Articolo metodologico

Rilevamento del comportamento soggetto all'aggregazione nelle cellule mutanti di cancro al seno P53 V157F utilizzando la fluorescenza multipunto della tioflavina T

DOI:

10.3791/68921

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30 dicembre 2025

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1School of Medicine, I-Shou University, 2School of Chinese Medicine for Post Baccalaureate, I-Shou University, 3Department of Medical Science and Biotechnology, I-Shou University, 4Department of Biomedical Engineering, I-Shou University, 5Department of Pathology, E-Da Hospital, 6Department of Physical Therapy, I-Shou University, 7Department of Occupational Therapy, I-Shou University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Le cellule di cancro al seno Hs578T che ospitano la mutazione p53 V157F mostrano una fluorescenza significativamente più alta della tioflavina T rispetto alle cellule MCF7, indicando un'aggregazione proteica aumentata. Le misurazioni di fluorescenza multipunto migliorano la precisione e l'affidabilità della rilevazione nell'identificazione di aggregati ricchi di foglio di β, sottolineando l'importanza delle mutazioni p53 soggette all'aggregazione nella ricerca sul cancro e nello sviluppo di strategie terapeutiche.

Abstract

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Il soppressore tumorale p53, codificato dal gene TP53 , svolge un ruolo centrale nel mantenimento della stabilità genomica. Le mutazioni di TP53 , in particolare le varianti a punto di interesse caldo, si trovano in circa il 50% dei tumori umani e possono portare alla perdita di funzioni soppressive tumorali o all'acquisizione di proprietà di guadagno di funzione, inclusa l'aggregazione in strutture simili a prioni.

In questo studio, abbiamo valutato la tendenza all'aggregazione della mutazione p53 V157F nelle cellule di cancro al seno Hs578T rispetto alle cellule MCF7 che esprimono p53 di tipo selvatico. L'aggregazione proteica è stata valutata utilizzando la colorazione con Tioflavina T (ThT) seguita dalla quantificazione della fluorescenza in saghi a 96 pozzi a placche. Le cellule sono state colorate con una soluzione ThT/Hoechst, lavate e analizzate utilizzando un lettore di micropiastre secondo parametri definiti di eccitazione/emissione. L'analisi quantitativa utilizzando sia letture di fluorescenza a singolo punto che a quattro punti ha rivelato che le cellule Hs578T hanno mostrato un aumento di intensità di fluorescenza ThT da 3,20 a 4,26 volte rispetto a MCF7, indicando livelli significativamente elevati di aggregati ricchi di foglio di β o simili all'amiloide. Le misurazioni multipunto hanno confermato la presenza diffusa e costante di aggregati proteici sulla superficie del pozzo. Questi risultati supportano l'uso della lettura multipunto delle placche per rilevare con precisione l'aggregazione proteica negli saghi cellulari.

Introduzione

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Il gene TP53, che codifica per la proteina soppressrice tumorale p53, è mutato in circa il 50% dei tumoriumani 1,2. Tali mutazioni non solo aboliscono le funzioni soppressive tumorali di p53 ma, in alcune varianti hotspot, promuovono anche la formazione di aggregati simili aprioni 3,4. Queste forme aggregate di p53 mutanti acquisiscono frequentemente proprietà di guadagno di funzione, inclusa una maggiore resistenza alle terapieantitumorali 5,6. Pertanto, identificare quali mutazioni dei punti caldi p53 sono soggette all'aggregazione è fondamentale per guidare lo sviluppo di strategie terapeutiche efficaci nei tumori mutantip53 7,8.

Nei nostri studi precedenti, abbiamo osservato che mutazioni specifiche p53 nel carcinoma squamoso della testa e del collo (HNSCC) e nelle linee cellulari del cancro al seno mostrano forti segnali di colorazione con Tioflavina T (ThT), indicando la presenza di proteine aggregate. Il ThT è un colorante benzotiazolo che si lega specificamente a strutture amiloidi ricche di β fogli, produendo una fluorescenza aumentata al momento del legame9. Ad esempio, la linea cellulare Detroit 562 HNSCC, che porta la mutazione p53 R175H, ha mostrato forti segnali di fluorescenzaThT 10. Analogamente, altre due linee cellulari HNSCC, TW01 e HONE-1, entrambe con la mutazione p53 R280T, hanno mostrato una marcata colorazioneThT 11. In questi casi, i segnali ThT colocalizzati con p53, supportando la presenza aggregata di p53 10,11.

Nelle cellule di cancro al seno, MDA-MB-231 (mutazione p53 R280K) e T47D (mutazione p53 L194F) hanno mostrato anch'esse una forte colorazione ThT con chiara co-localizzazione p53/ThT 12. Al contrario, le cellule MCF7, che esprimono p53 di tipo selvatico, e le cellule MDA-MB-468 (mutazione p53 R273H) hanno mostrato entrambe solo segnali ThTdeboli 12. Analogamente, le cellule OECM-1 HNSCC con la mutazione p53 V173L hanno mostrato bassi livelli di colorazioneThT 10.

