppiamento o shmoo (Figura 1). Pertanto, il fattore α sintetizzato chimicamente può essere aggiunto a colture di cellule MATa per ottenere un arresto G1. Un'altra transizione del ciclo cellulare che i ricercatori possono prendere di mira per sincronizzare le cellule di lievito è la transizione da metafase ad anafase. Durante la mitosi, il Spindle Assembly Checkpoint (SAC) monitora l'attaccamento dei cinetocori ai microtubuli e inibisce il complesso/ciclosoma promotore l'anafase (APC/C) sequestrando il suo attivatore, Cdc20, quando vengono rilevati cinetocori non attaccati. L'APC/C è un complesso ligasi E3 essenziale per l'ingresso in anafase. Quando il SAC è soddisfatto, Cdc20 lega l'APC/C e l'APC/C ubiquitina diverse proteine, principalmente la securina e la ciclina B, che le bersaglia per la degradazione, e promuove la segregazione cromosomica e l'uscita mitotica^14,15. Sebbene Cdc20 in sé non sia un componente del SAC, la sua inibizione è l'obiettivo dell'attivazione del SAC; pertanto, la deplezione inducibile di Cdc20 può essere sfruttata per arrestare una coltura di lievito in metafase (Figura 1)¹⁶.

Questo protocollo comprende due metodi di manipolazione del ciclo cellulare del lievito, nonché un esempio di applicazione di ciascun metodo. Nel primo, il fattore α viene utilizzato per arrestare le cellule in G1, seguito da una fase di lavaggio per rilasciare le cellule dall'arresto, con conseguente rientro sincrono del ciclo cellulare. Le cellule sincronizzate continueranno per l'intero ciclo cellulare, consentendo ai ricercatori di tracciare e studiare le cellule in ogni fase del ciclo cellulare. In questo metodo, la localizzazione dinamica di una proteina di interesse marcata con GFP, Stu2, viene monitorata per tutto il tempo e viene tracciata la sua associazione con il fuso mitotico. Questo metodo sfrutta anche un componente del corpo dell'asta del mandrino (SPB) etichettato, Spc110-mCherry, che consente di misurare la lunghezza del fuso mitotico ed è un eccellente proxy per la progressione del ciclo cellulare¹⁷. Questo metodo dimostra come l'arresto e il rilascio del ciclo cellulare consentano la sincronizzazione delle popolazioni cellulari, facilitando lo studio di una proteina o di un altro componente di interesse durante il ciclo cellulare.

Nel secondo metodo, un arresto mitotico viene effettuato tramite deplezione di Cdc20 utilizzando un sistema di degron inducibile dall'auxina (AID)¹⁸. Nelle cellule che esprimono TIR1 (una proteina F-box di origine vegetale), qualsiasi proteina con un tag AID sarà ubiquitinata e degradata con l'aggiunta di auxina. Qui, utilizziamo un Cdc20 marcato con AID per consentire la degradazione inducibile di Cdc20, causando così un arresto in metafase. Questa popolazione cellulare viene quindi monitorata per il reclutamento del componente SAC marcato Bub1-GFP nei cinetocori, utilizzando la proteina cinetocore marcata Mtw1-mCherry come marcatore fiduciale. Sebbene Bub1 svolga un ruolo indipendente dal SAC nei cinetocori e si localizzi nei cinetocori nelle prime mitosi, la sua persistente localizzazione dei cinetocori nelle cellule arrestate segnala attacchi impropri cinetocore-microtubuli¹⁹. Lo abbiamo dimostrato trattando le cellule con il veleno dei microtubuli, il nocodazolo, che interrompe gli attacchi cinetocoro-microtubuli. Questo esperimento evidenzia come i processi specifici di una fase distinta del ciclo cellulare possano essere studiati utilizzando metodi di arresto altamente sintonizzabili. Dimostriamo inoltre che l'auxina può essere lavata via dalle colture di cdc20-AID, consentendo il rilascio in anafase e l'ingresso in un nuovo ciclo cellulare, anche se nella nostra esperienza, queste colture non rilasciano in modo sincrono come un arresto-rilascio a α fattori. Questi due metodi di arresto-rilascio sono entrambi efficaci e facili da implementare, ma molti altri metodi sono disponibili per i ricercatori nel lievito per arrestare le cellule in diversi stadi del ciclo cellulare 20,21,22,23. Ulteriori dettagli su questi metodi possono essere trovati nella Discussione.

