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Articolo metodologico

Istituzione e mantenimento di organoidi per il cancro alla prostata derivati da pazienti: un protocollo sperimentale dettagliato

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DOI:

10.3791/68912

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14 novembre 2025

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1Department of Urology, Jiangnan University Medical Center (Wuxi No. 2 People's Hospital), 2Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

In questo articolo

Sommario

L'eterogeneità del cancro alla prostata e la resistenza al trattamento rimangono sfide. Descriviamo un protocollo per la generazione di organoidi derivati da pazienti (PDO) che preservano le caratteristiche chiave del tumore parentale. Questo modello standardizzato supporta lo screening dei farmaci e i progressi della medicina di precisione.

Abstract

Il cancro alla prostata (PCa) è un tumore maligno altamente eterogeneo e una delle principali cause di mortalità correlata al cancro negli uomini, con sfide cliniche significative nell'affrontare la resistenza al trattamento e la progressione della malattia. I modelli preclinici esistenti, come le linee cellulari bidimensionali (2D) e gli xenotrapianti derivati da pazienti (PDX), hanno limitazioni nel ricapitolare fedelmente la complessità del PCa, tra cui l'eterogeneità del tumore, la segnalazione dipendente dal recettore degli androgeni (AR) e le interazioni microambientali. Per colmare questa lacuna, questo studio presenta un protocollo robusto e riproducibile per la creazione di organoidi derivati da pazienti (PDO) che preservano le caratteristiche genetiche, fenotipiche e istologiche dei tumori parentali. Questo metodo consente la coltura di organoidi sia da PCa localizzato che avanzato, fornendo un modello biologicamente rilevante per lo studio dei meccanismi della malattia, della risposta ai farmaci e della scoperta di biomarcatori. I risultati dimostrano la capacità del protocollo di generare organoidi da una varietà di campioni clinici, con applicazioni nello screening di farmaci ad alto rendimento e nella medicina di precisione. Offrendo un flusso di lavoro standardizzato che affronta le principali sfide tecniche, questo studio evidenzia l'importanza dei PDO come strumenti versatili per far progredire la ricerca sul cancro alla prostata e sviluppare strategie terapeutiche più efficaci.

Introduzione

Il cancro alla prostata (PCa) rimane uno dei tumori maligni più diffusi negli uomini in tutto il mondo, secondo solo al cancro del polmone nella mortalità correlata al cancro. Secondo recenti studi epidemiologici, l'incidenza globale del PCa è in costante aumento e si prevede che il numero di nuovi casi di cancro alla prostata aumenterà ogni anno da 1,4 milioni nel 2020 a 2,9 milioni entro il 20401. Nonostante i progressi nella diagnosi precoce e lo sviluppo di nuove terapie, tra cui la terapia di deprivazione androgenica (ADT) e gli agenti mirati, il cancro alla prostata rimane una sfida clinica significativa a causa della sua natura eterogenea e dell'inevitabile sviluppo di resistenza al trattamento, in particolare negli stadi avanzati2. Il carcinoma prostatico resistente alla castrazione (CRPC), che emerge dopo il fallimento dell'ADT, rappresenta una forma letale della malattia, caratterizzata da scarsi risultati di sopravvivenza e opzioni terapeutiche limitate3. Comprendere i meccanismi molecolari che guidano la progressione e la resistenza alla malattia è quindi fondamentale per identificare nuovi bersagli terapeutici e migliorare gli esiti dei pazienti.

Lo sviluppo di modelli preclinici che imitino accuratamente la complessità del cancro alla prostata umano è fondamentale per far progredire la ricerca in questo campo. Le colture cellulari 2D tradizionali, sebbene ampiamente utilizzate, non riescono a ricapitolare l'eterogeneità cellulare, l'architettura tumorale e il microambiente osservati in vivo4. Di conseguenza, l'utilità traslazionale di questi modelli è limitata, in particolare per lo studio della progressione tumorale, della resistenza ai farmaci e delle interazioni dinamiche tra le cellule tumorali e il microambiente tumorale5. Al contrario, gli xenotrapianti derivati da pazienti (PDX) e le colture di organoidi sono emersi come strumenti più sofisticati che colmano il divario tra le linee cellulari convenzionali e i tumori clinici 4,5,6.

