Articolo metodologico

Rivelazione del controllo elettromeccanico dell'omeostasi tissutale utilizzando un dispositivo microfluidico a due strati

DOI:

10.3791/68894

⸱

19 settembre 2025

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1School of Life Sciences, Westlake University, 2Mechanobiology Institute, National University of Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 4Research Center for Industries of the Future, Westlake University

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per fabbricare un dispositivo microfluidico a due strati unico per studiare la regolazione elettromeccanica dell'omeostasi del tessuto epiteliale. Il dispositivo applica correnti elettriche fisiologiche statiche perpendicolari al piano del tessuto, influenzando l'adesione, la proliferazione e l'estrusione cellula-cellula. L'imaging su cellule vive e le misurazioni dello stress meccanico rivelano i meccanismi di questi processi.

Abstract

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Il comportamento e il destino cellulare sono influenzati da correnti elettriche o campi endogeni o applicati esternamente. I segnali elettrici statici possono essere applicati in dispositivi microfluidici personalizzati per imitare l'ambiente elettrico in processi fisiologici lenti come lo sviluppo, la guarigione delle ferite e l'omeostasi. Un'importante classe di studi sull'elettricità cellulare è il controllo della migrazione cellulare da parte di correnti galvaniche statiche nel piano in semplici canali microfluidici che imitano correnti avvolte, con densità di corrente di ~0,1-1000 A/m2. Tuttavia, a causa della geometria incompatibile, questi dispositivi non sono appropriati per studiare gli effetti elettrici nell'omeostasi tissutale, dove le cellule adottano la polarità apico-basale e una differenza di potenziale transepiteliale (TEPD). Qui, descriviamo in dettaglio un dispositivo unico basato sulla microfluidica che applica correnti ioniche fisiologiche perpendicolari al piano degli strati di cellule epiteliali confluenti per perturbare il TEPD e studiare la regolazione elettrica degli stati stazionari dei tessuti. La configurazione è costituita da un polimero a due strati polimerizzabile con raggi UV incorporato con un substrato morbido in gel di poliacrilammide rivestito con una proteina di matrice extracellulare a scelta. Questo dispositivo microfluidico fornisce la geometria corretta e il substrato permeabile per indurre una corrente ionica relativamente uniforme attraverso gli strati cellulari su scala centimetrica. La configurazione è compatibile con l'imaging confocale su cellule vive e la microscopia a forza di trazione per dedurre le sollecitazioni meccaniche indotte dalle correnti transepiteliali. Sorprendentemente, la proliferazione, l'estrusione e la migrazione delle cellule sono influenzate collettivamente all'interno dell'epitelio confluente a seconda della direzione della corrente ionica, inducendo un nuovo stato tissutale caratterizzato da diverse forze di interazione cellula-cellula, eventi cellulari (morte e proliferazione) e strutture tissutali. I comportamenti delle celle controllati elettricamente possono essere intesi come uno stress meccanico indotto elettricamente e una risposta delle celle. Questo nuovo dispositivo e protocollo microfluidico fornisce lo strumento e la documentazione necessari alle comunità di meccanobiologia e bioingegneria per studiare gli effetti elettrici nell'omeostasi dei tessuti e sviluppare nuove applicazioni di ingegneria tissutale.

Introduzione

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I segnali bioelettrici sono importanti fattori biofisici che contribuiscono a governare il comportamento cellulare. L'esempio più famoso è il potenziale d'azione nei neuroni e nelle cellule cardiache, che trasmettono segnali elettrici su lunghe distanze (fino a un metro) e ad alte frequenze (fino a centinaia di Hertz)1. Gli impulsi elettrici applicati con gli elettrodi possono essere utilizzati per stimolare l'attivazione del potenziale d'azione e sono utili nella ricerca e nelle applicazioni mediche2. Anche i segnali bioelettrici endogeni in processi fisiologici lenti come lo sviluppo, la guarigione delle ferite e l'omeostasi 3,4,5,6,7,8 sono stati misurati 9,10 per periodi di ore o giorni. Un esempio importante sono gli strati epiteliali confluenti che mantengono attivamente una differenza di potenziale transepiteliale (TEPD) che varia da pochi a decine di millivolt 4,11. Un taglio o una ferita in questi strati confluenti genera una corrente di cortocircuito, guidata dall'attività elettrica del tessuto 12,13. Correnti avvolte fino a decine di μA/cm2 e campi elettrici fino a centinaia di mV/mm sono stati riportati con diverse tecniche. Gli studi suggeriscono che questi segnali elettrici producono un segnale direzionale per le cellule a migrare verso i siti della ferita o dell'infezione che è importante per il processo di guarigione 3,6,14. In generale, sia i segnali elettrici statici (o a variazione lenta) che quelli a variazione rapida sono importanti e innescano diverse risposte cellulari o tissutali.

Nell'ambito dei segnali a variazione lenta, un fenomeno importante è il processo di migrazione guidato elettricamente chiamato "galvanotassi". Le correnti galvaniche controllate in piano possono essere applicate in dispositivi microfluidici con canali semplici per imitare le correnti avvolte, mentre la migrazione cellulare è studiata in funzione della densità di corrente 15,16. Si è scoperto che campi elettrici di 0,1-1000 V/m (corrispondente densità di corrente di 0,1-1000 A/m2) guidano la migrazione cellulare in molti tipi di cellule in questo contesto in vitro 17, mentre le vie di segnalazione canoniche della chemiotassi (migrazione cellulare guidata da gradienti chimici), come PI3K, sono state implicate nella galvanotassi 7,18. I dispositivi microfluidici "bare-bones" per lo studio della galvanotassi possono essere fabbricati con tecniche standard di litografia morbida e microfabbricazione19. Questi dispositivi sono tipicamente costituiti da un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) a canale singolo legato a un vetrino (dimensione della sezione trasversale del canale: centinaia di micrometri, lunghezza: centimetri). Gli elettrodi utilizzati per fornire la corrente statica sono installati lontano dalla regione della cella e collegati con o senza ponti salini. Il collegamento a ponte salino può essere effettuato mediante fori perforati attraverso il substrato PDMS, connettori microfluidici e tubi riempiti di agar. Il semplice vetrino (tipicamente spesso 170 μm) sotto il canale supporta anche l'imaging ad alta risoluzione di cellule vive durante gli esperimenti di galvanotassi , che è una caratteristica cruciale per lo studio del processo.