1. Costruzione di ceppi per l'analisi del ciclo cellulare e l'imaging

1. Progettare primer per marcare C-terminale il gene di interesse utilizzando i plasmidi di marcatura Pringle (plasmidi pFA6a)²⁴. In breve, progettare primer F2 e R1 che, se utilizzati con un plasmide della serie pFA6a, producono un prodotto PCR che può essere trasformato direttamente in lievito per generare una versione "marcata" del gene di interesse. Utilizzare le coppie di primer e i plasmidi contenuti nella Tabella 1 per marcare i geni di interesse in questo protocollo. Le strategie di progettazione di plasmidi e primer per il marcaging C-terminale di geni di lievito sono descritte in dettaglio da Longtine et ^al.24.
   NOTA: Questo metodo può essere utilizzato per produrre proteine marcate in fluorescenza per l'imaging o proteine marcate con Auxin Inducible Degron (AID) per facilitare l'arresto del ciclo cellulare e altri esperimenti abilitati dalla degradazione di una proteina bersaglio¹⁸. Ad esempio, per marcare CDC20 con il tag AID (IAA7), il primer di marcatura diretta è costituito da 25-40 basi del gene CDC20 immediatamente prima del codone di stop, escludendo il codone STOP (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
   CAGCCAATATTTGATCAGG 3'), e anche la sequenza adattatrice Pringle Plasmid F2 (5' cggatccccgggttaattaa 3') aggiunta all'estremità 3' per produrre la sequenza finale del primer (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
   CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3'). Il primer per la marcatura inversa CDC20 contiene il complemento inverso delle 25-40 coppie di basi immediatamente dopo il codone STOP (5' ATTATATGCCTTGACATGAA
   CTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTA 3') e la sequenza adattatrice R1 del plasmide di Pringle (5' gaattcgagctcgtttaaac 3') per produrre la sequenza finale del primer (5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTATTT
   TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'). È anche importante notare che l'uso di primer PCR più corti di 40 paia di basi ridurrà l'efficienza dell'integrazione nel genoma del lievito.
2. Diluire i primer in acqua di biologia molecolare a 10 μM.
3. Eseguire la PCR con la coppia di plasmidi F2 e R1 e il plasmide di marcatura appropriato utilizzando metodi standard, seguendo il programma del termociclatore contenuto nella Tabella 2, quindi confermare la dimensione del prodotto PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio.
4. Inoculare il ceppo di lievito per trasformarlo in 25 ml di coltura di estratto di lievito Peptone Adenina Destrosio (YPAD) e crescere per una notte a 23 °C. Per la costruzione del lievito cdc20-AID (che degraderà Cdc20 dopo il trattamento con auxina), il ceppo trasformato può contenere già OsTIR1 espresso da un locus ectopico, oppure OsTIR1 può essere incrociato in un successivo¹⁸.
5. La mattina seguente, controlla l'OD600 della coltura notturna. Se la coltura OD <2.0, procedere al passaggio 1.6. Se OD > 2,0, diluire a ~0,2-0,4 e consentire 2-3 cicli di crescita.
6. Raccogliere le cellule a OD600 = ~0,4-2,0 per assicurarsi che siano in fase di crescita logaritmica. Raccogli 5 OD di cellule per trasformazione (ad esempio, 5 mL di OD600 = 1,0). Se si esegue più di una trasformazione dello stesso ceppo, le cellule possono essere combinate in questa fase. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3.000 x g per 5 minuti a 23 °C.
7. Scartare il surnatante e lavare il pellet cellulare con 25 mL di acqua, quindi centrifugare a 3.000 x g per 5 minuti a 23 °C.
8. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di acetato di litio (LiAc) 0,1 M e trasferirle in una o più provette da 1,6 mL. Se si esegue più di una trasformazione, dividere la risospensione da 1 mL in più provette (ad esempio, per 2 trasformazioni dividere 2x 500 μL; per 3 trasformazioni dividere 3x 333 μL, ecc.).
9. Centrifugare le celle a 1.000 x g per 2 minuti a 23 °C e scartare il surnatante.
10. Aggiungere quanto segue al pellet cellulare (in questo ordine): i) 240 μL di PEG (50%), ii) 36 μL di 1,0 M LiAc, iii) 20 μL = 50 μg di DNA spermatico di salmone pre-bollito per 5 minuti, iv) 54 μL di acqua.
11. Aggiungere 10 μL di prodotto PCR (ottenuto nella fase 1.3) alle cellule e agitare per 1 minuto, assicurandosi che tutto sia ben miscelato.
12. Incubare le cellule a 30 °C per 30 minuti in un tamburo a rulli in una stanza calda o in un thermoshaker a 1000 giri/min.
13. Celle di shock termico a 42 °C per 15 minuti a bagnomaria.
    NOTA: Il tempo ottimale per lo shock termico potrebbe variare a seconda del ceppo di lievito di fondo. Questo protocollo è ottimizzato per il background del ceppo W303.
14. Centrifugare le celle a 1.000 x g per 2 minuti a 23 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente in 100 μL di acqua.
15. Per le trasformazioni con KanMX o la selezione di altri farmaci, piastrate le cellule su YPAD e incubate le piastre a 23 °C, quindi replicate la piastra su piastra del farmaco il giorno successivo.
    NOTA: Consentire un giorno di crescita su YPAD è fondamentale per consentire l'espressione dei geni di resistenza ai farmaci nelle cellule trasformate.
16. Per trasformazioni che utilizzano marcatori auxotrofici (URA, HIS, ecc.), piastre le cellule direttamente su terreno selettivo.
17. Incubare le piastre a 23 °C per 3 giorni per consentire la crescita delle colonie di lievito trasformante.
18. Verificare il corretto tagging del gene mediante PCR genomica o western blotting. Questi metodi sono descritti in dettaglio da Burnette²⁵ e Chu et al²⁶.
    NOTA: Per la produzione di ceppi con alleli marcati multipli, la trasformazione ripetuta non è raccomandata senza reincrocio, poiché la trasformazione può essere un processo mutageno. Per produrre il ceppo contenente Stu2-GFP e Spc110-mCherry, ad esempio, si consiglia di trasformare i ceppi separatamente per produrre Stu2-GFP e Spc110-mCherry, quindi combinare questi alleli in un unico ceppo aploide mediante incrocio di lievito, sporulazione, dissezione tetrade e analisi genotipica. Ulteriori informazioni sugli incroci di lievito sono disponibili da Stansfield e Stark²⁷ e Morin et ^al.28. Per eseguire un arresto-rilascio a α fattori, il ceppo aploide utilizzato deve essere MATa.