I sistemi di coltura degli organoidi hanno rivoluzionato la modellizzazione del cancro. Queste strutture tridimensionali (3D) derivano dai tessuti dei pazienti e possono mantenere le caratteristiche istologiche, genomiche e fenotipiche del tumore originale 7,8,9,10. È importante sottolineare che gli organoidi del cancro alla prostata conservano le caratteristiche critiche dell'eterogeneità della malattia, tra cui la segnalazione AR, la resistenza al trattamento e l'instabilità genomica, rendendoli strumenti ideali per la ricerca traslazionale11. Rispetto ai modelli PDX, gli organoidi sono più convenienti, scalabili e suscettibili di manipolazione genetica, il che facilita lo screening dei farmaci ad alto rendimento, la scoperta di biomarcatori e gli studi funzionali. Le piattaforme di organoidi hanno già mostrato risultati promettenti in altre neoplasie, tra cui i tumori del colon-retto, della mammella e del pancreas, sottolineando il loro potenziale per l'oncologia personalizzata 4,12.

Tuttavia, la creazione e il mantenimento di organoidi per il cancro alla prostata (PCO) presenta sfide tecniche uniche. L'epitelio prostatico è intrinsecamente dipendente dalla segnalazione degli androgeni e dal supporto della matrice extracellulare (ECM), richiedendo condizioni colturali specializzate. Inoltre, il cancro alla prostata mostra un'ampia gamma di comportamenti clinici, dai tumori localizzati ormono-sensibili al CRPC altamente aggressivo e refrattario al trattamento, il che complica ulteriormente lo sviluppo di sistemi organoidi riproducibili11,12. I protocolli di successo per la generazione di PCO devono affrontare queste complessità biologiche ottimizzando i passaggi chiave, tra cui l'elaborazione dei tessuti, la digestione enzimatica, l'inclusione della ECM e l'integrazione con fattori di crescita critici, ormoni e piccole molecole. Tali protocolli sono essenziali per garantire la fedeltà degli organoidi ai loro tumori parentali e per facilitarne l'applicazione nelle analisi a valle.

In questo studio, presentiamo un protocollo dettagliato e riproducibile per l'istituzione e il mantenimento a lungo termine delle DOP. Il nostro flusso di lavoro copre l'intero processo, dall'acquisizione dei tessuti e dall'elaborazione dei campioni bioptici e chirurgici al passaggio degli organoidi, alla crioconservazione e alla rianimazione (Figura 1). Questo protocollo è stato ottimizzato per preservare l'integrità fenotipica e genomica dei tessuti tumorali della prostata, consentendo robusti sistemi di coltura 3D adatti a un'ampia gamma di applicazioni, tra cui la profilazione genomica, i test di risposta ai farmaci e i saggi funzionali. In particolare, il nostro metodo affronta ostacoli tecnici comuni, come i bassi tassi di successo nella coltura degli organoidi, la crescita non ottimale e le difficoltà nel successivo passaggio, e fornisce linee guida standardizzate, facilitando così la riproducibilità tra i laboratori.

Lo sviluppo di modelli affidabili di organoidi per il cancro alla prostata ha un'importanza immensa sia per la ricerca di base che per quella traslazionale13. Questi sistemi offrono una potente piattaforma per decifrare i meccanismi della malattia, identificare nuovi bersagli terapeutici e promuovere approcci di medicina di precisione su misura per i singoli pazienti. Affrontando le lacune tecniche esistenti e fornendo un protocollo completo, il nostro lavoro mira ad accelerare l'adozione della tecnologia degli organoidi nella ricerca sul cancro alla prostata e a sostenere gli sforzi globali per combattere questa malattia impegnativa14.

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Protocollo

Questo studio è stato esaminato e approvato dal Comitato etico medico dell'ospedale del popolo n. 2 di Wuxi (numero di approvazione: Y-38 (2023)). Tutti i partecipanti hanno fornito moduli scritti di consenso informato. I dati dei pazienti sono stati resi anonimi per garantire la protezione della privacy nel rispetto degli standard etici.

