Questo studio esamina le variazioni circadiane nel rilascio di fattori di crescita dalla fibrina ricca di piastrine (PRF) ed esplora le correlazioni con i livelli di cortisolo, con l'obiettivo di ottimizzare i tempi delle procedure rigenerative basate su PRF.
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Articolo di ricerca
Valutazione della variazione circadiana nei fattori di crescita della fibrina ricca di piastrine: uno studio pilota
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fibrina ricca di piastrine (PRF) ha ampie applicazioni cliniche in odontoiatria, in particolare nella rigenerazione dei tessuti molli e duri, nella guarigione dell'alveolo estrattivo, nel trattamento dei difetti parodontali, nell'aumento del seno mascellare e nelle procedure mucogengivali. Il PRF è un biomateriale derivato dalle piastrine, ricco di fattori di crescita, preparato tramite un protocollo di centrifugazione in un'unica fase. Questo studio mirava a valutare se i fattori di crescita derivati da PRF mostrano variazioni circadiane tra le ore mattutine e serali. Hanno partecipato venti volontari sani, ognuno dei quali ha fornito sei campioni di sangue venoso, tre alle 08:00 e tre alle 20:00. Da ogni punto temporale, è stata utilizzata una provetta per l'emocromo completo, una per l'analisi del cortisolo sierico e una per la preparazione del PRF (centrifugata a 708 x gper 12 minuti). I fattori di crescita (IGF-1, PDGF, FGFR, VEGF, TGFβ-1) nella PRF sono stati misurati a 24 ore e 72 ore utilizzando ELISA. I loro livelli sono stati confrontati tra punti temporali e correlati con i livelli sierici di cortisolo. I livelli di FGFR erano significativamente più alti a 72 ore rispetto a 24 ore nei campioni serali. Tuttavia, non sono state riscontrate differenze significative per IGF-1, PDGF, VEGF o TGFβ-1 tra la mattina e la sera. I livelli di cortisolo erano correlati negativamente con PDGF a 72 ore nei campioni mattutini e con IGF-1 a 72 ore nei campioni serali; Tuttavia, non sono state osservate altre correlazioni significative. Questi risultati suggeriscono che la tempistica della raccolta del sangue non influenza in modo significativo il contenuto del fattore di crescita PRF, indicando flessibilità nei protocolli clinici per quanto riguarda la tempistica del campione.
Introduzione
La fibrina ricca di piastrine (PRF) è un concentrato piastrinico di seconda generazione comunemente usato in odontoiatria rigenerativa grazie alla sua origine autologa, alla facilità di preparazione e al contenuto biologicamente attivo1. Formata dalla centrifugazione di sangue intero senza anticoagulanti, la PRF fornisce una matrice di fibrina ricca di piastrine e leucociti che secernono fattori di crescita come il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF), il fattore di crescita trasformante-beta 1 (TGF-β1), il fattore di crescita insulino-simile-1 (IGF-1), il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) e il recettore del fattore di crescita dei fibroblasti (FGFr). Queste biomolecole svolgono un ruolo centrale nella proliferazione cellulare, nell'angiogenesi, nel rimodellamento della matrice extracellulare e nella rigenerazione dei tessuti2. Rispetto al plasma ricco di piastrine (PRP), che richiede anticoagulanti e attivazione esogena, il PRF viene prodotto attraverso un processo in un'unica fase, privo di anticoagulanti, che produce un'impalcatura fisiologica di fibrina con leucociti e piastrine intrappolati. Questa architettura supporta un rilascio più lento e prolungato di fattori di crescita e citochine, migliorando potenzialmente la stabilità della ferita e la riparazione precoce dei tessuti, riducendo al contempo la complessità e i costi di manipolazione 1,2. Inoltre, l'assenza di anticoagulanti e attivatori riduce al minimo la variabilità correlata alla manipolazione e può preservare meglio il comportamento piastrinico nativo, offrendo vantaggi pratici per l'uso alla poltrona e la standardizzazione tra gli operatori2.
Nonostante il suo ampio uso clinico, le dinamiche temporali dei componenti bioattivi della PRF rimangono poco comprese. Il ritmo circadiano, un ciclo biologico intrinseco di 24 ore, influenza vari sistemi fisiologici, tra cui la funzione immunitaria, la secrezione ormonale e i parametri ematologici 3,4. Il cortisolo, l'ormone circadiano primario, raggiunge il picco al mattino presto e diminuisce gradualmente durante il giorno5. È importante sottolineare che gli studi hanno dimostrato che l'attività piastrinica, la capacità di aggregazione e la conta possono anche essere modulate da meccanismi circadiani, con implicazioni per la coagulazione e la guarigione delle ferite6.