2. Coltura di lieviti e sincronizzazione del ciclo cellulare: arresto-rilascio a α fattori

1. Inoculare il lievito in 25 mL di coltura YPAD per una notte a 23 °C, con una dose di OD600 = 0,5-2,0 la mattina successiva.
   1. Se le cellule sono superiori a OD600 = 2,0 al mattino, diluirle nuovamente a OD600 = 0,2-0,4 e lasciarle crescere per almeno 1 ciclo cellulare (2-3 ore a 23 °C).
2. Diluire nuovamente le cellule a OD600 = 0,5 e aggiungere il fattore α a una concentrazione finale di 1 μg/mL (stock 10 mg/mL in DMSO). Le cellule idealmente dovrebbero avere una mutazione bar1 (ad esempio bar1-1), che le rende più sensibili al fattore α. Le cellule wild type BAR1 sono meno sensibili al fattore α e richiedono una concentrazione di fattore α che è almeno un ordine di grandezza superiore per arrestarsi correttamente, il che è meno economico.
3. A 2,5-3,5 ore dopo l'arresto, controllare il grado di arresto contando la percentuale di cellule non gemmate in scamo. Quando il 90-95% delle cellule viene colpito (arrestato in G1), si procede al rilascio. I tempi variano a seconda del ceppo di lievito, del mezzo di crescita e della temperatura.
4. Rilasciare le cellule dall'arresto del fattore α centrifugando in centrifuga a 3.000 x g per 3-5 minuti a 23 °C, quindi versando il surnatante.
5. Lavare le celle risospendendo il pellet in 25 mL di YPAD + 1% DMSO.
6. Ripetere i passaggi 2.4-2.5 due volte per un totale di tre lavaggi, cambiando il tubo usato una volta dopo il primo lavaggio.
7. Aggiungere YPAD alle cellule per portare il volume finale a 25 mL e trasferire le cellule in un nuovo pallone.
   NOTA: L'uso di un nuovo pallone è fondamentale per eliminare le tracce di fattore α rimasto che potrebbero impedirne il rilascio.
8. Prelevare il campione del punto temporale (0 min) e fissarlo (vedere le istruzioni di fissazione nei passaggi da 4.1 a 4.4).
9. Continuare a prelevare campioni di punti temporali ogni 15 minuti se la crescita avviene a 23 °C. Questa tempistica cambierà ad altre temperature in base alla velocità di crescita delle cellule.
10. Al momento 60 minuti, giudicate la sincronia del rilascio controllando al microscopio ottico che le piccole gemme siano uniformi (dimensioni delle gemme < 25% delle dimensioni delle cellule madri).
11. Facoltativo) A 60 minuti dal rilascio, aggiungere nuovamente il fattore α a una concentrazione finale di 1 μg/mL per prevenire la progressione nel ciclo cellulare successivo. Confermare il rilascio sincrono delle cellule verificando la morfologia uniforme delle piccole gemme prima dell'aggiunta.
12. Continuare a prelevare campioni di punti temporali fino a 180 minuti o per il tempo desiderato. A 23 °C, la metafase si verifica ~45-60 minuti dopo il rilascio, l'anafase si verifica ~60-90 minuti dopo il rilascio e la maggior parte delle cellule sarà nel nuovo G1 entro 120 minuti dopo il rilascio.

3. Coltura di lievito e sincronizzazione del ciclo cellulare: arresto-rilascio di deplezione di Cdc20