1. Raccolta dei campioni

  1. Acquisizione di tessuti
    1. Preparazione prima del campionamento
      1. Criteri di inclusione: Assicurarsi che tutti i partecipanti abbiano una diagnosi confermata di cancro alla prostata, come determinato da un esame patologico o di imaging. Ricavare campioni tumorali da resezione chirurgica, biopsia o altri campioni clinici. Assicurarsi che tutti i partecipanti abbiano almeno 18 anni e non abbiano altri tumori maligni, per escludere potenziali interferenze da altri tumori nello studio del cancro alla prostata. Da tutti i partecipanti, raccogliere il consenso informato scritto per partecipare allo studio e consentire l'utilizzo dei loro campioni per la ricerca scientifica.
      2. Criteri di esclusione: escludere i pazienti i cui campioni non contengono abbastanza tessuto tumorale per la coltura o l'analisi. Escludere i pazienti che ritirano il consenso o non sono in grado di fornire i campioni richiesti durante lo studio.
    2. Campioni di biopsia con ago centrale della prostata: utilizzare un ago speciale per ottenere campioni dal tessuto prostatico. Posizionare immediatamente il tessuto nella soluzione di conservazione (terreno Advanced DMEM/F-12 (adDMEM/F-12) + soluzione di inibitore della roccia (diluizione 1:2000)) e trasportarlo in laboratorio su ghiaccio, garantendo la consegna entro 24 ore.
      NOTA: Mira con precisione al tessuto tumorale della prostata ed esegui il campionamento multisito in diverse regioni anatomiche. Eseguire 1-2 punture per sito, ciascuna delle quali produce campioni ≥ 1 cm.
    3. Campioni di prostatectomia radicale: Dopo la raccolta, immergere rapidamente i campioni nella soluzione di conservazione (terreno adDMEM/F-12 + soluzione di inibitore della roccia (diluizione 1:2000)) e trasportarli su ghiaccio, assicurando la consegna al laboratorio entro 24 ore.
      NOTA: Altri frammenti di tessuto possono essere ottenuti attraverso la prostatectomia radicale15.
      Raccogli campioni ≥ 1 g (≈ 5 mm di diametro), riducendo al minimo la contaminazione da parte del tessuto normale. Coordinarsi prima dell'intervento con i medici per specificare: 1) nucleo tumorale; 2) tessuto peri-tumorale; 3) Controllo normale. Dai la priorità ai frammenti solidi con scolorimento grigio-giallo. Se assente, implementare il campionamento casuale sistematico. Fare riferimento alla Tabella 1 per informazioni sulla raccolta dei campioni.
  2. Elaborazione dei campioni
    1. Etichettatura e categorizzazione: etichettare chiaramente i campioni di tessuto raccolti (inclusi nome del paziente, numero di ricovero, nome del tessuto, sito del tessuto e tipo di tessuto).
    2. Crioconservazione: Processare immediatamente i campioni di tessuto (≤ 12 ore dopo la raccolta). Immergere i campioni in una soluzione di conservazione preraffreddata (4 °C) (terreno adDMEM/F-12 + soluzione di inibitore della roccia (diluizione 1:2000)) e conservarli a 4 °C. Procedere con ulteriori fasi sperimentali entro 4-6 ore per ottenere risultati ottimali.
  3. Trasporto e stoccaggio
    1. Trasporto della catena del freddo: trasportare i campioni di tessuto in laboratorio in condizioni di bassa temperatura.
    2. Registrazione del campione: all'arrivo in laboratorio, verificare e registrare in dettaglio le informazioni sul campione, comprese le informazioni personali di base del paziente, il tipo di tessuto, il nome e il sito di campionamento.
  4. Ricevimento e ispezione del laboratorio:
    1. Ispezione del campione: aprire i campioni in una cabina di biosicurezza e ispezionare eventuali perdite, contaminazioni o anomalie visibili.
    2. Dissezione del campione: Estrarre il campione e metterlo in un piatto di coltura. Utilizzare le forbici per tessuti o un bisturi per dividere il campione in piccoli pezzi (circa 1-3 mm³) da utilizzare negli esperimenti successivi.