Poiché la PRF deriva direttamente dal sangue periferico, la tempistica circadiana del prelievo del sangue potrebbe potenzialmente influenzare lo stato di attivazione piastrinica e il successivo rilascio di fattori di crescita durante la polimerizzazione della fibrina. Sebbene le variazioni diurne della conta piastrinica e dei fattori di crescita nel plasma ricco di piastrine siano state precedentemente analizzate da Aoto et al.7, non ci sono studi che esaminino sistematicamente se il PRF preparato in diversi momenti della giornata mostri differenze misurabili nella composizione del fattore di crescita. Pertanto, questo studio pilota mira a indagare la variazione circadiana dei fattori di crescita derivati da PRF confrontando campioni raccolti al mattino e alla sera da individui sani. Inoltre, abbiamo valutato i livelli sierici di cortisolo in ogni momento e abbiamo esplorato le loro correlazioni con il rilascio del fattore di crescita PRF. La comprensione di tale variabilità temporale può aiutare a ottimizzare i protocolli clinici e contribuire alla standardizzazione dei trattamenti rigenerativi basati su PRF. L'ipotesi nulla di questo studio era che i tempi circadiani di raccolta del sangue non influenzano significativamente la concentrazione di fattori di crescita rilasciati dalla fibrina ricca di piastrine (PRF); tuttavia, sulla base della nota regolazione circadiana dell'attività piastrinica e della secrezione ormonale, è stato inizialmente ipotizzato che il momento della raccolta del sangue (mattina o sera) possa alterare il contenuto del fattore di crescita PRF. Da un punto di vista clinico, chiarire se il contenuto del fattore di crescita PRF è sensibile alla variazione circadiana è importante per la standardizzazione dei protocolli rigenerativi. Se il rilascio del fattore di crescita rimane sostanzialmente stabile durante il giorno, i medici possono essere rassicurati sul fatto che la tempistica della venipuntura potrebbe non influenzare sostanzialmente i risultati del trattamento, consentendo così flessibilità nella programmazione delle procedure. Al contrario, se emergono sottili differenze in fattori selezionati, come quelli coinvolti nell'angiogenesi o nella riparazione dei tessuti, i tempi di raccolta del sangue potrebbero essere ottimizzati nei casi in cui si desidera il massimo potenziale rigenerativo, ad esempio in condizioni di guarigione compromesse.
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Protocollo
Questo studio è stato condotto presso il Dipartimento di Parodontologia, Facoltà di Odontoiatria, Università Çukurova, Adana, Turchia, con la partecipazione di 20 volontari sani. Prima dell'inclusione, tutti i partecipanti sono stati informati sullo scopo, la metodologia e le procedure dello studio ed è stato ottenuto il consenso informato scritto. L'approvazione etica è stata concessa dal Comitato Etico per la Ricerca Clinica della Facoltà di Medicina dell'Università di Çukurova (Approvazione n.: 125/55, Data: 16.09.2022). Tutte le procedure, comprese le linee guida essenziali sulla biosicurezza per la manipolazione del sangue umano e le istruzioni per lo smaltimento dei rifiuti di materiali a rischio biologico e reagenti chimici, sono state eseguite in conformità con le linee guida NIH-CDC8. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Selezione dei partecipanti
I partecipanti inclusi nello studio erano individui sani di età compresa tra i 18 e i 25 anni, senza alcuna malattia sistemica nota e che hanno dimostrato un'adeguata collaborazione durante le procedure. Gli individui sono stati esclusi se avevano qualsiasi condizione sistemica, erano in gravidanza o in allattamento o stavano assumendo farmaci o agenti ormonali che potrebbero influenzare i parametri ematologici o ormonali.
2. Prelievo del sangue e assegnazione dei gruppi
Un totale di sei campioni di sangue venoso da 10 ml sono stati raccolti da ciascun partecipante, tre al mattino (08:00) e tre alla sera (20:00). Nello studio sono state utilizzate provette PRF sterili di vetro privo di additivi (10 mL). Nella sessione mattutina, la provetta 1 è stata utilizzata per l'emocromo completo (CBC), la provetta 2 per l'analisi del cortisolo sierico e la provetta 3 per la preparazione del PRF seguita dall'analisi dei fattori di crescita. Nella sessione serale, la provetta 4 è stata utilizzata per l'emocromo, la provetta 5 per l'analisi del cortisolo sierico e la provetta 6 per la preparazione del PRF e l'analisi dei fattori di crescita. In base al tempo di raccolta del sangue, i campioni sono stati assegnati in due gruppi: il gruppo 1 consisteva in PRF puro preparato da sangue mattutino (08:00) e il gruppo 2 consisteva in PRF puro preparato da sangue serale (20:00).