Il ruolo dei segnali elettrici endogeni nel mantenimento dell'omeostasi tissutale è molto meno compreso di quello nella guarigione delle ferite. Una ragione importante è la mancanza di strumenti appropriati per studiare questi effetti nei tessuti intatti. Il dispositivo microfluidico per galvanotassi non è adatto a questo scopo a causa della sua geometria, che supporta solo correnti elettriche nel piano. Nel contesto dell'omeostasi epiteliale, è necessario un nuovo dispositivo per controllare e perturbare la TEPD o le correnti fuori piano attraverso uno strato epiteliale confluente. Per raggiungere l'obiettivo di applicare una densità di corrente ionica relativamente uniforme su un monostrato, abbiamo progettato e fabbricato un dispositivo microfluidico con innovazioni nella geometria del dispositivo, nell'uso dei materiali e nelle capacità di misurazione biomeccanica in situ 4. Quest'ultima capacità è importante in quanto gli effetti elettrici possono influenzare il comportamento cellulare attraverso l'accoppiamento con percorsi di biomeccanica e meccanobiologia, che possono essere studiati con questa caratteristica.

Questo nuovo dispositivo presenta molteplici caratteristiche innovative. È progettato con due strati al posto del singolo canale che si trova nei dispositivi di galvanotassi (innovazione nella geometria), pur mantenendo la connessione con le camere degli elettrodi simile a quella di quest'ultima. Il primo strato microfluidico ha canali per dirigere le correnti ioniche verso (o lontano da) la regione del tessuto, mentre il secondo strato ha un'apertura che dirigerà questa corrente perpendicolarmente attraverso l'epitelio che si trova sopra questo secondo strato microfluidico (Figura 1A, B). Le tecniche di microfabbricazione vengono utilizzate per produrre strati sufficientemente sottili in modo tale che sia possibile l'imaging confocale ad alta risoluzione nonostante l'impilamento di strati microfluidici che aumenta lo spessore del campione. Per le altre importanti innovazioni, al centro del dispositivo è incorporato un idrogel sintetico di poliacrilammide (PA), che svolge un ruolo cruciale (Figura 1A, B). Le proprietà fisico-chimiche di questo gel, come la chimica disponibile per rivestire le proteine della matrice extracellulare, la permeabilità agli ioni, così come l'elasticità nota, sono rispettivamente essenziali per l'adesione e la crescita cellulare, l'applicazione di correnti fuori piano e la misurazione dello stress meccanico20 durante la stimolazione elettrica. Le strutture barriera sono incorporate nello strato 1 della regione tissutale per il confinamento della soluzione precursore del gel PA, come fatto nei precedenti dispositivi microfluidici21 (Figura 1A, B). Ultimo ma non meno importante, poiché la polimerizzazione del gel PA è inibita dall'ossigeno sulle superfici PDMS permeabili all'ossigeno gassoso, un altro materiale22 viene utilizzato per la fabbricazione del dispositivo, che può consentire la polimerizzazione e l'incollaggio stretto del gel PA. Tutte le caratteristiche innovative sono fondamentali per il funzionamento del nuovo dispositivo.

Nel complesso, lo studio approfondito di segnali bioelettrici statici o a variazione lenta nell'omeostasi di tessuti intatti è reso possibile con questo nuovo dispositivo, il cui protocollo sarà dettagliato di seguito. Il protocollo e i risultati a cui si fa riferimento sono focalizzati sulla linea cellulare epiteliale Madin Darby Canine Kidney II (MDCK II), compresi gli eventi cellulari (proliferazione, morte, estrusione e migrazione) e i cambiamenti strutturali dei tessuti indotti dalla corrente elettrica. Questi studi sono anche istruttivi per i ricercatori che sono interessati ad applicare questa tecnica per studiare la regolazione elettrica del trasporto epiteliale e l'induzione di eventi cellulari e cambiamenti del destino cellulare negli strati cellulari e nei sistemi più complessi, come le cellule primarie e gli organoidi 2D.

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Protocollo

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NOTA: Questo protocollo fornisce i passaggi per costruire una configurazione che applica correnti elettriche statiche e perturba il TEPD degli epiteli confluenti e per studiarne gli effetti attraverso tecniche di imaging di cellule vive e meccanobiologia (Figura 1). La configurazione consiste in dispositivi costituiti da chip microfluidici legati a cartucce, inserti e supporti per alloggiare più dispositivi per esperimenti multiplex su un microscopio, una coppia di camere di elettrodi collegate a un misuratore di sorgente e dispositivi e un coperchio della camera di celle vive per il mantenimento di condizioni adeguate di cellule vive (Figura 1C). I principi di progettazione e i disegni del file CAD della cartuccia e di altri componenti importanti della configurazione sono disponibili nel file supplementare 1. Le fasi includono: 1) Litografia morbida PDMS; 2) Fabbricazione di chip e assemblaggio del dispositivo; 3) Completamento dell'installazione; e 4) Crescita monostrato ed esperimenti su cellule vive. Informazioni dettagliate sui reagenti e sui materiali utilizzati in questo protocollo sono riportate nella Tabella dei materiali.

1. Litografia morbida PDMS

NOTA: Questa sezione descrive in dettaglio la produzione di elastomeri PDMS da wafer SU-8 (Figura 2A, B) per stampare strati a base di adesivo polimerizzabili con raggi UV del chip microfluidico.