2. Procedure sperimentali

  1. Preparazione di sospensioni cellulari tissutali primarie
    1. Conservazione: Posizionare i blocchi di tessuto raccolti in provette da centrifuga coniche sterili da 50 mL, assicurandosi che i tessuti siano classificati per tipologia. Etichettare ogni tubo in modo appropriato. Aggiungere la soluzione di conservazione (terreno adDMEM/F-12 + soluzione di inibitore della roccia (diluizione 1:2000)) a ciascuna provetta fino a quando il tessuto non è completamente sommerso. Conservare i campioni a 4 °C fino a nuova lavorazione.
      NOTA: I tipi di tessuto dovrebbero includere sia i tessuti tumorali che quelli non tumorali. Le etichette dei campioni devono in genere includere il numero della cartella clinica.
    2. Separazione dei tessuti: utilizzando una pinzetta sterilizzata, trasferire i campioni di tessuto del cancro alla prostata in un piatto di coltura di medie dimensioni. Lavare il fazzoletto 2-3 volte con 2 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS) per rimuovere sangue e detriti. Rimuovere con cura il tessuto adiposo, i muscoli e altri componenti non epiteliali utilizzando una pinzetta a punta fine, conservando solo le regioni epiteliali. Successivamente, tritare il tessuto pulito in piccoli frammenti di circa 1-3 mm³ con le forbici.
      NOTA: La rimozione completa dei componenti non epiteliali è fondamentale per le applicazioni a valle, poiché la contaminazione del tessuto stromale o adiposo può ridurre l'efficienza e la specificità dell'isolamento cellulare. Mantenere le condizioni sterili durante tutta la procedura per ridurre al minimo il rischio di contaminazione microbica.
    3. Digestione dei tessuti: Trasferire i pezzi di tessuto preparati in provette per la lavorazione dei tessuti. Aggiungere la soluzione per la digestione del tessuto tumorale (Tabella 2) in ciascuna provetta. Attivare il dispositivo di digestione (Single-cell Suspension preparation apparatus) utilizzando il Programma di Dissociazione dei Tessuti Medio-Duri per la dissociazione enzimatico-meccanica.
      NOTA: Il protocollo di digestione è il seguente: rotazione in avanti a 200 giri/min per 3 s, rotazione inversa a 200 giri/min per 3 s, rotazione in avanti a 300 giri/min per 4 s, rotazione inversa a 300 giri/min per 4 s, rotazione in avanti a 600 giri/min per 5 s, rotazione inversa a 600 giri/min per 5 s, rotazione in avanti a 400 giri/min per 3 s, Rotazione inversa a 400 giri/min per 3 s. Questa sequenza costituisce un ciclo, che deve essere ripetuto tre volte. Dopo aver completato i primi due cicli, continuare con una rotazione lenta a 20 giri/min per circa 25 minuti. La durata può essere regolata in base alle condizioni sperimentali. Digerire i tessuti a 37 °C per 40 minuti - 1 ora.
    4. Terminazione della digestione: aggiungere un volume uguale o doppio di terreno adDMEM/F-12 integrato con FBS alla sospensione cellulare per terminare l'attività enzimatica.
      NOTA: Se rimane un residuo non digerito, raccogliere il surnatante, aggiungere enzimi digestivi freschi al residuo e continuare la digestione a 37 °C per altri 15-20 minuti. Monitorare periodicamente il processo e combinare le sospensioni cellulari di entrambe le fasi di digestione.
    5. Filtrazione: Pre-bagnare un filtro cellulare da 100 μm con 1 mL di terreno adDMEM/F-12, quindi filtrare la sospensione cellulare. Sciacquare due volte la provetta per la lavorazione dei tessuti e il filtro cellulare con 5 mL di terreno adDMEM/F-12 integrato con una soluzione di inibitore della roccia (diluizione 1:2000). Raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga conica sterile da 50 mL. Far passare la sospensione attraverso un filtro da 70 μm e raccogliere tutte le sospensioni cellulari in una nuova provetta da 50 mL.
      NOTA: Il numero di fasi di filtrazione e la dimensione dei pori dei filtri possono essere regolati in base alle caratteristiche del campione.
    6. Lisi dei globuli rossi: centrifugare la sospensione cellulare raccolta a 200 × g per 5 minuti a 25 °C. Scartare con cautela il surnatante, quindi risospendere il pellet cellulare in 2 mL di tampone per la lisi dei globuli rossi. Incubare la sospensione con ghiaccio per 2-3 minuti.
      NOTA: Il tempo di incubazione per la lisi dei globuli rossi può essere regolato in base all'efficienza della lisi. L'incubazione prolungata può portare ad un aumento della morte cellulare. Si consiglia di monitorare il campione al microscopio per garantire la completa lisi dei globuli rossi senza danni eccessivi ad altri tipi di cellule.
    7. Terminare la lisi: aggiungere 6 mL di terreno adDMEM/F-12 integrato con soluzione di inibitore della roccia (diluizione 1:2000) alla sospensione cellulare. Trasferire la miscela in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 ml e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 25 °C. Scartare il surnatante. Lavare il pellet cellulare 1-2 volte con lo stesso terreno integrato e trasferire la sospensione cellulare finale in una provetta Eppendorf da 1,5 mL.
    8. Valutazione della vitalità: Miscelare 10 μl della sospensione cellulare con un volume uguale di soluzione di blu di tripano e osservare la vitalità cellulare al microscopio.
      NOTA: Se si osservano quantità significative di cellule morte o detriti, eseguire una centrifugazione a bassa velocità a 50 x g per 5 minuti a 25 °C per rimuoverli prima di procedere con il conteggio.
    9. Conteggio delle cellule: risospendere il pellet in 1 mL di terreno adDMEM/F-12, diluire la sospensione secondo necessità (tipicamente in una diluizione 1:20) e posizionare 6 μL della sospensione diluita su un emocitometro per contare le cellule al microscopio.
    10. Raccolta dei pellet cellulari: Centrifugare a 200 x g, 25 °C, per 5 min. Raccogliere il pellet cellulare finale in una provetta Eppendorf da 1,5 mL.