3. PRF preparazione
I campioni di sangue sono stati centrifugati a 708 x g per 12 minuti a temperatura ambiente utilizzando una centrifuga dotata di un rotore ad angolo fisso di 40° e provette di vetro da 10 mL. Il dispositivo utilizzato aveva un raggio del rotore regolabile tra 88 mm e 110 mm; In questo studio, è stato selezionato un raggio di 88 mm per standardizzare il protocollo. Durante la procedura non sono stati utilizzati anticoagulanti. Dopo la centrifugazione, le PRF risultanti sono state valutate macroscopicamente per garantire una corretta formazione, caratterizzata da una superficie liscia e omogenea, una forma elastica e cilindrica e una consistenza compatta e soda.
4. Analisi ELISA del fattore di crescita
I coaguli di PRF sono stati accuratamente separati dallo strato di globuli rossi utilizzando forbici sterili. Ogni coagulo è stato pesato e il terreno di coltura RPMI-1640 è stato aggiunto in un rapporto 1:1 basato sul peso (g = mL) al fine di standardizzare l'ambiente di incubazione in tutti i campioni e garantire una diffusione coerente dei fattori di crescita solubili dalla matrice PRF. Questo rapporto consente un'estrazione proporzionale in base alle dimensioni del coagulo, riducendo al minimo la variabilità delle concentrazioni dei fattori di crescita dovuta a masse di coagulo disuguali. I campioni sono stati incubati in un agitatore orbitale a 100 giri/min e 3 °C per 24 ore e 72 ore per promuovere una diffusione uniforme dei fattori di crescita dalla matrice PRF al terreno di coltura. Dopo l'incubazione, i surnatanti sono stati raccolti e conservati a -8 °C fino all'analisi. Le concentrazioni dei fattori di crescita sono state quantificate utilizzando kit ELISA commerciali, tra cui FGFR, VEGF, IGF-1, PDGF e TGF-β1, seguendo il protocollo di preparazione del produttore 9,10.
5. Passaggi ELISA
Gli standard e i campioni (100 μL ciascuno) sono stati aggiunti ai pozzetti e incubati a 3 °C per 90 minuti. I pozzi sono stati poi lavati tre volte con tampone di lavaggio. Successivamente, 100 μl di anticorpo marcato con biotina sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e incubati a 3 °C per 60 minuti, seguiti da tre lavaggi aggiuntivi. Quindi, sono stati aggiunti 100 μL di soluzione di perossidasi di rafano (HRP) e incubati a 3 °C per 30 minuti. Dopo altri tre lavaggi, sono stati aggiunti 100 μL di reagente substrato e incubati per 15 minuti. Infine, 50 μL di soluzione di arresto sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e l'assorbanza è stata misurata a 450 nm.
6. Analisi statistica
Le variabili categoriali sono state espresse come frequenze e percentuali, mentre i dati numerici sono stati presentati come media ± deviazione standard o mediana (minimo-massimo), a seconda dei casi. La normalità delle variabili numeriche è stata valutata utilizzando il test di Shapiro-Wilk. Le variabili che non soddisfacevano l'ipotesi di normalità, in particolare le concentrazioni dei fattori di crescita e i livelli di cortisolo, sono state analizzate utilizzando test non parametrici, tra cui il test del rango firmato di Wilcoxon per i confronti accoppiati e il coefficiente di correlazione dei ranghi di Spearman per le associazioni. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software IBM SPSS Statistics. Un valore p <0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Tutti i confronti sono stati condotti all'interno del soggetto sottoposto a controllo per la variabilità interindividuale.
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Risultati
Tutti i 20 partecipanti volontari (10 donne e 10 uomini, di età compresa tra i 18 e i 25 anni) hanno completato lo studio senza alcuna perdita di campione. I risultati completi dell'emocromo hanno confermato che i parametri piastrinici ed ematologici rientravano negli intervalli di riferimento normali in tutti i campioni, convalidando l'affidabilità dei preparati PRF.
Confronto dei parametri ematici tra mattina e sera
I livelli di cortisolo erano significativamente più alti...
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Discussione
Sulla base della nota regolazione circadiana dell'attività piastrinica e della secrezione ormonale, è stato inizialmente ipotizzato che il momento del prelievo del sangue (mattina o sera) possa alterare il contenuto del fattore di crescita PRF. Questo studio mirava a verificare se esiste una tale variazione temporale e, in caso affermativo, se è correlata ai livelli sierici di cortisolo e ai parametri ematologici. Lo studio è stato progettato come indagine pilota per esplorare l...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CENTRIFUGA | DUO | 913023410238 | |
| KIT ELISA | Test di precisione, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | IGF-1 (Codice prodotto:EH0165) | |
| KIT ELISA | Test di precisione, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | PDGF (N. catalogo:EH3531) | |
| KIT ELISA | Test di precisione, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | FGFR (N. catalogo:EH0715) | |
| KIT ELISA | Test di precisione, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | VEGF (N. catalogo:EH0327) | |
| KIT ELISA | Test di precisione, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | TGF-β 1 (Numero di catalogo: EH0287) | |
| Tubi PRF |  | 6370 |
Riferimenti
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