1. Inoculare una coltura notturna di lievito a 23 °C per ottenere un OD600 = 0,5-2,0 la mattina successiva.
   1. Se la mattina successiva le cellule sono superiori a OD600 = 2,0, diluirle nuovamente a OD600 = 0,2-0,4 e lasciarle crescere per almeno 1 ciclo cellulare (2-3 ore a 23 °C).
2. Diluire nuovamente a OD600 = 0,5 e aggiungere auxina a una concentrazione finale di 500 μM da 1 M di stock (500x) a tutte le colture. Per le colture che ricevono altri farmaci (nocodazolo), aggiungerli in concomitanza con auxina alla concentrazione appropriata (ad esempio, ~10 μg/mL di nocodazolo).
3. A 2 ore dall'arresto, controllare il grado di arresto contando la percentuale di cellule a gemma grande (la gemma grande è determinata come la presenza di gemme > 25% della dimensione della cellula madre). Quando il 90-95% delle cellule viene arrestato in mitosi, procedere alla raccolta dei campioni o al rilascio delle cellule dall'arresto, a seconda dell'applicazione sperimentale. Se il 90% delle cellule non viene arrestato, lasciare che la coltura continui a crescere e controllarla ogni 15-30 minuti. I tempi variano a seconda del ceppo di lievito, del mezzo di crescita e della temperatura.
   NOTA: Non è consigliabile lasciare che gli arresti procedano troppo a lungo (più di 4 ore) in caso di rilascio, poiché gli arresti prolungati possono ridurre la vitalità cellulare.
4. Per il rilascio dall'arresto per deplezione di Cdc20, raccogliere la coltura mediante centrifugazione a 3000 x g per 3-5 minuti a 23 °C.
5. Lavare le celle risospendendo il pellet in 25 mL di YPAD + 1% DMSO, quindi raccogliere per centrifugazione a 3.000 x g per 3-5 min a 23 °C.
6. Ripetere i passaggi 3.4-3.5 per un totale di 2 lavaggi.
7. Aggiungere YPAD alle cellule per portare il volume finale a 25 mL e trasferire le cellule in un nuovo matrasso.
   NOTA: L'uso di un nuovo pallone è fondamentale per rimuovere tracce di auxina che potrebbero impedirne il rilascio.
8. Prendi il punto temporale 0 e correggi (vedi le istruzioni di fissazione nei passaggi da 4.1 a 4.4).
9. Continua a prendere punti temporali ogni 10-15 minuti per la durata desiderata del corso temporale. A 23 °C, la maggior parte delle cellule si sarebbe liberata dall'arresto dopo 50-70 minuti.
   NOTA: Le cellule non si rilasciano in modo sincrono da questo arresto per deplezione di Cdc20 come fanno con l'arresto a α fattori. Tuttavia, può essere utile studiare l'anafase o gli eventi di uscita mitotica. Inoltre, una limitazione tecnica di questo arresto-rilascio è che nei punti temporali successivi al rilascio, è più difficile distinguere tra le cellule di metafase che non sono ancora state rilasciate e le cellule che hanno rilasciato prima e hanno raggiunto la metafase del loro ciclo cellulare successivo. Se necessario, questo può essere superato eseguendo l'imaging di cellule vive per tracciare le singole cellule mentre si liberano dall'arresto o aggiungendo un fattore α alla coltura (supponendo che le cellule siano MATa) per arrestare le cellule in G1 dopo l'uscita mitotica.

