Articolo metodologico

Dissezione dei tessuti craniofacciali di pesce zebra dopo colorazione con blu di Alcian

DOI:

10.3791/68900

⸱

12 settembre 2025

 , 
1Tata Institute of Fundamental Research

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo qui descritto presenta una procedura semplice e facile da seguire per la colorazione e la dissezione delle cartilagini craniofacciali in una larva di pesce zebra di 5 giorni. Può essere utilizzato per studiare l'anatomia, la forma e le dimensioni di queste strutture in varie condizioni di sviluppo.

Abstract

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Il pesce zebra, data la sua trasparenza ottica, è un ottimo modello di vertebrato per studiare i meccanismi con cui si formano le cartilagini craniofacciali nell'embrione. Le cartilagini craniofacciali possono essere classificate a grandi linee in due gruppi, il neurocranio e il viscerocranio, che a loro volta possono essere suddivisi in numerosi gruppi di cartilagine necessari per sostenere il cervello e costituire l'alimentazione e l'apparato respiratorio, tra gli altri. Questo protocollo descriverà prima una procedura di colorazione semplice e consolidata nel pesce zebra per visualizzare questi gruppi di cartilagine, seguita da una metodologia per sezionare e separare il neuro e il viscerocranio. Da queste dissezioni si possono facilmente ottenere semplici metriche di forma e dimensioni, e in questo protocollo questo è dimostrato per il palato, che fa parte del neurocranio anteriore, un tessuto spesso colpito nella maggior parte dei disturbi craniofacciali nell'uomo. Il protocollo può essere replicato in modo semplice anche in contesti con risorse limitate, fornendo così un prezioso strumento educativo per gli studenti universitari per essere introdotti alla morfologia craniofacciale.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cartilagine craniofacciale nei vertebrati emerge da una popolazione cellulare multipotente chiamata cellule della cresta neurale cranica1. Queste cellule vengono prima specificate nei margini dorsali della placca neurale negli embrioni precoci, che poi migrano a grandi distanze per raggiungere la regione craniofacciale e gli archi faringei prima di differenziarsi 2,3. I meccanismi di segnalazione che guidano questa migrazione e differenziazione sono in gran parte conservati tra i vertebrati 4,5. Nonostante ciò, l'organizzazione, le dimensioni e la forma dei singoli elementi della cartilagine sono distinti tra le specie, dando origine a diverse morfologie craniofacciali6. Il pesce zebra, in particolare, è emerso come un potente sistema modello per studiare la morfogenesi craniofacciale, data la natura trasparente degli embrioni fino agli stadi larvali. Utilizzando semplici procedure di colorazione per marcare la cartilagine, la morfologia di molte strutture craniofacciali nel pesce zebra è stata caratterizzata sotto diverse perturbazioni delle vie di segnalazione 7,8,9 e quando embrioni o larve sono esposti a inquinanti comuni presenti nell'ambiente10. La colorazione blu di Alcian qui descritta per marcare la cartilagine comporta l'uso di condizioni non acide standardizzate da Walker e Kimmel11, che sono state successivamente utilizzate da molti laboratori di zebrafish che lavorano sullo sviluppo craniofacciale 5,12,13,14,15,16,17,18,19 , compresa la descrizione dell'uso nelle scuole superiori20. La colorazione priva di acidi preserva intatte le strutture ossee, consentendo di colorare la cartilagine e le ossa utilizzando rispettivamente il blu di Alcian e il rosso di alizarina. Tuttavia, manca un protocollo dettagliato per la colorazione e per l'esecuzione di una dissezione precisa delle cartilagini craniofacciali, in particolare per aiutare tali studi da intraprendere in contesti con risorse limitate.