  1. Litografia morbida PDMS
    1. Fabbricare un wafer separato basato su SU-8 per ogni strato microfluidico, strato 1 e 2, utilizzando tecniche di fotolitografia (file supplementare 2 e file supplementare 3).
      NOTA: La fabbricazione dei wafer può richiedere un mese se una richiesta viene inviata a una struttura di microfabbricazione/camera bianca. Può essere utilizzata anche la tecnica di incisione del silicio per la fabbricazione di wafer.
    2. Silanizzare il wafer di silicio per consentire lo sformatura del PDMS19.
      1. Pulire il wafer con una pistola ad aria compressa ad azoto pressurizzato. Attivare la superficie del wafer applicando un breve processo al plasma di ossigeno (30 s, 30 W in 20 sccm di flusso di gas O2 a una pressione del reattore di 1-3 mbar)23.
      2. Pipettare 200 μl di Tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil-1-triclorosilano in un tappo di plastica pulito (diametro 60 mm, altezza 15 mm). Mettere il tappo accanto al wafer nell'essiccatore sottovuoto (solo per la silanizzazione). Accendere la pompa del vuoto e attendere 1-2 ore, mentre il silano vaporizzato si deposita come monostrato sul wafer di silicone.
        ATTENZIONE: Il silano è corrosivo e tossico. Indossare guanti e occhiali di sicurezza e operare in una cappa aspirante per garantire un funzionamento sicuro.
        NOTA: Un wafer appena silanizzato può essere utilizzato per fabbricare 10-20 pezzi di stampi PDMS. Il tempo di vuoto dipende dalle condizioni della pompa del vuoto. Un'eccessiva silanizzazione provoca uno spessore irregolare e si traduce in un aspetto torbido, che deve essere evitato. Conservare i wafer in camere a umidità controllata quando non vengono utilizzati. Le strutture PDMS realizzate con nuovi wafer possono essere controllate utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM).
    3. Miscelare accuratamente una quantità sufficiente di resina PDMS di base e agente reticolante (p:p = 10:1 e 70-80 g) per alcuni minuti in una capsula di Petri (diametro 150 mm, altezza 25 mm). Assicurarsi che le piccole bolle si formino uniformemente nella miscela, il che conferma una buona miscela. Trasferire la miscela in provette da centrifuga da 50 ml e centrifugare a 550 x g per 3 minuti per rimuovere completamente le bolle d'aria.
      NOTA: Il liquido PDMS è appiccicoso e difficile da pulire; Fare attenzione quando si versa. Pulire con isopropanolo se le superfici del banco sono contaminate dalla miscela PDMS versata.
    4. Versare delicatamente la miscela PDMS sul wafer in un piatto di plastica o vetro (diametro 150 mm, altezza 25 mm) con fondo piatto, quindi spingere verso il basso il wafer per eliminare il PDMS dal fondo del wafer. Degassare la miscela con una pompa a vuoto.
      NOTA: Lo spurgo del PDMS liquido dal fondo del wafer è importante; uno spesso strato di PDMS sul fondo rende difficile la rimozione del wafer dal piatto di plastica, aumentando la probabilità che il wafer si frantumi. In alternativa, si può tagliare il PDMS lungo il bordo del wafer e conservare il wafer nella capsula di Petri. Garantire uno spessore PDMS di circa 1,5 mm per lo strato 1 per garantire la flessibilità dello stampo nelle fasi di fabbricazione successive. Garantire uno spessore PDMS di circa 2,5 mm per lo strato 2 per ridurre la probabilità di cedimenti nelle fasi di fabbricazione successive. Lo spessore del PDMS viene misurato da un righello dopo che gli stampi PDMS sono stati tagliati nelle forme necessarie.
    5. Polimerizzare il PDMS in forno a 80 °C per 2 ore e assicurarsi che la pirofila sia posizionata il più orizzontalmente possibile durante il processo. Lasciare raffreddare lo stampo PDMS e il wafer a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela lo stampo PDMS nella sua interezza dal wafer utilizzando una lama chirurgica affilata e una pinzetta imbottita.
      NOTA: Fare attenzione a non graffiare la superficie del wafer. Controllare se si formano residui di PDMS sulla superficie del wafer quando il PDMS viene staccato. Questo segnala che la superficie del wafer deve essere nuovamente silanizzata.
    6. Tagliare lo stampo PDMS in blocchi che contengano le caratteristiche di interesse e conservare questi blocchi in piastre di Petri pulite (diametro 150 mm, altezza 25 mm) o in una camera a vuoto quando non in uso. Manipolare lo stampo PDMS senza toccare le caratteristiche essenziali.

2. Fabbricazione di chip e assemblaggio del dispositivo

NOTA: Utilizzare un polimero a bassa viscosità e polimerizzabile con raggi UV (intervallo massimo di assorbimento UV 350-380 nm) per fabbricare il chip microfluidico attraverso lo stampaggio PDMS. L'adesivo a polimerizzazione UV consente l'integrazione dell'idrogel di poliacrilammide (PA) come substrato cellulare trasparente, permeabile agli ioni ed elastico. Le proprietà del gel PA lo supportano come sensore di stress meccanico tissutale che consente l'imaging di cellule vive e la stimolazione della corrente statica. Il chip sarà infine collegato a una cartuccia che ospita il terreno di coltura e si collega alle camere degli elettrodi.