3. Insediamento di organoidi da sospensioni cellulari primarie

  1. Semina: Determinare il volume richiesto di gel della matrice in base alla conta cellulare. Utilizzando puntali per pipette pre-raffreddati (conservati a -20 °C), trasferire con cura il volume appropriato di gel della matrice nel pellet cellulare. Mescolare delicatamente la miscela cell-gel sul ghiaccio, evitando la formazione di bolle d'aria per garantire una semina uniforme e un'integrità ottimale del gel della matrice.
    NOTA: Scongelare il gel della matrice a 4 °C durante la notte prima dell'uso. Assicurarsi che tutti gli strumenti di manipolazione, compresi i puntali delle pipette e le provette, siano pre-raffreddati per evitare la gelificazione prematura.
  2. Placcatura: Erogare la miscela di gel per matrice cellulare su una piastra di coltura a 24 pozzetti a bassa aderenza, applicando circa 30 μl per goccia. Assicurarsi che ogni goccia contenga più di 10.000 cellule per supportare un'efficace formazione di strutture tridimensionali (3D).
    NOTA: Evitare un'eccessiva diluizione del gel della matrice. Per mantenere l'integrità strutturale e supportare la formazione di colture 3D, il gel della matrice dovrebbe costituire più del 70% del volume totale della miscela. Gli organoidi derivati da campioni di biopsia umana e prostatectomia sono di natura equivalente, differiscono principalmente nella resa cellulare vitale, e in questo protocollo sono state applicate densità di semina identiche.
  3. Incubazione: Posizionare la piastra di coltura in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 per 5 minuti, lasciando solidificare il gel della matrice in via preliminare. Capovolgere la piastra e lasciarla riposare per 20 minuti per mantenere il gel della matrice in forma 3D. Aggiungere 800-1000 μL di terreno di coltura (Tabella 3) a ciascun pozzetto. Sostituire il terreno di coltura ogni 2-3 giorni.
    NOTA: Assicurarsi che il gel della matrice non venga disturbato durante la fase di inversione per mantenere la struttura 3D.

4. Passaggio degli organoidi

  1. Raccolta e preparazione degli organoidi: utilizzando un puntale per pipetta pre-raffreddato, disgregare meccanicamente il gel della matrice per frammentare i cluster di organoidi. Sciacquare ogni pozzetto 1-2 volte con adDMEM/F-12 mezzo + soluzione di inibitore della roccia (diluizione 1:2000). Trasferire i grappoli frammentati insieme al terreno di coltura in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 mL. Centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 25 °C ed eliminare il surnatante.
    NOTA: Quando gli organoidi raggiungono un diametro di 100 μm (tipicamente al giorno di coltura 14). Se un volume eccessivo del fluido interferisce con la rottura meccanica, aspirare parte del fluido prima di rompere i grappoli. Per il gel della matrice residua che aderisce alla superficie della piastra, raschiare delicatamente utilizzando una punta per pipetta e risciacquare 2-3 volte con adDMEM/F-12 mezzo + soluzione di inibitore della roccia (diluizione 1:2000). Tutti i risciacqui devono essere raggruppati con la raccolta iniziale per la massima resa.
  2. Dissociazione dell'organoide: risospendere il pellet risultante in 2 mL di soluzione enzimatica ricombinante tripsina-simile preriscaldata. Pipettare su e giù per avviare la dissociazione, quindi incubare a 37 °C per 15-30 minuti. Monitorare la dissociazione al microscopio ogni 5 minuti fino a quando piccoli cluster cellulari (circa 5-6 cellule per cluster) dominano il campo, quindi procedere alla fase successiva.
    NOTA: L'interruzione tempestiva della digestione è fondamentale per evitare un'eccessiva dissociazione e per preservare la vitalità cellulare. L'osservazione microscopica frequente assicura che la digestione venga interrotta nel momento ottimale per la formazione dei grappoli.
  3. Terminare la digestione: Terminare la digestione aggiungendo un volume uguale o doppio di terreno adDMEM/F-12 integrato con siero fetale bovino (FBS) per estinguere l'attività enzimatica. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 25 °C ed eliminare il surnatante.
  4. Rimozione del gel della matrice: risospendere il pellet in 2 mL di soluzione di recupero cellulare e incubare a 4 °C per 20-40 minuti per sciogliere il gel residuo della matrice. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e ripetere il lavaggio due volte con il terreno adDMEM/F-12 per eliminare i componenti residui della matrice. Trasferire il pellet finale in una provetta Eppendorf sterile da 1,5 mL per l'ulteriore elaborazione.
    NOTA: L'incubazione a bassa temperatura è fondamentale per un'efficace depolimerizzazione del gel della matrice, preservando l'integrità cellulare. Ridurre al minimo il tempo trascorso al di fuori dell'ambiente freddo per evitare una rigelificazione prematura.
  5. Semina e coltura: Procedere con la risemina dei cluster di organoidi dissociati seguendo le procedure descritte nei passaggi 3.1-3.3. Garantire una densità cellulare e un rapporto di gel della matrice adeguati per una riforma ottimale della struttura 3D.
    NOTA: Protocolli dettagliati per la crioconservazione degli organoidi, lo scongelamento, il re-inclusione e l'elaborazione istologica sono disponibili su richiesta.