Anche se la struttura scheletrica facciale nel pesce zebra adulto è piuttosto complessa, costituita da 43 ossa derivate dalla cartilagine21, la cartilagine craniofacciale in una larva a 5 giorni dalla fecondazione (dpf), che ha appena acquisito la capacità di nutrirsi, è relativamente semplice e può essere suddivisa in un neurocranio dorsale e un viscerocranio ventrale4. Queste strutture sostengono il cervello, contribuiscono all'apparato alimentare e danno origine alle cartilagini di supporto per i tessuti branchiali. Il protocollo qui descritto consentirà di colorare le cartilagini di zebrafish con il blu di Alcian, seguito da una procedura dettagliata per sezionare il neuro e il viscerocranio in strutture separate, che alla fine consentirà un'attenta caratterizzazione della forma e delle dimensioni delle varie cartilagini in queste strutture. Ad esempio, misuriamo le dimensioni della regione anteriore del palato (tetto della bocca) chiamata placca etmoidale, che è una parte del neurocranio.

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Protocollo

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Le procedure di mantenimento e sperimentazione del pesce zebra utilizzate in questo studio sono state approvate dal comitato istituzionale per l'etica degli animali, vedi riferimento TIFR/IAEC/2023-1.

1. Preparazione del reagente

  1. E3 media:
    1. Preparare 50 volte il brodo 1 mescolando 3,25 g di sodio fosfato bibasico (0,458 mM Na2HPO4), 0,29 g di fosfato monobasico di potassio (0,042 mM KH2PO4), 11,93 g di cloruro di sodio (4,084 mM NaCl) e 0,48 g di cloruro di potassio (0,128 mM KCl) in 1 litro di acqua distillata.
    2. Preparare 50x brodo 2 mescolando 2,43 g di cloruro di calcio (0,33 mM CaCl2) e 4,07 g di solfato di magnesio (0,33 mM MgSO4) in 1 L di acqua distillata.
    3. Per preparare 500 mL di 1 terreno E3 a 480 mL di acqua distillata, aggiungere 10 mL ciascuno di stock 1 e 2 (pH = 7,4).
      NOTA: Indossare guanti durante la preparazione di queste soluzioni.
  2. 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato):
    1. Preriscaldare 100 mL di 1x PBS a 68 °C. Aggiungere 4 g di PFA e incubare la soluzione a 68 °C mescolando periodicamente fino a completa dissoluzione del PFA.
      NOTA: Indossare guanti e una maschera durante la preparazione di questo reagente, preferibilmente sotto una cappa aspirante poiché il PFA è altamente tossico.
  3. Soluzione di MS-222 allo 0,05% (comunemente nota come tricaina):
    1. Preparare il 4% di brodo di tricaina in E3 e conservare a 4 °C. Per preparare 10 ml di brodo di tricaina, aggiungere 0,40 g di MS-222 in 7 ml di E3. Agitare delicatamente la provetta contenente la soluzione per miscelare e portare il volume a 10 ml. Per ottenere 50 mL di soluzione di tricaina allo 0,05%, aggiungere 625 μL dello stock al 4% a 49,375 mL di E3.
      NOTA: Indossare guanti e una maschera durante la preparazione di questo reagente.
  4. Soluzione madre di blu di Alciano allo 0,4% in etanolo al 70%
    1. Per preparare 2 mL della soluzione madre, sciogliere 8 mg di blu di Alcian in 1 mL di etanolo al 50%. Riscaldare la soluzione a 37 °C per 15-20 min mescolando periodicamente per scioglierla. Una volta che la macchia si è sciolta, preparare la soluzione al 70% di etanolo aggiungendo 900 μL di etanolo al 100% e 100 μL di acqua distillata.