4. Fissazione del lievito

1. Centrifugare 1 mL (o 0,5-1,5 OD) di coltura per 1 minuto alla massima velocità (~20.000 x g) a 23 °C.
2. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 500 μL di soluzione fissativa (3,7% di formaldeide in 0,1 M di fosfato di potassio (KPi) pH 6,4).
3. Incubare le cellule nella soluzione fissativa per 2-15 minuti a
   23 °C. Per gli esperimenti con andamento temporale, è generalmente consigliabile fissare le celle per 15 minuti per allineare i tempi di centrifugazione delle celle durante il prelievo dei campioni.
   NOTA: I tempi di fissazione devono essere ottimizzati per specifici fluorofori e proteine di interesse.
4. Centrifugare le celle per 1 minuto alla massima velocità a 23 °C, aspirare il surnatante e risospendere in 500 μl di 0,1 M KPi (pH 6,4). Le celle in KPi possono essere conservate a 4 °C fino al momento dell'imaging.
   NOTA: Il segnale di fluorescenza cellulare fisso può durare fino a 2 settimane, a seconda del fluoroforo, tuttavia, per la quantificazione dei segnali fluorescenti, raccogliere le immagini entro 7 giorni.

5. Preparazione dei vetrini per l'imaging

1. Una volta preparate per l'imaging, centrifugare le celle per 1 minuto alla massima velocità a 23 °C ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 10-100 μL di soluzione di Triton/DAPI/sorbitolo (1,2 M di sorbitolo, 1% di tritone, 0,1 M di KPi, pH 7,5, 2 μg/mL di DAPI).
2. Pipettare ~0,8 μL di cellule direttamente su un vetrino coprioggetti pulito. Utilizzare la punta di una pipetta per distribuire delicatamente la gocciolina cellulare in un cerchio di circa 1 cm² al centro del vetrino coprioggetti.
3. Posizionare il vetrino coprioggetti su un vetrino per microscopia. Utilizzare un Kimwipe per premere delicatamente intorno al vetrino per distribuire il campione.
4. Sigillare i bordi del vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie.
5. Facoltativamente, conservare in un luogo fresco e buio per un massimo di 4-6 ore prima dell'imaging per aiutare le cellule a stabilizzarsi e prevenire movimenti eccessivi.