5. Crioconservazione degli organoidi

  1. Raccolta degli organoidi: rimuovere la piastra di coltura dall'incubatore e dissociare meccanicamente gli aggregati di idrogel di organoidi utilizzando un puntale per pipetta pre-raffreddato. Trasferire gli aggregati dissociati insieme al terreno di coltura in una provetta da centrifuga conica da 15 mL. Sciacquare i pozzetti 2-3 volte con adDMEM/F-12 medium, combinando i lavaggi con la sospensione primaria. Centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 25 °C ed eliminare il surnatante.
    NOTA: Per garantire la massima resa, rompere delicatamente gli aggregati di organoidi senza causare danni eccessivi. Tutti i lavaggi devono essere combinati con la raccolta primaria per ridurre la perdita di organoidi durante il processo di raccolta.
  2. Dissociazione enzimatica: aggiungere 2-4 mL di soluzione enzimatica ricombinante tripsina-simile preriscaldata al pellet dell'organoide in una provetta conica e mescolare delicatamente la sospensione. Incubare la sospensione a 37 °C per 15-20 min. Monitorare il processo di dissociazione al microscopio ogni 5 minuti.
    NOTA: Se necessario, pipettare delicatamente per facilitare la rottura dei cluster più grandi in aggregati più piccoli (circa 5-6 cellule per cluster). Per la crioconservazione sono necessari tempi di digestione più brevi per prevenire l'eccessiva dissociazione e la perdita di vitalità cellulare. L'osservazione frequente assicura che la digestione venga terminata nella fase appropriata per preservare l'integrità dell'organoide.
  3. Terminazione della digestione: aggiungere un volume uguale o maggiore di terreno adDMEM/F-12 integrato con FBS per arrestare l'attività enzimatica. Centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
    NOTA: Se il pellet è privo di gel matrice residua, procedere al passaggio 5.5 per la crioconservazione. Se la contaminazione del gel della matrice persiste, procedere con il passaggio 5.4.
  4. Rimozione del gel della matrice (opzionale): seguire la procedura descritta al punto 4.4 per rimuovere il gel della matrice. Risospendere il pellet in 2 mL di soluzione di recupero cellulare e incubare a 4 °C per 20-40 min. Centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 4°C, scartare il surnatante e ripetere il processo di lavaggio 1-2 volte per garantire la completa rimozione del gel della matrice.
    NOTA: La rimozione del gel residuo della matrice è fondamentale per garantire che solo le cellule dissociate vengano crioconservate. La rimozione incompleta del gel può influire sulla vitalità e sull'integrità strutturale degli organoidi dopo lo scongelamento.
  5. Crioconservazione: Risospendere il pellet cellulare in 1,5 mL di terreno di congelamento per organoidi mediante pipettaggio delicato per garantire una sospensione uniforme. Trasferire la sospensione in un crioviale e conservarla a -80 °C per una conservazione a breve termine. Dopo 24 ore, trasferire i flaconcini in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
    NOTA: Assicurarsi che il terreno di crioconservazione sia accuratamente miscelato con le cellule per evitare un congelamento irregolare, che può causare danni alle cellule. I flaconcini devono essere trasferiti in azoto liquido immediatamente dopo il periodo di conservazione a breve termine per garantire la conservazione a lungo termine e prevenire la degradazione cellulare.