      NOTA: La soluzione madre può essere conservata a temperatura ambiente per un massimo di 2 settimane.
  5. Soluzione colorante -- 0,02% di blu di Alciano, 200 mM di cloruro di magnesio (MgCl2) e 70% di etanolo
    1. Per preparare 5 ml di soluzione di colorante blu di Alcian, aggiungere 1 mL di 1 M MgCl2, 3,5 mL di etanolo al 100% e 250 μL di brodo di blu di Alcian allo 0,4% (8 mg di blu di Alcian in 2 mL di etanolo al 70%) a 250 μL di acqua e mescolare bene.
      NOTA: Preparare la soluzione colorante fresca per ottenere i migliori risultati di colorazione.
  6. Soluzione di candeggina:
    1. Miscelare volumi uguali di perossido di idrogeno al 3% (H2O2) e idrossido di potassio al 2% (KOH). Per preparare 2 ml di soluzione di candeggina, mescolare 1 ml di perossido di idrogeno al 3% e 1 ml di idrossido di potassio al 2%.
      NOTA: Preparare questa soluzione prima di iniziare questo passaggio. Poiché H2O2 è sensibile alla luce, proteggerlo il più possibile dall'esposizione alla luce. Indossare i guanti durante la manipolazione di H2O2 e KOH.
  7. Soluzione I: 20% glicerolo + 0,25% KOH
    NOTA: Poiché il glicerolo è altamente viscoso, pipettare con cura. Indossare i guanti durante la preparazione di queste soluzioni.
    1. Per preparare 5 mL di soluzione I, aggiungere 2 mL di glicerolo al 50% e 625 μL di KOH al 2% a 2,375 mL di acqua e mescolare bene.
  8. Soluzione II: 50% glicerolo + 0,25% KOH
    1. Per preparare 5 mL di soluzione II, aggiungere 3,570 mL di glicerolo al 70% e 625 μL di KOH al 2% a 805 μL di acqua e mescolare bene.
  9. Soluzione di conservazione: 50% glicerolo + 0,1% KOH
    1. Per preparare 5 mL di soluzione di conservazione, aggiungere 3,570 mL di glicerolo al 70% e 250 μL di 2% KOH a 1,180 mL di acqua e mescolare bene.
  10. 3% agarosio
    1. Sciogliere 3 g di agarosio in 100 ml di acqua distillata. Microonde fino a quando la soluzione diventa limpida.
  11. 0,1% PBST (0,1% Tween 20 in 1x PBS)
    1. Per fare 1 litro di 1x PBS, aggiungere 8 g di NaCl, 0,20 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4 e 0,24 g di KH2PO4 in 1.000 ml di acqua distillata. Mescolare la soluzione e regolare il pH a 7,4. Per produrre 500 ml di PBST allo 0,1%, aggiungere 5 ml di Tween al 10% da 20 a 495 ml di PBS 1x.
  12. 0,50 μg/mL di soluzione DAPI
    1. Preparare 10 mg/mL di brodo DAPI in 1x PBS. Per ottenere 10 mL di soluzione DAPI da 0,50 μg/mL, aggiungere 0,50 μL di stock a 10 mL di 1x PBS e agitare energicamente per assicurarsi che DAPI si dissolva completamente.
      NOTA: Indossare i guanti durante la preparazione di queste soluzioni. Proteggi DAPI dalla luce in quanto è sensibile alla luce. Il brodo DAPI può essere conservato a 4 °C per più di un anno.

2. Raccolta di embrioni

  1. Sistemare coppie di pesce zebra maschio e femmina in vasche di riproduzione la sera prima che siano necessari gli embrioni, con il pesce maschio e femmina separati da barriere.
  2. Rimuovi le barriere la mattina successiva e raccogli gli embrioni entro 15-20 minuti dalla rimozione delle barriere.
    NOTA: La tempistica della rimozione della barriera è utile nella stadiazione di embrioni e larve di zebrafish.
  3. Allevare gli embrioni a 28,5 °C fino a raggiungere i 5 dpf.
    NOTA: Assicurarsi di sostituire il supporto E3 con un nuovo lotto di E3 preriscaldato a 28,5 °C una volta ogni 2 giorni.