6. Imaging

1. Portare il vetrino su un microscopio dotato di un obiettivo a olio 60x/1,42 e di un set di filtri laser e rosso rosso, verde, blu, rosso lontano. È possibile utilizzare anche obiettivi con ingrandimento più elevato (fino a 100x).
2. Focalizzare il microscopio sulle cellule di lievito aderenti al vetrino coprioggetti.
   NOTA: Se le cellule di lievito si muovono troppo, i vetrini possono essere lasciati in un luogo fresco e buio per 20-60 minuti a depositarsi.
3. Una volta che il lievito è a fuoco, regolare le impostazioni di esposizione di ciascun canale per produrre un rapporto segnale/rumore di almeno 3:1, assicurandosi che i punti fluorescenti non siano sovraesposti.
   NOTA: Ad esempio, su un sistema di imaging che utilizziamo con una fotocamera CMOS scientifica, l'utilizzo di un obiettivo 60x 550 e di un olio da immersione con un indice di rifrazione di n = 1,516, l'impostazione del segnale massimo del canale rosso su 1000-2000 UA, il canale verde su 3000 UA, il canale blu su 3000 UA e il canale DIC su 4000-5000 UA produce immagini di alta qualità.
4. Regolare le impostazioni di acquisizione per prendere 14-20 Z-stack da 0,2 μm per un totale di 2-4 μm.
5. Per i microscopi dotati di moduli di post-elaborazione, selezionare Deconvoluzione e Proiezione rapida per ogni stack.
6. Raccogli pile Z di celle, scattando immagini sufficienti per catturare ~100-200 celle per ogni condizione o punto temporale.
7. Fare riferimento al File supplementare 1 per le istruzioni del software con schermate del software di imaging.

7. Analisi delle immagini

1. Aprire le immagini proiettate in ImageJ e regolare la luminosità e il contrasto per visualizzare i diversi canali. Se il microscopio utilizzato per l'imaging non dispone di moduli di post-elaborazione, eseguire la proiezione massima degli Z-stack in questa fase.
2. Per determinare la progressione del ciclo cellulare, contare 100 cellule per punto temporale e classificarle come contenenti uno o due nuclei. In alternativa, calcolare la lunghezza del fuso o la distanza tra i corpi dei poli del fuso per definire lo stato del ciclo cellulare. La distanza tra i focolai di Spc110 < 1,5 μm corrisponde alle celle di metafase e la distanza > 1,5 μm corrisponde alle celle di anafase.
3. Per calcolare le intensità dei puncta proteici (ad esempio, Stu2-GFP), utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per disegnare intorno al confine del segnale di interesse. Aggiungi questo segnale al gestore ROI (Region of Interest) premendo T o utilizzando il Menu. In Gestione ROI , seleziona Misura per calcolare l'intensità di ogni punto selezionato. Per visualizzare le variazioni del segnale puncta nel tempo, tracciare l'intensità media con un intervallo di confidenza del 95% su un grafico a linee per ogni punto temporale.
4. Per calcolare la percentuale di celle con punti Bub1-GFP, assicurarsi che le impostazioni di luminosità minima e massima del canale verde siano le stesse per le diverse immagini. Le cellule con un puncta Bub1-GFP che mostra sovrapposizione con un puncta Mtw1-mCherry sono contate come Bub1 localizzato al cinetocoro; In caso contrario, la cella viene conteggiata come negativa. Conta ~100 celle per condizione. Aravamudhan et ^al.29 contiene ulteriori informazioni sulla localizzazione di Bub1 nei cinetocore.
5. Per calcolare la percentuale di cellule mononucleate a gemma grande, contare il numero di cellule con una gemma grande e un nucleo (un segnale DAPI) nella popolazione e dividere per il numero totale di cellule.
6. Fare riferimento al file supplementare 1 per le istruzioni del software con schermate del software di imaging.