  1. Preparazione della base del vetrino coprioggetto
    1. Incidere la quantità richiesta di vetrini coprioggetti rettangolari (170 μm) con una fresa diamantata a una dimensione di 37 × 24 mm2, per adattarsi alle dimensioni della cartuccia (File supplementare 4).
      NOTA: Il vetrino coprioggetti ha uno spessore di 170 μm compatibile con l'imaging ad alta risoluzione, ma è fragile e richiede un'attenta manipolazione. Indossare guanti e protezione per gli occhi. Smaltire immediatamente i vetrini coprioggetti rettangolari in vetro se compaiono crepe visibili, poiché le schegge di questi vetrini coprioggetti rettangolari in vetro possono comportare il rischio di perdite. In alternativa, ordina i vetrini coprioggetti della giusta dimensione dai produttori di vetrini coprioggetti. Evitare di toccare le superfici dei vetrini rettangolari in vetro a mani nude e lasciare macchie che possono deteriorare la qualità dell'imaging.
    2. Metti i vetrini coprioggetti rettangolari in una capsula di Petri pulita senza sovrapporli e trasferiscili in una camera al plasma. Indurre una condizione di vuoto, ma far entrare un po' d'aria alla fine. Attivare le superfici dei vetrini coprioggetti rettangolari utilizzando il plasma ad aria (da 30 s a 5 min, 29,6 W, a seconda delle condizioni dell'apparecchiatura)
      NOTA: Nel passaggio successivo (passaggio 2.1.3) devono essere utilizzati solo i lati completamente esposti al plasma (cioè le superfici superiori). Completare il passaggio 2.1.3 entro 30 minuti dall'esposizione al plasma. La camera dovrebbe apparire come Rosa-Viola in questa fase se è stato generato plasma d'aria. Se le ultime fasi di incollaggio hanno successo, ridurre la durata del plasma per comodità.
    3. Preparare 10 mL di soluzione per il trattamento superficiale composta da acido acetico allo 0,3% e metacrilato di 3-(trimetossisilil)propile allo 0,5% disciolti in etanolo al 100%. Trattare i vetrini di vetro rettangolari con questa soluzione in una capsula di Petri (diametro 150 mm, altezza 25 mm) per 5 minuti su uno shaker, per consentire un buon legame con strati microfluidici a base di adesivo a polimerizzazione UV. Assicurarsi che i vetrini di vetro rettangolari siano completamente immersi nella soluzione ed entrambi i lati siano trattati.
      ATTENZIONE: La soluzione per il trattamento superficiale è corrosiva. Maneggialo in una cappa aspirante.
    4. Sciacquare tre volte i vetrini coprioggetti rettangolari con etanolo al 100%, senza lasciarli asciugare durante il processo. Asciugare i vetrini rettangolari in vetro uno ad uno con azoto gassoso e una pistola ad aria compressa. Garantire una velocità di soffiaggio sufficiente che rimuova in modo pulito le goccioline di liquido dalle superfici della base del vetrino coprioggetti, prevenendo le macchie di liquido. Conservare i vetrini di vetro rettangolari in una capsula di Petri pulita (diametro 150 mm, altezza 25 mm).
      NOTA: Utilizzare una pistola ad aria compressa per dirigere il flusso d'aria parallelamente alle basi dei vetrini coprioggetti ed evitare di utilizzare una velocità di soffiaggio eccessiva per evitare che i bicchieri si frantumino.
  2. Fabbricazione di strato 1 (Figura 2C)
    1. Posizionare e appiattire uno stampo PDMS Layer 1 pulito, rivolto verso l'alto, su un tappo di plastica pulito (diametro 60 mm, altezza 15 mm). Pipettare lentamente 500 μL di adesivo liquido a polimerizzazione UV sullo stampo, bagnando accuratamente tutte le strutture sporgenti con l'aiuto di una spatola. Rimuovere le bolle d'aria dovute al processo di bagnatura.
      NOTA: Gli stampi PDMS puliti possono essere preparati utilizzando del nastro adesivo per rimuovere la polvere o i residui di adesivo polimerizzabili con raggi UV o pulendoli con etanolo. Per ulteriore precauzione, conservare gli stampi PDMS nelle camere a vuoto quando non vengono utilizzati.
    2. Premere delicatamente il vetrino coprioggetti sullo stampo PDMS. Evitare che l'eccesso di adesivo a polimerizzazione UV bagni il lato superiore del vetrino coprioggetti, poiché i residui di adesivo a polimerizzazione UV possono impedire un vetrino coprioggetti pulito e piatto. Rimuovere l'adesivo UV in eccesso con i panni da laboratorio.
      NOTA: È fondamentale assicurarsi che le caratteristiche dello stampo PDMS trasferito sullo strato adesivo a polimerizzazione UV si allineino con la cartuccia a cui verrà incollato. Per fare ciò, segnare il vetrino coprioggetti con un pennarello solubile dove saranno situati i centri dei pozzetti della cartuccia (tre di essi). Utilizzare questi segni per allineare il vetrino coprioggetti con le caratteristiche dello stampo PDMS quando si preme il vetrino coprioggetto rettangolare in vetro verso il basso.
    3. Polimerizzare parzialmente la struttura sotto una luce UV illuminata uniformemente (363-370 nm, 224 mW/cm2) per 10 s. Pulisci i segni con etanolo al 75% in seguito. Tenere saldamente la struttura su una superficie piana e staccare lentamente lo stampo PDMS Layer 1 da esso.
      NOTA: L'indurimento parziale consente la formazione di uno strato adesivo sufficientemente solido e polimerizzabile con raggi UV, consentendo il distacco dello stampo PDMS in questa fase. Ciò facilita anche l'incollaggio con uno strato 2 parzialmente polimerizzato nelle fasi successive per la realizzazione di una struttura adesiva a due strati polimerizzabile con raggi UV. Lo stampo PDMS Layer 1, che è stato preparato con uno spessore di 1,5 mm (passaggio 1.2.4), garantisce una flessibilità PDMS sufficiente a ridurre la probabilità che il sottile vetrino si frantumi durante il processo di pelatura. Lo stampo PDMS può essere riutilizzato fino a dieci o venti volte, dopodiché potrebbe esserci uno strato biancastro di residui di adesivo polimerizzabile con raggi UV sulla superficie PDMS, riducendo lo spessore della struttura. In questo caso, utilizzare nuovi stampi PDMS.
  3. Fabbricazione di strato 2 (Figura 2D)
    1. Posizionare uno stampo PDMS di livello 2 pulito, a faccia in giù, su una lastra PDMS piana (spessore della lastra di > 2,5 mm per garantire un'elevata rigidità). Picchietta delicatamente le caratteristiche dall'alto usando una pinzetta. Osservare l'interfaccia per l'oscuramento o il contrasto ottico sotto le funzioni: questo indica un contatto corretto.
      NOTA: I pilastri di supporto che circondano le caratteristiche principali (due aperture rotonde e una fessura) sono fondamentali per evitare il cedimento della superficie dello stampo PDMS.
    2. Riempire lo spazio tra lo stampo PDMS e la lastra con adesivo liquido a polimerizzazione UV tramite effetto capillare. Polimerizzare parzialmente la struttura sotto la luce UV (363-370 nm, 224 mW/cm2) per 10 s.