Rispetto ad altri metodi di rilevamento per aggregazione proteica - come i saggi filtri trappolato, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) o l'immunocolorazione con anticorpi specifici per aggregato - l'analisi della fluorescenza ThT offre diversi vantaggi. È non distruttivo, rapido e applicabile sia a cellule vive che fisse senza un elaborato esteso. Sebbene i saggi filtranti catturi efficacemente aggregati insolubili, richiedono una denaturazione severa e sono inadatti all'uso con cellulevive 13. TEM fornisce una visualizzazione diretta della morfologia delle fibrille ma è laborioso e a bassorendimento 14. L'immunocolorazione aggregata specifica consente la rilevazione in situ usando anticorpi dipendenti dalla conformazione, anche se la disponibilità e la specificità degli anticorpi possono esserelimitanti 15. Al contrario, la fluorescenza ThT - specialmente se combinata con la lettura multipunto delle lastre - offre un approccio semplice, quantitativo e spazialmente affidabile per rilevare strutture ricche di fogli di β o simili all'amiloide.

Anche le considerazioni pratiche sono fondamentali per la riproducibilità. La fluorescenza del ThT correla linearmente con la concentrazione amiloide su un ampio intervallo di concentrazione (0,2-500 μM), e il segnale di picco si raggiunge tipicamente a 20-50 μM, a seconda della proteina—anche se l'autofluorescenza del ThT può emergere a ≥5 μM, e concentrazioni più elevate possono influenzare la cinetica diaggregazione 16. Pertanto, si raccomanda generalmente una concentrazione operativa di ThT intorno a 10-20 μM per bilanciare la sensibilità minimizzando i potenziali effetti sui processi diaggregazione 16. Nel nostro protocollo, lo stock 1.000x di ThT (12. mM) viene diluito 1:1.000 per ottenere una concentrazione operativa di circa 12. μM, che rientra in questo intervallo raccomandato.

ThT si lega preferenzialmente alle strutture amiloidi ricche di β fogli, caratteristiche delle fibrille amiloidi. Questa specificità deriva dall'interazione del colorante con l'architettura cross-β delle fibrille amiloidi, dove le superfici formate dai filamenti di β forniscono siti di legame per ThT. Di conseguenza, il ThT potrebbe non rilevare efficacemente altri aggregati mal piegati o non amiloidi che non presentano questa struttura ricca difoglio di β 17. Pertanto, sebbene ThT sia uno strumento prezioso per identificare fibrille amiloidi, è consigliabile utilizzare metodi di validazione complementari - come la co-localizzazione con l'immunofluorescenza p53 o approcci biofisici - per verificare l'identità e la specificità degli aggregatirilevati 10,18.

Gli studi di previsione strutturale suggeriscono che la mutazione p53 V157F adotta una conformazione più incline all'aggregazione rispetto alla proteinaselvatica 19. In questo studio, abbiamo confrontato i segnali di fluorescenza ThT tra le cellule di cancro al seno Hs578T, che ospitano la mutazione p53 V157F, propensa all'aggregazione, e le cellule MCF7 che esprimono p53 di tipo selvatico. Utilizzando un saggio di colorazione ThT basato su lettore di lastre multipunto, abbiamo cercato di valutare la propensione all'aggregazione di p53 V157F rispetto al tipo selvatico p53.

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Protocollo

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1. Semina cellulare

  1. Per valutare la vitalità cellulare, si mescolano 10 μL di Trippan Blue con 10 μL di cellule risospese in 1x Soluzione Salina Fosfatata (DPBS) di Dulbecco in un tubo microcentrifuga e si mescola accuratamente.
  2. Carica 10 μL della miscela su un contraveglino, poi conta le celle vive utilizzando un contatore automatico.
  3. In base al conteggio di vitalità, si seminano 30.000 cellule vitali per pozzo in una piastra di coltura da 96 pozzi, con un pozzo designato come controllo non colorato e i restanti tre pozzi utilizzati per la colorazione.

2. Incubazione

  1. Posizionare la piastra di coltura in un incubatore a CO2 e incubare per 12 ore a 37 °C.

3. Preparazione di materiale fresco per la tintura ThT (1.000 volte)

  1. Pesa 0,02 g (20 mg) di polvere di ThT e scioglila in 5,0 mL di acqua deionizzata. Mescola bene finché la polvere non si scioglie completamente.
    NOTA: Questa preparazione produce una soluzione di stock di ThT 1.000x con una concentrazione finale di 4 mg/mL, equivalente a 12,5 mM (il ThT ha un peso molecolare di ~318,85 g/mol). Una soluzione di 4 mg/mL equivale a 4 g/L. Dividendo 4 g/L per 318,85 g/mol si ottiene 0,0125 mol/L, ovvero ~12,5 mM).