L'analisi dei cambiamenti nella localizzazione delle proteine dipendente dal ciclo cellulare mediante microscopia a fluorescenza può essere facilmente realizzata utilizzando i metodi che descriviamo qui. Il nostro gruppo è da tempo interessato alla regolazione dinamica e alla funzione del fuso mitotico. Nel lievito, i corpi dei poli del fuso (contrassegnati dal componente Spc110) funzionano come centri organizzativi dei microtubuli da cui emanano i filamenti dei microtubuli per creare la struttura del fuso mitotico30. La proteina legante i microtubuli, Stu2, svolge un ruolo nella formazione del fuso polimerizzando i microtubuli31. Stu2 svolge anche ruoli diversi in molte sedi cellulari, tra cui cinetocori, corpi dei poli del fuso e estremità dei microtubuli, con cambiamenti nella localizzazione durante il ciclo cellulare che facilitano queste funzioni 32,33,34,35. La microscopia a fluorescenza con Spc110 e Stu2 marcati può essere utilizzata per comprendere la loro localizzazione e funzione nel ciclo cellulare. La Figura 2 mostra immagini rappresentative del segnale Stu2-GFP e Spc110-mCherry in tutto il ciclo cellulare dopo un arresto-rilascio a α fattori. Questi pannelli mostrano i cambiamenti dinamici che Stu2-GFP e Spc110-mCherry subiscono nel ciclo cellulare. Nelle cellule arrestate con G1 (Figura 2A, tempo 0), Stu2-GFP si localizza in un punto prossimale del polo del fuso e mostra anche vari segnali lungo i microtubuli nel citoplasma. Man mano che le cellule progrediscono verso la mitosi, si osserva un segnale Stu2-GFP meno citoplasmatico e Stu2-GFP ora si localizza come due punti prossimali ai poli del fuso duplicati (Figura 2A, tempo 60). Nell'anafase della mitosi, Stu2-GFP si osserva anche lungo i microtubuli tra i poli del fuso oltre ai due segnali del polo del fuso prossimale (Figura 2A, tempo 90). Quando le cellule escono dalla mitosi e rientrano in G1, si osserva ancora una volta il segnale Stu2-GFP sui microtubuli astrali (Figura 2A, tempo 120). La quantificazione delle variazioni nell'intensità dei punti prossimali del fuso Stu2-GFP mostra anche interessanti cambiamenti nel ciclo cellulare per questa popolazione di Stu2. L'andamento del ciclo cellulare è stato monitorato tracciando la percentuale di cellule in anafase (cellule binucleate a gemma larga) per identificare l'insorgenza dell'anafase (Figura 2B). In alternativa, la lunghezza del fuso potrebbe essere misurata per tracciare ogni fase del ciclo della cella in modo più specifico17,36.

Mentre l'esperimento di arresto-rilascio a α fattori fornisce informazioni sui processi cellulari durante l'intero ciclo cellulare, il metodo di deplezione di Cdc20 consente l'analisi di un processo specifico della mitosi, come il reclutamento di proteine nel cinetocore e la regolazione della segregazione cromosomica. In metafase, il checkpoint di assemblaggio del fuso (SAC) arresta la progressione in anafase in assenza di adeguati attacchi microtubulo-cinetocore. L'effettore di questo checkpoint è la chinasi Mps1, che segnala a varie altre molecole, tra cui Bub1, di promuovere l'arresto in metafase fino a quando i microtubuli non sono correttamente attaccati ai cinetocori37,38. Qui, abbiamo utilizzato la deplezione di Cdc20-AID per arrestare le cellule in metafase e analizzare l'effetto del veleno dei microtubuli nocodazolo sul reclutamento della proteina Bub1 nei cinetocorei, poiché il nocodazolo interrompe gli attacchi cinetocore-microtubuli39. Bub1 è stato etichettato con GFP e il componente cinetocoro Mtw1 è stato etichettato con mCherry. Osserviamo che nelle cellule arrestate in metafase dalla deplezione di Cdc20, solo il 5,7% delle cellule mostrava il segnale Bub1-GFP colocalizzato al segnale Mtw1-mCherry, mentre nelle cellule trattate con nocodazolo circa il 94,7% delle cellule lo faceva (Figura 3A, B). L'arresto per deplezione di Cdc20 può essere adattato allo studio di diversi fenotipi mitotici, sia in metafase che negli stadi successivi, mediante l'uso di un regime di arresto-rilascio mitotico. Mostriamo che è possibile effettuare un arresto-rilascio di deplezione di Cdc20 mediante lavaggio dell'auxina, consentendo agli esperimenti di studiare la progressione dell'anafase e l'uscita mitotica (Figura 3C, D).