6. Recupero degli organoidi

  1. Scongelamento di organoidi crioconservati: rimuovere i crioviali contenenti organoidi dallo stoccaggio di azoto liquido o a -80 °C. Immergere immediatamente il flaconcino in un bagnomaria a 37 °C e agitare delicatamente fino a quando il contenuto non è completamente scongelato. Non appena lo scongelamento è completo, trasferire la sospensione di organoidi in una provetta da centrifuga conica da 15 mL utilizzando un puntale per pipetta preraffreddato (-20 °C).
    NOTA: Uno scongelamento rapido e uniforme è fondamentale per ridurre al minimo i danni alle celle crio-indotti. Utilizzare puntali per pipette pre-raffreddati per evitare il riscaldamento prematuro e la formazione del gel della matrice durante il trasferimento.
  2. Rimozione del crioprotettore: aggiungere con cautela 1-2 ml di terreno adDMEM/F-12 lungo la parete del tubo conico per diluire gradualmente il crioprotettore. Mescolare delicatamente per inversione. Centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
    NOTA: Evitare il pipettaggio vigoroso o il vortice in questa fase, poiché improvvisi spostamenti osmotici e stress meccanici possono compromettere la vitalità degli organoidi. Un approccio a diluizione lenta riduce al minimo lo shock cellulare.
  3. Lavaggio e risospensione: aggiungere 1 ml di terreno fresco adDMEM/F-12 al pellet. Risospendere delicatamente le cellule utilizzando una punta per pipetta pre-raffreddata (-20 °C) per evitare l'adesione prematura del gel della matrice. Trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
    NOTA: Mantenere una bassa temperatura durante il lavaggio è essenziale per prevenire il riassemblaggio indotto termicamente dei componenti del gel della matrice, che potrebbe ostacolare la successiva riformazione degli organoidi.
  4. Raccolta: Centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Ripetere la fase di lavaggio 2-3 volte per garantire la completa rimozione dei residui di crioprotettore e contaminanti.
  5. Semina e coltura: Risospendere il pellet cellulare finale in un terreno di coltura di organoidi preparato in base alle esigenze sperimentali. Procedere con la semina seguendo il protocollo descritto nei passaggi 3.1-3.3, assicurandosi che la corretta proporzione di gel della matrice e la densità cellulare supportino il ristabilimento della struttura 3D.
    NOTA: La vitalità e il recupero delle cellule post-scongelamento dipendono fortemente da una manipolazione delicata, da un'adeguata diluizione dei crioprotettori e dal ristabilimento immediato di un ambiente di supporto in gel a matrice 3D.