    3. Staccare delicatamente lo strato adesivo composito a polimerizzazione UV e lo stampo PDMS dalla lastra PDMS con una pinzetta morbida imbottita. Se necessario, taglia i bordi in eccesso dello strato adesivo a polimerizzazione UV con un paio di forbici affilate.
  4. Incollaggio degli strati 1 e 2 (Figura 2E)
    1. Posizionare lo strato 1 attaccato a un vetrino coprioggetti rettangolare su una superficie piana. Allinea il livello 2 (ancora attaccato al suo stampo PDMS) con il livello 1 e premi saldamente entrambi i livelli, assicurandoti che le "ombre" vengano visualizzate sotto le caratteristiche.
    2. Polimerizzare la struttura sotto luce UV (363-370 nm, 224 mW/cm²) per 10 s per legare gli strati 1 e 2, che formano la struttura a due strati del chip microfluidico. Staccare delicatamente lo stampo PDMS dal chip.
      NOTA: Per garantire il corretto distacco dello stampo PDMS dal chip, utilizzare una pinzetta per separare ciascun pilastro di supporto PDMS dallo strato 2 adesivo a polimerizzazione UV nel passaggio 2.4.1. Questa azione aiuta a ridurre l'adesione complessiva tra lo stampo PDMS e lo strato 2, che è importante per il peeling.
  5. Integrazione di gel di poliacrilammide (Figura 2F)
    NOTA: Prima di questa sezione, preparare tutti i chip necessari per un esperimento multiplexato.
    1. Preparare la soluzione precursore del gel PA mescolando delicatamente gli ingredienti nella tabella sottostante, corrispondenti alla rigidità del gel PA scelta24 (controllare la Tabella 1). Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria durante il pipettaggio poiché l'ossigeno inibisce la gelificazione.
      ATTENZIONE: TEMED e APS sono tossici. Lavorare in cappa aspirante e indossare i guanti.
      NOTA: Sono necessari un pipettaggio e una manipolazione accurati poiché sono coinvolti piccoli volumi di liquidi (1 μL TEMED per 1 mL di soluzione precursore in gel PA). La rigidità del gel può influenzare il comportamento cellulare, come dimostrato in molti studi di meccanobiologia. Scegli la rigidità più appropriata per i tuoi esperimenti. Le perle fluorescenti fungono da marcatori fiduciali per la deformazione del gel e l'inferenza dello stress meccanico. Versare la soluzione a vortice prima di pipettare la soluzione nella soluzione precursore del gel PA. Si raccomanda di non miscelare per ultimo il TEMED di piccolo volume poiché le soluzioni precursori del gel PA iniziano a gelificare quando vengono aggiunti entrambi gli iniziatori e piccoli volumi sono difficili da miscelare accuratamente durante questo breve periodo.
    2. Pipettare immediatamente 10 μl della soluzione precursore del gel PA al centro della regione tissutale e sopra la fessura dello strato 2 (Fig. 1B, 2F). Premere delicatamente con un vetrino coprioggetti rotondo (diametro 10 mm) fino a formare un gel piatto. Osservare il flusso della soluzione PA nello strato 1 attraverso la fessura e fermarsi alla fila di pilastri della barriera.
      NOTA: Il volume di 10 μl di soluzione precursore del gel PA produce un gel di 100 μm di spessore sopra lo strato 2. Modificare questo volume a seconda dello spessore del gel richiesto. Pipettare la soluzione sul chip il prima possibile, poiché la soluzione PA inizia a polimerizzare una volta aggiunti gli iniziatori. Premere la soluzione con la giusta quantità di forza per evitare che la soluzione trabocchi attraverso i pilastri della barriera e ostruisca il canale. Scartare il chip se i canali sono bloccati. Per gel morbidi con rigidità di 5 kPa o inferiore, utilizzare un idrorepellente per vetro per trattare i vetrini coprioggetti rotondi per rendere i vetrini idrofobici. In particolare, immergere i vetrini coprioggetti in vetro idrorepellente per 5 minuti, risciacquare con etanolo al 100% 3 volte e asciugare con azoto gassoso. Ciò facilita la successiva rimozione del vetrino coprioggetto dal gel polimerizzato senza distruggere il gel.
    3. Polimerizzare immediatamente il chip microfluidico sotto la luce UV (363-370 nm, 224 mW/cm2) per 5 minuti. Attendere almeno ~1 ora affinché il gel PA si solidifichi completamente.
      NOTA: Questo polimerizzerà completamente il chip consentendo al gel PA polimerizzato di legarsi alla struttura. I passaggi 2.5.1, 2.5.2 e 2.5.3 devono essere completati in rapida successione.
    4. Incubare accuratamente il chip in HEPES (0,1 M, pH 7,4) per almeno 1 ora o più per bagnare il gel e allentare l'adesione tra il vetrino coprioggetti e il gel. Rimuovere delicatamente il vetro di copertura con un paio di pinzette affilate.
      NOTA: Per i gel più morbidi con rigidità di 5 kPa o inferiore, aumentare il periodo di incubazione fino a 10 ore su uno shaker per garantire una rimozione pulita del vetro di copertura dal gel senza interrompere la struttura del gel. A volte, possono formarsi modelli strutturali di diverse decine e centinaia di micrometri tra la base rettangolare del vetrino coprioggetti e lo strato 1 a base di adesivo a polimerizzazione UV. Questi modelli possono interferire con l'imaging in campo chiaro, ma hanno effetti minimi sull'imaging a fluorescenza. Questo può essere migliorato mediante l'attivazione al plasma di vetrini coprioggetti rettangolari come al punto 2.1.2.
  6. Incollaggio di chip e cartucce (Figura 2F)
    1. Posizionare una cartuccia in policarbonato per uso medico pulita (File supplementare 4) su una superficie piana, con la parte inferiore rivolta verso l'alto. Asciugare il gel sul chip con salviette da laboratorio dal lato. Allineare il chip, rivolto verso il basso, con la cartuccia.
      NOTA: Quando si testano nuovi progetti di cartucce, è possibile utilizzare metodi di lavorazione o di stampa 3D. Quando il design è impostato, è possibile utilizzare lo stampaggio a iniezione per produrre grandi quantità di cartuccia.
    2. Pipettare l'adesivo a polimerizzazione UV nelle fessure tra il chip e la cartuccia, che verrà riempita tramite effetto capillare. Polimerizzare con luce UV (363-370 nm, 224 mW/cm2) per 5 min.
      NOTA: Fare attenzione a evitare che l'adesivo polimerizzabile ai raggi UV trabocchi nei canali o sull'altro lato della base del vetrino coprioggetti.
  7. Rimozione della soluzione di PA non polimerizzata
    1. Utilizzare un tappo PDMS e una siringa per aspirare circa 5 mL di HEPES (0,1 M, pH 7,4) attraverso i canali di rimozione dei rifiuti per eliminare la soluzione precursore del gel PA non polimerizzata che è tossica per le cellule.
    2. Incubare il gel nel dispositivo con 2 ml di HEPES (0,1 M, pH 7,4) per dispositivo e metterlo su un agitatore per 1-2 giorni, per garantire la completa rimozione della soluzione precursore del gel PA non polimerizzata.