4. Preparazione del tampone di colorazione ThT con controcolorazione nucleare

  1. Prepara la soluzione di colorazione aggiungendo il seguente mL di 1 mL di 1x DPBS e mescola delicatamente per garantire l'omogeneità.
    1. Aggiungere 1 μL di stock di ThT appena preparato 1.000x, ottenendo una concentrazione finale di ThT di 12,5 μM (1x).
    2. Aggiungere 1 μL di soluzione stock Hoechst 33342 da 1 mg/mL, ottenendo una concentrazione finale di ~1 μg/mL (=1,6 μM).

5. Colorazione

  1. Rimuovi il mezzo di coltura da ogni pozzo. Aggiungi 100 μL del tampone di colorazione ThT/Hoechst preparato a ogni pozzo di tintura. Aggiungi 100 μL di 1x DPBS al controllo non colorato.

6. Incubazione

  1. Posiziona il piatto in un luogo buio a temperatura ambiente (25 °C) per 30 minuti.

7. Lavaggio

  1. Aspirare con cura o eliminare la soluzione di colorazione da ogni pozzo, facendo attenzione a non disturbare il monostrato della cellula.
  2. Aggiungi 100 μL di 1× DPBS in ogni pozzo e lascia un ammollo leggero opzionale di 30 secondi.
  3. Aspira con cura o scarta la soluzione di lavaggio DPBS.
  4. Ripeti il lavaggio aggiungendo 100 μL di 1x DPBS fresco in ogni pozzo, permettendo ancora una pausa di 30 secondi di immersione delicata, poi elimina la soluzione di lavaggio DPBS.
  5. Dopo il secondo lavaggio, aggiungi 100 μL di 1x DPBS fresco in ciascun pozzo.

8. Misurazione della fluorescenza

  1. Prima di leggere il segnale di fluorescenza, rimuovere il condensatore dalla piastra a 96 pozzi. Misurare la fluorescenza usando uno di due metodi: lettura a singolo punto o lettura a quattro punti.
  2. Inserire la piastra a 96 pozzi in un lettore di micropiastre e misurare la fluorescenza usando le seguenti impostazioni: Fluorescenza ThT: eccitazione a 450 nm, emissione a 490 nm; Fluorescenza di Hoechst 33342: eccitazione a 360 nm, emissione a 460 nm; impostazioni del lettore: Tremare: 5 secondi prima di leggere; Indicazioni di lettura: Prima lettura; Tempo di integrazione: 140 ms; Altezza di lettura: 1,00 mm; Punti per well: 1 (endpoint) o 4 (scansione del pozzo); Impostazione della scansione del pozzo: (Impostazione densità: 2; Spaziatura punti: 2,5).

9. Analisi dei dati

  1. Calcola l'aggregazione proteica come segue:
    figure-protocol-1
  2. Normalizza l'intensità della fluorescenza ThT impostando il rapporto nelle cellule MCF7 a 1 (controllo di base).

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Risultati

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Per indagare la presenza di aggregati proteici ricchi di β fogli nelle cellule tumorali al seno, le linee cellulari MCF7 e Hs578T sono state sottoposte a colorazione con ThT seguita da quantificazione della fluorescenza. Come mostrato nella Figura 1, le celle sono state seminate in quattro pozzi di una piastra da 96 pozzi, con un pozzo designato come controllo non colorato. I restanti tre pozzi sono stati colorati con ThT secondo il protocollo standard. La f...

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Discussione

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Quando si seminano le cellule in piastre a 96 pozzi, spesso è difficile ottenere una distribuzione uniforme sulla superficie del pozzo, poiché non è sempre possibile scuotere o battere delicatamente la lastra per distribuire le cellule. Questa distribuzione disomogenea può introdurre variabilità nell'intensità del segnale attraverso il pozzo. La lettura della fluorescenza multipunto ha rivelato una variazione significativa tra diverse regioni all'interno dello stesso pozzo, evidenziando ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano con gratitudine l'assistenza tecnica fornita dal Basic Medical Core Laboratory presso il College of Medicine dell'Università I-Shou. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Ospedale E-DA [EDAHJ114001 a C.-C.C.] e del Consiglio Nazionale per la Scienza e la Tecnologia, Taiwan [NSTC 112-2813-C-214-032-B a B.-H. C]

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra di coltura a 96 pozziSemplicementePC396-0100
ContrascorrimentoInvitrogenC10228
Contessa II FL Contatore Automatico delle CelleThermo Fisher Scientific AMQAF1000
dPBSSemplicementeCC704-0500
Tubo di EppendorfSemplicementePC101-5000
Hoechst 33342AAT Bioquest17530
SpectraMax iD3Dispositivi molecolari735-0391 
Tioflavina TSigma-AldrichT3516
Trippan BlueInvitrogenT10282

Riferimenti

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