Figura 1: Progressione del ciclo cellulare e punti di controllo. Una nuova cellula inizia nella fase di gap G1. L'aggiunta del fattore α si traduce in una cellula arrestata G1 shmooed (che ospita una proiezione di accoppiamento, pannello nell'inserto destro) che non progredirà fino a quando il fattore α non viene lavato, consentendo alle cellule di essere rilasciate nel ciclo cellulare. Prima di uscire da G1, un checkpoint assicura che la cellula sia pronta a impegnarsi nella divisione, dopodiché inizia a sintetizzare/duplicare il DNA nella fase S. Gli errori in questo processo possono innescare un altro checkpoint per impedire alla cellula di progredire fino a quando tutto il DNA non viene duplicato accuratamente. Durante la fase S, il corpo del polo del fuso viene duplicato e la cellula inizia a germogliare. Segue un'altra fase di gap, G2, prima che la cellula inizi la mitosi (M) o la divisione cellulare. Durante la fase M, i corpi dei poli del fuso iniziano a separarsi e a formare il fuso mitotico e i cromosomi si allineano. Il checkpoint di assemblaggio del fuso (SAC) assicura che tutti i cromosomi siano correttamente attaccati ai cinetocori prima che i cromosomi vengano separati nelle cellule madre e figlia in anafase. La deplezione dei regolatori dell'insorgenza dell'anafase, come Cdc20, arresta le cellule in metafase. Nelle cellule cicliche, una volta che la SAC è soddisfatta e i cromosomi sono accuratamente segregati, l'abscissione finalizza la separazione della cellula figlia e madre. Ogni cellula inizia il ciclo di nuovo in G1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Misurazione dell'intensità della fluorescenza Stu2 fusiforme-prossimale durante il ciclo cellulare. (A) Immagini rappresentative di cellule in crescita esponenziale che esprimono Stu2-GFP e il marcatore del corpo del polo del fuso Spc110-mCherry (M3577). Le cellule sono state arrestate con fattore α in un arresto G1, quindi rilasciate in YPAD prive di fattore α per progredire attraverso il ciclo cellulare. I campioni sono stati prelevati ogni 15 minuti, fissati e ripresi a immagini. Solo ogni 30 minuti è raffigurato nelle immagini rappresentative. (B) SINISTRA: Il segnale Stu2-GFP prossimale del fuso del singolo punctum è stato misurato in ogni punto temporale. Il numero totale di celle per ogni intervallo di tempo è compreso tra 100 e 136. I punti dati sono mediocri. Le barre di errore sono un intervallo di confidenza del 95%. A destra: La progressione attraverso il ciclo cellulare è stata monitorata calcolando la percentuale di cellule che sono in anafase (a gemma grande e binucleate) in ogni punto temporale. L'anafase inizia a circa 60 minuti e raggiunge il picco a 90 minuti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Quantificazione delle cellule mitotiche con Bub1-GFP colocalizzata nel marcatore fiduciale Mtw1-mCherry del cinetocoro. (A) Immagini rappresentative di cellule arrestate mitoticamente che esprimono Bub1-GFP e il marcatore cinetocoro Mtw1-mCherry (M2734). Le cellule sono state arrestate in metafase depleendo Cdc20-AID mediante l'aggiunta di auxina per 2 ore con o senza l'aggiunta di nocodazolo. I campioni sono stati prelevati a 2 ore, fissati e ripresi a immagini. (B) Percentuale di cellule con un segnale Bub1-GFP colocalizzato al segnale Mtw1-mCherry. La colocalizzazione di Bub1 è stata ottenuta contando le cellule con punti GFP sovrapposti al segnale mCherry. Il numero di cellule quantificate per condizione è 88-94. (C) Immagini rappresentative di cellule arrestate in metafase (mononucleato a gemma larga) e cellule che sono entrate in anafase (binucleato a gemma grande). (D) La progressione attraverso il ciclo cellulare delle cellule rilasciate dalla deplezione di Cdc20-AID è stata monitorata calcolando la percentuale di cellule mononucleate a grande gemma in ogni punto temporale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Tabella 1: Primer e plasmidi per la marcatura C-terminale. Per produrre ogni fusione proteina-tag utilizzata in questo metodo, sono elencate le sequenze di primer e i plasmidi. Le sequenze di primer sono state progettate come descritto in Longtine et al24. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa tabella.

Tabella 2: Condizioni PCR. Per produrre il frammento PCR per la marcatura delle proteine, abbiamo utilizzato le condizioni PCR indicate. Si noti che il tempo di estensione deve essere regolato in base alla lunghezza del frammento di destinazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa tabella.

File supplementare 1: Informazioni sul software e schermate. Informazioni per l'utilizzo del software del microscopio per l'imaging e di ImageJ per l'analisi.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questo file.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.