3. Colorazione blu alciano

NOTA: Indossare i guanti durante l'esecuzione di questo esperimento

  1. Anestetizzare 20-25 larve di pesce zebra di 5 giorni utilizzando tricaina allo 0,05% in una provetta da microcentrifuga (MCT) da 2 ml.
  2. Dopo che le larve hanno smesso di muoversi, il che in genere richiede ~4-5 minuti, rimuovere l'anestetico e fissarle in 1,5 ml di PFA al 4% a temperatura ambiente (RT) su un bilanciere a 60 giri/min per 2 ore.
  3. Rimuovere la maggior parte possibile del fissativo utilizzando una pipetta e aggiungere 1,5 ml di etanolo al 50% al campione. Incubare per 10 minuti mentre si oscilla a 60 giri/min a RT.
  4. Rimuovere la maggior quantità possibile di etanolo utilizzando una pipetta e aggiungere 1,5 mL della soluzione di colorante blu Alcian.
  5. Incubare le larve fissate nella soluzione colorante per 18-20 ore su un bilanciere a 60 giri/min a RT.
    NOTA: L'incubazione per un periodo di tempo più o meno lungo può portare a sottocolorare o sovracolorare rispettivamente alcune regioni della cartilagine. Qui, 18-20 ore di colorazione sembravano funzionare meglio per visualizzare chiaramente il neuro e il viscerocranio di una larva di 5 giorni.
  6. Rimuovere la soluzione colorante, aggiungere 1,5 ml di acqua distillata e incubare per 1-2 minuti su un bilanciere a RT.
    NOTA: La colorazione può essere interrotta in questa fase per visualizzare i confini cellulari nelle cartilagini sezionate. Tuttavia, uno svantaggio dell'interruzione del protocollo di colorazione in questa fase senza eseguire le successive fasi di chiarimento è che i confini del neuro e del viscerocranio rimarranno ancora leggermente sfumati e diventa più difficile eseguire le dissezioni con precisione.
  7. Aggiungere 1 mL della soluzione di candeggina al campione e incubare per 20 minuti a RT all'aperto senza alcun coperchio sulla piastra o sui pozzetti.
    NOTA: Non coprire gli MCT durante questa fase poiché la reazione tra il perossido di idrogeno e l'idrossido di potassio produce ossigeno gassoso, che potrebbe causare lo sgancio del coperchio se chiuso.
  8. Rimuovere la soluzione di candeggina ed eseguire i seguenti passaggi per la pulizia dei tessuti.
    1. Aggiungere 1,5 mL di soluzione I al campione e tenere su un bilanciere a 60 giri/min per 40 minuti a RT.
    2. Rimuovere la soluzione I e aggiungere 1,5 mL di soluzione II al campione e tenere su un bilanciere a 60 giri/min per 2 ore a RT.
      NOTA: Le fasi di pulizia aiutano a rimuovere la colorazione in eccesso, migliorando la chiarezza ottica dei campioni e quindi aiutando a eseguire le dissezioni in modo efficiente. Maneggiare i campioni con cura durante il cambio delle soluzioni, poiché qualsiasi danno può influire sulla futura analisi della loro morfologia.
  9. Rimuovere la soluzione II e aggiungere 1,5-2 ml di soluzione di conservazione. A causa della presenza di glicerolo, i campioni colorati affondano gradualmente sul fondo entro 10 minuti.
    NOTA: I campioni colorati possono essere conservati a 4 °C per più di un anno.