3. Completamento della configurazione

NOTA: Con i dispositivi realizzati, completare la configurazione (Figura 1C) rivestendo il gel PA con la proteina ECM per la semina cellulare, collegando i dispositivi alla camera degli elettrodi per la stimolazione elettrica e posizionando i dispositivi in inserti, supporti e un coperchio della camera di cellule vive per esperimenti di imaging multiplex su cellule vive.

  1. Preparazione dei componenti sterilizzati
    1. Tutti i componenti della configurazione diversi dal dispositivo (Tabella dei materiali) devono essere sonicati nel seguente ordine: prima in acqua saponata per 30 minuti, poi in acqua MQ per 30 minuti e infine in etanolo al 75% per 30 minuti. Successivamente, asciugarli in forno a 60 °C e trattarli con luce UV a 200-280 nm in una cabina di biosicurezza per 30 minuti per ottenere la sterilizzazione.
  2. Funzionalizzazione di gel PA con proteina ECM
    1. Sterilizzare i dispositivi con luce UV (200-280 nm) in una cappa di biosicurezza.
    2. Preparare la quantità necessaria di 50 μg/mL di soluzione di lavoro di collagene I in 1x DPBS su ghiaccio.
      NOTA: Mantenere le scorte di collagene I sul ghiaccio per prevenire la gelificazione. Per immergere completamente il gel sono necessari 100-150 μL di soluzione di lavoro di collagene I. Pipettare delicatamente le soluzioni di collagene I per evitare la formazione di fibre.
    3. Preparare la quantità necessaria di soluzione di lavoro Sulfo-SANPAH (SS) su ghiaccio. Ogni trattamento con gel richiede circa 80 μL di soluzione di lavoro SS, mentre 2 μL di soluzione madre SS (disciolta in DMSO anidro) vengono diluiti in 80 μL di HEPES freddo (da 4 °C in frigorifero, 0,1 M, pH 7,4).
      NOTA: SS è sensibile all'umidità; Evitare la condensa dell'umidità sul prodotto equilibrando le fiale di riserva a temperatura ambiente prima dell'apertura. Utilizzate il sistema SS senza pesatura per ottenere le migliori prestazioni e preparate le scorte in DMSO anidro. Usalo il prima possibile. Un tampone HEPES freddo viene utilizzato per ridurre il tasso di idrolisi del SS in preparazione della soluzione di lavoro SS. Ogni gel richiede due trattamenti con la soluzione di lavoro SS per garantire che la superficie del gel PA sia ben funzionalizzata.
    4. Asciugare il gel nel dispositivo tamponando con salviette da laboratorio sui bordi del gel. Pipettare 80 μl di soluzione di lavoro SS sul gel, assicurandosi che la superficie del gel sia completamente immersa con la soluzione SS. Trattare il gel con UV (363-370 nm, 24,5 mW/cm2) per 5 minuti per attivare la SS. Risciacquare 3 volte con HEPES freddo (0,1 M, pH 7,4).
      NOTA: Pipettare con cura SS al centro del pozzetto della cartuccia per evitare che SS venga attratto dalla parete.
    5. Ripetere il passaggio 3.2.4, ma alla fine risciacquare tre volte con 1x DPBS freddo.
      NOTA: I passaggi da 3.2.3 a 3.2.5 devono essere eseguiti in rapida successione per prevenire l'idrolisi SS. Il gel risciacquato dovrebbe apparire in una tonalità di rosso più scura in questa fase se l'attivazione superficiale da parte della SS ha successo.
    6. Pipettare 100 μL di soluzione di collagene I su gel PA, assicurandosi di immergere completamente il gel. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora, quindi risciacquare tre volte il collagene non attaccato con 1x DPBS. Immergere il gel in 1x DPBS prima dell'uso.
      NOTA: Il campione rivestito di collagene I può essere conservato in frigorifero a 4 °C per alcuni giorni.
  3. Collegamento dei dispositivi alle camere degli elettrodi
    1. Fissare i dispositivi agli inserti utilizzando le viti (Figura 1C, tipo di vite: M3 X 10 mm). Quindi, fissare fino a quattro gruppi di inserti del dispositivo al supporto progettato per il montaggio su un tavolino per microscopio (tipo di vite: M3 X 5 mm).
      NOTA: Se non viene utilizzato il numero massimo di assemblaggi dispositivo-inserto, si consiglia di riempire tutti gli altri slot del supporto con dispositivi vuoti per sigillare lo spazio in modo che le buone condizioni delle cellule vive possano essere preservate per gli esperimenti di imaging successivi. I dispositivi vuoti possono essere realizzati semplicemente incollando le cartucce ai vetrini rettangolari nudi.
    2. Riempire i dispositivi con terreno di coltura (DMEM++, 2 mL in ciascuno dei pozzetti principali). Estrarre ulteriormente 2 mL di terreno attraverso i canali di rimozione dei rifiuti per eliminare e sostituire il DPBS 1x.
    3. Preparare due provette da 50 mL con tappi che hanno fori passanti per funzionare come camere degli elettrodi. Creare fori di dimensioni e quantità adeguate per inserire saldamente gli elettrodi in platino e i tubi Tygon, collegando le camere degli elettrodi ai dispositivi. Riempire ogni camera di elettrodo con 45 mL di terreno di coltura.
      NOTA: I fori possono essere facilmente creati sui cappucci utilizzando lame chirurgiche affilate.
    4. Preparare il collegamento tra le camere degli elettrodi e i dispositivi: Collegare due connettori per tubi a ciascun dispositivo. Inserire una clip per tubi su ciascun tubo Tygon (Figura 1C). Tirare il terreno di coltura attraverso i tubi con una siringa e agganciarli saldamente. Collegare un'estremità del tubo riempito di mezzo alla camera dell'elettrodo e l'altra al dispositivo.
      NOTA: Ridurre la probabilità di formazione di bolle nei tubi utilizzando un mezzo preriscaldato e/o degassando il fluido in una camera a vuoto. Evitare la formazione di bolle d'aria all'interfaccia tra il tubo Tygon e il connettore del tubo, pizzicare le estremità del tubo per gonfiare la superficie del fluido prima di immergerlo nel fluido nel tubo o effettuare un collegamento fisico ai connettori del tubo.
    5. Regolare le altezze relative tra le superfici del terreno di coltura nei dispositivi e nelle camere degli elettrodi utilizzando un martinetto da laboratorio. Rilasciare le clip del tubo e lasciare che tutte le superfici del fluido si equilibrino alla stessa altezza.
      NOTA: Ricordarsi di fissare le clip del tubo ogni volta che l'intera configurazione viene spostata per evitare che i liquidi trabocchino.
    6. Eseguire il controllo di qualità misurando la resistenza di ciascun dispositivo separatamente utilizzando un misuratore di sorgente elettrica.
      NOTA: Assicurarsi di rilasciare solo la clip del tubo del dispositivo per il quale viene misurata la resistenza, mantenendo saldamente fissate le clip degli altri dispositivi collegati in parallelo.

4. Crescita su monostrato ed esperimenti su cellule vive

NOTA: Per formare un corretto monostrato confluente e per ottenere una densità di corrente elettrica uniformemente distribuita che dipende dalla confluenza e dalla resistenza elettrica del monostrato. Quindi, garantire le condizioni corrette delle cellule vive su un microscopio per esperimenti di imaging e stimolazione elettrica a lungo termine.