7. Elaborazione pre-analisi per la caratterizzazione degli organoidi

  1. Raccolta degli organoidi: Dissociare meccanicamente gli aggregati quando i diametri degli organoidi raggiungono i 70-100 μm e trasferirli in una provetta conica da 15 mL contenente terreno per la successiva coltura. Sciacquare i pozzetti 2-3 volte con adDMEM/F-12 medium e combinare i lavaggi con la sospensione di organoidi. Centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 25 °C ed eliminare il surnatante.
    NOTA: Per raccolte su piccola scala (ad es. 1-2 pozzetti), utilizzare una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml per garantire una manipolazione efficiente e ridurre la perdita di campioni. Prestare attenzione per evitare di interrompere le strutture degli organoidi durante la dissociazione.
  2. Risospensione: Risospendere il pellet in 1 mL di terreno adDMEM/F-12 e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 25°C ed eliminare il surnatante.
    NOTA: Assicurarsi che il pellet sia completamente risospeso prima della centrifugazione per evitare la formazione di grumi e per facilitare una lavorazione uniforme nelle fasi successive.
  3. Lavaggio e fissaggio: aggiungere 1 mL di D-PBS al pellet e mescolare delicatamente mediante pipettaggio o inversione. Centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 25 °C, eliminare il surnatante e ripetere la fase di lavaggio 1-2 volte. Fissare il pellet con 1-2 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) e incubare per una notte a 4 °C.
    NOTA: Eseguire attentamente le fasi di lavaggio per garantire la rimozione completa del fluido residuo e di altri contaminanti. La fissazione in paraformaldeide è fondamentale per preservare la morfologia degli organoidi per le successive analisi.
  4. Lavaggio post-fissaggio: centrifugare i campioni a 200 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Lavare i campioni fissati 2-3 volte con D-PBS, mescolando delicatamente con un tocco delle dita o un'inversione delicata per garantire una corretta distribuzione del tampone di lavaggio e prevenire la perdita di organoidi.
    NOTA: Un corretto lavaggio post-fissazione è essenziale per rimuovere l'eccesso di paraformaldeide e ridurre la colorazione di fondo nelle applicazioni a valle, come l'immunoistochimica.
  5. Rifissazione dell'etanolo: Risospendere delicatamente il pellet in 1 mL di miscela di etanolo al 70% muovendo le dita e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
    NOTA: La fissazione dell'etanolo in questa fase aiuta a preservare l'integrità dell'organoide e a preparare i campioni per l'inclusione o l'ulteriore elaborazione. Garantire una sospensione uniforme in etanolo per evitare un fissaggio irregolare.
  6. Clearance del gel della matrice (opzionale): se nel pellet rimane del gel della matrice residuo, seguire il protocollo descritto al punto 4.4 per rimuoverlo. Questa fase prevede la risospensione del pellet in una soluzione di recupero cellulare e l'incubazione a 4 °C per 20-40 minuti, seguita da centrifugazione e lavaggi multipli per garantire la completa rimozione del gel.
    NOTA: La rimozione del gel della matrice è particolarmente importante per l'analisi istologica a valle o l'imaging, poiché il gel residuo può interferire con il sezionamento e l'analisi dei tessuti.
  7. Inclusione dell'agarosio: Preparare circa 6 mL di agarosio al 2% fondendolo a 96 °C durante la fissazione dell'etanolo organoide. Mescolare 100 μl di agarosio fuso con il pellet dell'organoide, garantendo una formazione minima di bolle d'aria. Trasferire il composto in uno stampo, solidificare a 4°C, quindi lavorare per l'inclusione della paraffina.
    NOTA: Preriscaldare i puntali delle pipette (con le estremità tagliate) per evitare l'intasamento. L'inclusione dell'agarosio facilita la conservazione della struttura dell'organoide, consentendo al contempo una facile manipolazione e sezionamento. Evitare la formazione di bolle durante la miscelazione per garantire un'inclusione uniforme e un sezionamento ottimale dei tessuti.

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Risultati

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno della National Natural Science Foundation of China (sovvenzione n. 82172831) e del progetto di ricerca chiave della Commissione provinciale per la salute e la pianificazione familiare del Jiangsu (sovvenzione n. X20240121).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
A 83-01TOCRIS2939
adMEM/F12Gibco12634010
Armadio di biosicurezzaJinan Xinbeixi Biotechnology Co., Ltd
Soluzione di recupero cellulareCorning354253
centrifugaShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdM1416R
Tubi centrifugheNanchino iResearch Biotechnology Co., Ltd
Cultrex PathClear BMR& D3533-010-02
Cultrex Fattore di Crescita Ridotto BME, Tipo 2R& D3533-005-02
Contenitori di coltura (piastre a bassa adesione da 24 pozzi)ThermoNunc-174930-ZX
DHTISOREAG521-18-6
Bilanciamento elettronicoNanchino iResearch Biotechnology Co., Ltd
Siero bovino fetaleGibco10099141
GlutaminePlus-200mMR& DB90210
HEPESR& D1254/10
incubatore di colture cellulari umidificate (37° C, 5% CO2)Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., LtdHY-160SY
FrigoriferoNanchino iResearch Biotechnology Co., Ltd
Piatti culturali di medie dimensioniAssennoabs7005
Supplemento Multimediale N21-MAX (50X)R& DAR008
N-acetilcisteinaSigmaA9165-5G
NicotinamideR& D3533-010-02
NormocinaInvivogenANT-NR-2
Dispositivo di pipetaggio a pipettoNanchino Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd
PipetteNanchino Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd
PrimocinInvivogenANT-PM-2
rhEGFR& D236-EG-01M
rhFGFR& D233-FB-025
rhFGF-10R& D345-FG-025
rhNogginR& D6057-NG-100
rhR-Spondin 1R& D4656-RS-100
SB 202190TOCRIS1264
Apparecchio di preparazione della sospensione a singola cellaRWDDSC-400
Forbici tessute/bisturiNanchino iResearch Biotechnology Co., Ltd
TryplE ExpressGibco126A04013
Kit di Dissociazione Tumorale, UmanoMiltenyi Biotec130-095-929
PinzetteNanchino iResearch Biotechnology Co., Ltd
Bagno d'acquaChangzhou Zhongjie Experimental Instrument Manufacturing Co., LtdHH-600
Y-27632 dicloruroR& D1254/10

Riferimenti

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