4. Dissezione dello scheletro craniofacciale

  1. Sciogliere la soluzione di agarosio al 3% in un forno a microonde fino a quando la soluzione diventa limpida.
    NOTA: Non surriscaldare poiché la soluzione può fuoriuscire dal pallone. Tenete sotto controllo la soluzione durante l'esecuzione di questo passaggio.
  2. Rivestire una piastra di Petri da 90 mm con agarosio al 3% versando l'agarosio fuso fino a coprire un terzo della profondità della piastra di Petri e lasciandola solidificare. Le dissezioni saranno eseguite in questa capsula di Petri.
    NOTA: Le piastre di Petri con rivestimento di agarosio possono essere preparate con una settimana di anticipo e conservate a 4 °C. Il rivestimento di agarosio fornisce un substrato più morbido su cui è possibile eseguire le dissezioni senza danneggiare la pinza.
  3. Pulisci le pinze da utilizzare con etanolo al 70% e puliscile con un pezzo pulito di carta velina da laboratorio standard.
  4. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire 3-4 larve colorate insieme a 0,5 ml di soluzione di conservazione nella capsula di Petri rivestita di agarosio.
    NOTA: La soluzione di archiviazione garantisce una maggiore chiarezza ottica per l'esecuzione delle dissezioni rispetto all'E3.
  5. Orientare una larva colorata sul lato laterale (Figura 1A) e raschiare accuratamente il tuorlo dal corpo della larva usando la pinza
    NOTA: La Figura 1B mostra un embrione in cui il tuorlo è stato rimosso. È buona norma trasferire l'embrione raschiato-tuorlo in una nuova capsula di Petri prima di procedere con ulteriori fasi di dissezione, in modo che la massa di tuorlo appiccicosa che galleggia in giro non interferisca con la dissezione.
  6. Dopo che il tuorlo è stato rimosso, tieni la larva per la regione della coda con una pinza e usa l'altra per rimuovere con cura gli occhi.
    NOTA: La figura 1C mostra un embrione con il tuorlo e gli occhi rimossi. Gli occhi devono essere rimossi con cautela poiché la loro vicinanza allo scheletro craniofacciale può interferire con la loro dissezione.
  7. Usando il forcipe, tirare e pizzicare con cautela il cervello e altri tessuti dorsali al neurocranio. Tenere ferma la larva con un paio di pinze e utilizzare l'altro paio di pinze per praticare un'incisione al centro (Figura 1C, freccia rossa), seguita da un pizzicamento dei tessuti (Figura 1D).
    NOTA: Durante l'esecuzione di questo passaggio, fare attenzione a rimuovere i tessuti più vicini alle regioni più anteriori del neurocranio, poiché la cartilagine potrebbe staccarsi con essi.
  8. Separare la testa della larva dal resto del corpo. La regione della testa dopo questo passaggio contiene principalmente il neurocranio e il viscerocranio attaccati l'uno all'altro in due punti, alle estremità anteriore e posteriore, insieme a pochi piccoli tessuti non colorati attaccati a queste strutture craniofacciali (Figura 1E).
    NOTA: È difficile rimuovere completamente i tessuti non colorati direttamente attaccati al neurocranio e al viscerocranio. Anche se saranno presenti alcuni tessuti residui, la loro presenza non influenzerà l'analisi della forma o delle dimensioni a valle poiché non sono colorati.
  9. Recidere con cura le due connessioni tra il neurocranio e il viscerocranio per separarle (Figura 1F, linee tratteggiate rosse). Vedere la Figura 2 per le immagini del neurocranio e del viscerocranio sia in embrioni intatti che sezionati.
  10. Su un vetrino pulito, aggiungere una o due gocce di glicerolo al 100%. Con l'aiuto di una pinza, trasferire con cura il neurocranio o il viscerocranio sezionato su questo vetrino. Usa una pinza per posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti su questi fazzoletti, assicurandoti che non si formino bolle, e sigilla il vetrino coprioggetti su tutti i vetrini con smalto per unghie.
    NOTA: Questi vetrini possono essere conservati a 4 °C per più di un anno senza perdere la macchia.