  1. Crescita monostrato
    1. Staccare le cellule MDCK usando la tripsina dai matracci T25. Centrifugare e contare il volume del mezzo necessario per ottenere 0,1 milioni di cellule. Sospendere questo numero di cellule e mescolarle bene in 2 mL di terreno in provette da centrifuga.
    2. Pipettare tutto il terreno carico di cellule nel pozzetto nella regione del tessuto. Lasciare sedimentare le cellule per 15 minuti prima di trasferire lentamente l'intera configurazione in un incubatore per colture tissutali.
      NOTA: Per ogni dispositivo, una densità di semina di 0,1 milioni di celle corrisponde a 0,06 milioni di cellule per centimetro quadrato (6 × 104 celle/cm2). Questa densità di semina è abbastanza scarsa e le cellule crescono per 2 giorni prima di raggiungere uno stato confluente. Questo processo garantisce un monostrato correttamente polarizzato e omogeneo, senza la necessità di risciacquare le eccessive cellule non attaccate che rischiano di perturbare il tessuto. La fase di sedimentazione è importante da lasciare indisturbata in modo che ci sia una semina uniforme delle cellule.
    3. Lasciare crescere le cellule nell'incubatore (37 °C, 5% CO2, 90% di umidità) per 72 ore per raggiungere una densità cellulare di >~50 cellule/100 μm2. Controllare quotidianamente su un microscopio da banco, con contrasto di fase, per monitorare il processo di crescita.
      NOTA: Con questo numero di cellule seminate, le cellule MDCK avranno raggiunto il 70%-80% di confluenza dopo 24 ore, la piena confluenza dopo 48 ore e un ulteriore aumento della densità cellulare e la maturazione dei tessuti fino a 72 ore. Dopo 24 ore, la lunghezza media della cella è di circa 10-20 μm. A 48 ore, le giunzioni cellula-cellula e il corpo cellulare hanno un chiaro contrasto nell'imaging a contrasto di fase. Questo contrasto si riduce drasticamente dopo 72 ore.
  2. Imaging di cellule vive
    1. Scegliere un microscopio a epifluorescenza o un microscopio confocale a seconda delle esigenze sperimentali. Quando le cellule esprimono o sono colorate con marcatori fluorescenti, scegliere il confocale per l'osservazione tridimensionale della forma cellulare e delle deformazioni del substrato in gel. Per l'osservazione bidimensionale, scegli il contrasto di fase e l'epifluorescenza, che producono meno fototossicità. Accendere il sistema di cellule vive 1 ora prima di portare la configurazione al microscopio, consentendo all'incubatore del tavolino del microscopio di stabilizzarsi a 37 °C, 5% di CO2 e 90% di umidità.
      NOTA: Il controller del sistema di celle vive mostra le condizioni nell'incubatore da tavolo e emette un segnale acustico quando le condizioni non sono ottimali. Poiché il coperchio dell'incubatore a tavolino è diverso da quello commerciale a causa della necessità di alloggiare tubi del dispositivo che si estendono verso l'esterno, il sistema necessita di ricalibrazione per garantire buone condizioni di celle vive per esperimenti di lunga durata (da pochi giorni a una settimana). La calibrazione può essere eseguita in base al manuale dell'utente e le posizioni dei sensori devono essere mantenute le stesse negli esperimenti e nelle condizioni di calibrazione. Controllare la velocità di evaporazione del terreno nell'incubatore a tavolino e le condizioni di pH con il terreno infuso di rosso fenolo.
    2. Montare la configurazione sul microscopio, con le camere degli elettrodi sui lati. Assicurarsi che il tavolino elettronico del microscopio abbia spazio sufficiente per muoversi e non urtare le camere degli elettrodi. Assicurarsi che le altezze medie della superficie siano bilanciate e alla stessa altezza tra quelle dei dispositivi e delle camere degli elettrodi.
      NOTA: La superficie media nei pozzetti del dispositivo, dove si trova la regione del tessuto (Figura 1C), ha un impatto significativo sull'imaging in campo chiaro e a contrasto di fase. Il menisco causerà una messa a fuoco indesiderata della luce. Assicurarsi che la superficie del terreno sia piana sull'orlo del pozzetto, ma si noti che l'evaporazione media nella camera delle celle vive porterà alla distorsione di questa superficie piana dopo un po' di tempo. Per ovviare a questo problema, una soluzione è quella di posizionare un vetrino coprioggetti piatto a contatto con la superficie media per appiattire questa superficie. Questo vetrino coprioggetti dovrebbe avere un'area più piccola rispetto al pozzetto in modo da non ostruire lo scambio di gas, che è importante per la crescita cellulare. Un'altra opzione è quella di stratificare olio minerale per colture cellulari sul terreno.
    3. Configura il software.
      1. Scegli obiettivi 10x o 20x per l'imaging di interi tessuti con un microscopio a epifluorescenza e obiettivi 30x (WD 0,8 mm, NA 1,05) per l'imaging confocale a risoluzione più elevata.
      2. Per l'imaging dell'intero tessuto, scegliere più posizioni per coprire l'area rettangolare nella regione del tessuto (Figura 1A, ad esempio, 5 righe per 5 colonne, la riga centrale che copre la fessura, mentre le altre al di fuori della fessura). Scegliere i canali fluorescenti e di campo chiaro in base alle linee cellulari utilizzate nella parte risultante (canale 488 per la fluorescenza verde e canale 561 per la fluorescenza rossa). Scegli un intervallo di tempo di 1 ora per ridurre la fototossicità in questo esperimento di imaging a lungo termine per un massimo di pochi giorni.
        NOTA: Altre lenti dell'obiettivo, come la 4x, possono essere scelte se è necessaria una visione più ampia dell'intero tessuto.
  3. Stimolazione elettrica
    1. Controllare il numero di dispositivi, la resistenza relativa del dispositivo e la corrente elettrica target di ciascun dispositivo. Decidi la corrente elettrica totale da erogare per alcune ore fino a una settimana nella configurazione generale.
    2. Genera un segnale elettrico in modalità pinza amperometrica. Per 3 dispositivi con la stessa resistenza del canale, con un gruppo di controllo (nessuna corrente elettrica, clip del tubo fissata), una condizione di corrente apicale-basale (AtB) e una condizione di corrente basale-apicale (BtA) (Figura 1D), fornire una corrente totale di 20 μA con un misuratore di sorgente. Ciò porta a 10 μA forniti per ogni dispositivo con una densità di corrente stimata di ~10 μA/cm2 che è fisiologicamente rilevante (maggiori dettagli in discussione).
      NOTA: La tensione totale è di circa decine di millivolt, a seconda della lunghezza del tubo Tygon. Tale corrente elettrica può essere fornita continuamente per alcuni giorni fino a una settimana. L'indicatore rosso fenolo cambierà colore nelle camere degli elettrodi (più acido nella camera con l'elettrodo positivo), ma non nell'incubatore da palco, che è ben calibrato. Le cellule rimarranno sane finché le condizioni delle cellule vive saranno ben mantenute. I ricercatori possono cambiare il mezzo nell'incubatore a tavolino una volta ogni due giorni e il mezzo nelle camere degli elettrodi una volta ogni pochi giorni. Fissare le clip dei tubi quando si cambiano le camere degli elettrodi per evitare il trabocco del fluido. Come accennato nel passaggio 3.1.1, ricordarsi di avere un dispositivo vuoto per coprire lo spazio del supporto. Ciò garantisce che la camera delle celle vive sia nelle condizioni adeguate.

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Risultati

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Tutti i risultati qui presentati sono adattati dalla precedente pubblicazione4; Per maggiori dettagli, fare riferimento a questa pubblicazione.

Questo protocollo consente l'applicazione di una corrente ionica esterna o di un campo elettrico perpendicolare al piano delle cellule o dei tessuti. Questa stimolazione elettrica perturba la differenza di potenziale elettrico transepiteliale endogena (TEPD) e consente di studiare il ruolo della TEPD nel governare il comportamen...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo fornisce passaggi dettagliati e logica di progettazione per fabbricare un nuovo dispositivo microfluidico per eseguire esperimenti di perturbazione del potenziale elettrico transepiteliale e per studiare gli effetti bioelettrici attraverso l'imaging di cellule vive e metodi di meccanobiologia. L'importanza di questo metodo è evidente se confrontata con altri metodi correlati. Ad esempio, un metodo correlato utilizza un semplice chip microfluidico con un design a canale ...