5. Quantificazione delle dimensioni della lastra etmoidale

  1. Acquisire immagini del palato utilizzando una fotocamera collegata allo stereomicroscopio (Figura 2D). In assenza di una fotocamera di livello scientifico, collegare uno smartphone standard allo stereomicroscopio per acquisire le immagini.
  2. Per la quantificazione, caricare l'immagine di un palato in FIJI22 e quindi utilizzare lo strumento linea per misurare la larghezza e l'altezza della piastra etmoidale in micron (vedere la Figura 3A-C) e determinare le dimensioni utilizzando la risoluzione in pixel della fotocamera.
  3. Disegna un contorno attorno alla piastra etmoidale e clicca su Analizza | Imposta le misure | area per ottenere l'area della lastra etmoidale (Figura 3D,E).

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Risultati

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Lo scheletro craniofacciale del pesce zebra è completamente cartilagineo entro 5 giorni dalla fecondazione (dpf) e quindi può essere colorato utilizzando il blu di Alciano, che è un colorante basico in grado di legarsi ai glicosaminoglicani presenti in abbondanza nelle cartilagini23. Ciò si traduce in una colorazione blu della cartilagine (Figura 1) in modo che possa essere distinta dagli altri tessuti presenti nella larva utilizzando uno stereomicroscopio standard di...

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Discussione

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Le malformazioni craniofacciali costituiscono la maggior parte di tutti i difetti congeniti nell'uomo, portando spesso alla mortalità infantile. Tuttavia, l'eziologia sottostante nella maggior parte delle anomalie craniofacciali rimane da chiarire25. Le strutture craniofacciali sono complesse in un dato vertebrato e, dal punto di vista dell'impostazione universitaria, il primo requisito è quindi quello di avere uno strumento educativo che fornisca agli studenti un...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi concorrenti da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Dr. Kalidas Kohale e il suo team per la manutenzione dell'impianto ittico. SRN riconosce il sostegno finanziario del Dipartimento per l'Energia Atomica (DAE), Govt. dell'India (Project Identification no. RTI4003, DAE OM n. 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 dell'11.02.2020), il programma Max Planck Society Partner Group (M.PG. A MOZG0010) e l'assegno di ricerca per l'avvio di attività scientifiche e ingegneristiche (SRG/2023/001716). Ringraziamo la dottoressa Shweta Verma del laboratorio per i suoi commenti perspicaci. Ringraziamo Swetha Nagarajan e Upal Chatterjee per l'aiuto nella realizzazione delle figure per il manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AgarosioLonza bioscienze50004Per il rivestimento di piastre di Petri
Blu Alciano 8G Sigma-AldrichVisualizzazione del materiale A3157Per colorare le cartilagini
Cloruro di calcio diidratoSigma-Aldrich12022Per fare tamponi
Macchina fotograficaOlimpoDP28Per l'acquisizione di immagini
DAPIRoche Scienze della Vita10236276001Per l'etichettatura dei nuclei
EtanoloHoneywell32221Solvente per colorazione blu alciana
FIGIVersione: ImageJ 1.54f
ForcipeDumontDumontPer eseguire dissezioni
GliceroloMP biomedicali193996Per effettuare lavaggi e montare campioni 
Perossido di idrogenoMP biomedicali194057Per fare la soluzione di candeggina
Cloruro di magnesio esaidratoSARD BioscienzeSBRC0217Per fare tamponi
Solfato di magnesio eptaidratoSigma-AldrichVisualizzazione del materiale M2773Per fare tamponi
MS-222 (Tricaina)Sigma-AldrichCodice: A5040Per l'anestesia delle larve
Cloruro di potassioSigma-AldrichP9541Per fare tamponi
Idrossido di potassioSigma-Aldrich484016Per fare tamponi
Fosfato di potassio monobasicoSigma-AldrichP0662Per fare tamponi
Cloruro di sodioSigma-AldrichS3014Per fare tamponi
Fosfato di sodio bibasicoSigma-Aldrich71640Per fare tamponi
StereoscopioOlimpoSZX61Per eseguire dissezioni
Interpolazione-20HIMEDIATC287Detergente, utilizzato per la permeabilizzazione delle cellule

Riferimenti

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