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Dichiarazioni

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Assicurati che tutti gli autori abbiano divulgato tutti i conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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XJ, PX, FF e TBS riconoscono le utili discussioni con il Dr. Xumei Gao, Xinru Yu e altri membri del gruppo del Laboratorio di Biofisica dei Tessuti. Ringraziamo la Customized Technology Service Facility (CTSF) della Westlake University per l'assistenza fornita con il nostro disegno schematico. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Westlake Education Foundation, dal Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine e dal Research Center for Industries of the Future (RCIF) della Westlake University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1x DPBSGibco14190144
3-(trimetossisilil)metacrilato di propile, TPMSigma2530850Conservare sotto azoto dopo l'apertura.
Provetta Falcon da 50 mLCorning430829Praticare 4 fori nel tappo della provetta Falcon da 50 mL, per consentire all'elettrodo e al tubo di passare attraverso il tappo e immergerlo nel fluido. Per un set di dispositivi microfluidici, sono necessari almeno 2 tappi.
Acido aceticoSinopharm10000208
Soluzione di acrilammide, 40%Sigma79061Tossico
Pompa pneumaticaLaboratorio OKOOKO-APComponente dell'incubatore da tavolo per microscopio
Persolfato di ammonio, APSAladdinA112447
Cartuccia--La cartuccia è realizzata su misura e il design si riferisce a materiale supplementare. La materia prima è PC Makrolon 2858 Medical Grade, e qui potete trovare maggiori dettagli: https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US
Clip--Robert Clip, per tubi  di diametro esterno 4,5 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&spm=a21xtw.29978518.0.0&skuId=3344063585144
Collagene ICorning354236
DI Milli-Q acquaMilli-Q-
Terreno di coltura Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM (glucosio alto)Gibco11965092DMEM++ è DMEM con un ulteriore 10%  FBS (Sigma-Aldrich) e 100  unità/mL Penicillina-Streptomicina (Gibco).
Gabbia nera per recinzioneLaboratorio OKOH201Componente dell'incubatore da tavolo per microscopio
Microscopio invertito a epifluorescenzaOlimpoIX83
Etanolo assolutoSinopharm10009218
Siero fetale bovinoSigmaF8318
Perline fluorescenti, 0,1 μ L, rosso (580/605)TermoF8801
Camera a gasLaboratorio OKOH201-PRIOR-SP200/400/600Componente dell'incubatore da tavolo per microscopio
Miscelatore manuale a gasLaboratorio OKO2GF-MISCELATOREComponente dell'incubatore da tavolo per microscopio
GeneticinaGibco10131027GFP– actina e H1– GFP MDCK è stato mantenuto utilizzando terreni integrati con 0,5  mg/mL di geneticina (Gibco) per sostenere la loro espressione genica
HEPESSigma736459
IsopropanoloSinopharm80109218
Salviette KimwipesKimberly-Clark ProfessionistaLH-70155Tergicristallo da laboratorio
Vite più lunga--Vite a croce a croce tonda nichelata, M3 x 10 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Connettore microfluidico--Raccordo diritto in polipropilene, 1/16"-10-32UNF. https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=16&detail_redpacket_pop=true&id=555839592609<k2=1752310108435i7ldxj7ekdgu9qhnphlmj&ns=1&priceTId=2150470617523101021033708e1a4b&query=10-32unf%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E7%9B%B4%E9%80%9A%E6%8E%A5%E5%A4%B4%20%E5%A1%91%E6%96%99%E5%A4%96%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E6%8E%A5%E5%A4%B4&skuId=3600497427939&spm=a21n57.1.hoverItem.1&utparam=%7B%22aplus_abtest%22%3A%2245243a364caf5527e8392ded0656451a%22%7D&xxc=taobaoSearch
Porta piastre multipozzettoLaboratorio OKOH201-MW-HOLDER-NZ500Componente dell'incubatore da tavolo per microscopio
N',N'-metilenbisacrilammide, 2%Sigma110269Tossico
NOA 73Prodotti Norland17-345Adesivo a polimerizzazione UV
Penicillina-streptomicina, PS (10.000 U/mL)Gibco15140122
Piastra di Petri (150 mm e acuta; 25 mm)Corning430599Resistere ad almeno 80 gradi C per 2 h
Utensile Pico PlasmaDiener Electronic GmbH + Co. KGPico PlasmaPer il trattamento al plasma O2
Pulitore al plasmaHarrick PlasmaPDC-002Per il trattamento al plasma dell'aria
Piatto in plastica (diametro 60 mm, altezza 15 mm)Nido705001
Elettrodi di platinoTianjin Aida HengshengPunto 005Diametro 0,5 mm, lunghezza 37 mm 
Rain-X Vetro Originale IdrorepellenteITW Prodotti Chimici800002242
Vetrino coprioggetti rettangolareMarienfeld0107222  1,5 ore, 24 e acuto; 50 mm2, 170 μ m di spessore
Vetrino coprioggetti rotondo in vetroMarienfeld0111500  1,5H, diametro rotondo 10 mm
Vite più corta--Vite a croce a croce tonda nichelata, M3 x 4 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Sulfo-SANPAH, senza pesoTermoCodice: A35395Soluzione madre SS: 20 mg/mL in DMSO anidro, 2 μ L per ciascuno; Soluzione di lavoro SS: 0,5 mg/mL SS in HEPES (0,1 M, pH 7,4).
SYLGARD 184 Kit di elastomeri siliconiciDow CorningH052KCM147Il prodotto finale è il polidimetilsilossano, PDMS. Questo kit include la resina PDMS di base e l'agente reticolante.
Unità di temperaturaLaboratorio OKOH201-T-UNIT-BLComponente dell'incubatore da tavolo per microscopio
Tetrametiletilendiammina, TEMEDSigma110189Tossico
Touch Screen DisplayLaboratorio OKOOKO-TOUCHComponente dell'incubatore da tavolo per microscopio
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil-1-triclorosilanoSigma78560459
Tripsina-EDTA (0,25%)Gibco25200072
Tubi TygonTygonAJK00002Diametro esterno (OD) = 3,2 mm, Diametro interno (ID) = 1,6 mm
UltrasuoniSupmileKD-300DE
Macchina di polimerizzazione UV LEDGHUVGHS-MFLGSorgente luminosa UV-LED, gamma di emissione: 363 370 nm, densità di potenza massima: 230 mW/cm2
Modulo di umidificazione senza vibrazioniLaboratorio OKOHM-VFComponente dell'incubatore da tavolo per microscopio
VisualizzaVisitron Systems GmbH-Articoli più morbidi per l'imaging
Strato di wafer1Università Nazionale di Singapore, impianto di microfabbricazione dell'istituto di meccanobiologia-Il wafer è realizzato su misura e il design si riferisce a materiale supplementare.
Strato di wafer2Università Nazionale di Singapore, impianto di microfabbricazione dell'istituto di meccanobiologia-Il wafer è realizzato su misura e il design si riferisce a materiale supplementare.

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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