Articolo metodologico

Un modello murino basato su tapis roulant per l'indagine sulle vampate di calore con il monitoraggio continuo della temperatura cutanea

DOI:

10.3791/68922

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14 ottobre 2025

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1State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Fudan University, 2Department of Endocrinology, Jinshan Hospital, Fudan University, 3Institutes of Biomedical Sciences, School of Life Sciences, Inner Mongolia University, 4Department of Endocrinology and Metabolism, Zhongshan Hospital, Human Phenome Institute, Fudan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo studio stabilisce un modello murino di vampate di calore in menopausa combinando l'ovariectomia con la termogenesi indotta dall'esercizio e il monitoraggio continuo della temperatura cutanea della coda ad alta risoluzione.

Abstract

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Le vampate di calore compromettono significativamente la qualità della vita nelle donne in menopausa, ma i meccanismi neurali sottostanti e le terapie efficaci rimangono poco compresi. Una delle principali sfide in questo campo è stata la mancanza di modelli animali affidabili e di metodi non invasivi per il monitoraggio continuo della temperatura cutanea. Qui, è stato sviluppato un modello murino che combina l'ovariectomia con la termogenesi indotta dall'esercizio per studiare le vampate di calore. Utilizzando un registratore telemetrico protetto da un manicotto di coda stampato in 3D, la temperatura della pelle della coda è stata monitorata continuamente in uno stato senza stress. Inoltre, le telecamere a infrarossi hanno fornito un metodo complementare per monitorare la produzione e la dissipazione del calore, consentendo una valutazione più completa della temperatura corporea. Utilizzando questo modello, è stato riscontrato che i topi ovariectomizzati mostravano aumenti della temperatura cutanea più elevati e una temperatura corporea interna più bassa, imitando efficacemente il fenotipo delle vampate di calore osservato in menopausa. Questo approccio stabilisce un modello preciso per il monitoraggio delle vampate di calore e sarà prezioso per i ricercatori in studi di termoregolazione, neuroscienze e menopausa clinica.

Introduzione

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Le vampate di calore sono tra i sintomi più diffusi e dirompenti della menopausa e compromettono significativamente la qualitàdella vita. Questi episodi sono caratterizzati da un improvviso aumento della temperatura cutanea seguito da un calo transitorio della temperatura corporea interna2, spesso accompagnato da aumento della frequenza cardiaca, ansia e vertigini3. Nonostante il loro profondo impatto, i trattamenti efficaci rimangono limitati4, sottolineando la necessità di una comprensione più profonda dei loro meccanismi sottostanti.

Un passo fondamentale nello studio delle vampate di calore è lo sviluppo di modelli animali affidabili che replicano accuratamente la disfunzione termoregolatrice. Attualmente, l'approccio primario prevede l'ovariectomia (OVX), che induce un'alterazione della temperatura cutanea e corporea 5. Tuttavia, questi cambiamenti sono spesso incoerenti, in quanto possono essere confusi da stress o fluttuazioni della temperatura ambiente6. Inoltre, l'acquisizione di eventi sporadici simili a vampate di calore rimane impegnativa. Metodi alternativi impiegano agenti farmacologici (ad es. senktide, capsaicina, tamoxifene o naloxone) per innescare la vasodilatazione cutanea acuta nei roditori 7,8,9. Sebbene questi composti producano aumenti rapidi e misurabili della temperatura cutanea, la loro somministrazione invasiva e gli effetti dose-dipendenti complicano l'interpretazione delle risposte termoregolatorie. Inoltre, non è chiaro se la vasodilatazione indotta da farmaci riassuma pienamente le condizioni fisiologiche delle vampate di calore naturali. Pertanto, è urgentemente necessario un modello animale più raffinato e affidabile.

L'esercizio fisico è un noto modulatore della temperatura corporea ed è stato collegato all'induzione delle vampate di calore negli esseri umani10. Alcuni studi hanno sfruttato l'esercizio forzato nei topi per imitare i modelli di dissipazione del calore simili alle vampate di calore 11,12,13. Sebbene questo approccio fornisca un mezzo non invasivo per provocare fluttuazioni di temperatura, il monitoraggio della temperatura cutanea nei topi attivi, in particolare tramite termografia a infrarossi, è tecnicamente impegnativo. Inoltre, una valutazione completa dei sintomi simili alle vampate di calore richiede una registrazione continua e a lungo termine sia della coda (pelle) che della temperatura corporea interna.

Per superare queste limitazioni, è stato sviluppato un modello murino ottimizzato che combina l'ovariectomia con l'esercizio indotto dal tapis roulant per evocare in modo affidabile risposte termoregolatorie simili alle vampate di calore. Nell'esperimento, i topi C57BL/6J di 8-10 settimane sono stati alloggiati in condizioni standard (ciclo luce-buio 12:12, 22 °C ±1 °C, 50% ± 10% di umidità). Inoltre, un registratore di temperatura telemetrico protetto da un manicotto di coda stampato in 3D è stato progettato per consentire un monitoraggio continuo e senza stress della temperatura della coda nei topi che si muovono liberamente. È stata incorporata anche la termografia a infrarossi per fornire dati complementari sulla produzione e la dissipazione del calore. Questo modello servirà come strumento prezioso per studiare i meccanismi delle vampate di calore e valutare potenziali interventi terapeutici.

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Protocollo

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Questi metodi sono stati progettati per i modelli murini. Gli studi sui topi sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Fudan (2021JS0040). Prima dell'attuazione del protocollo, gli animali venivano alloggiati in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. In questo studio, topi femmina C57BL/6J di età compresa tra 8 e 10 settimane, del peso di 20-23 g, sono stati alloggiati in condizioni standard (ciclo luce-buio 12:12 ore, 22 °C ± 1 °C, 50% ± 10% di umidità). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione sperimentale

  1. Preparare dieci topi femmina di 8-10 settimane alloggiati in condizioni standard (ciclo luce-buio 12:12, 22 °C ±1 °C, 50% ± 10% di umidità) con cibo e acqua ad libitum .
  2. Assegna casualmente i topi in gruppi OVX e sham (n = 5/gruppo). Casa raggruppata per aiutare con la sincronizzazione dei cicli estrali.
  3. Configurazione del protocollo del tapis roulant
    1. Aprire il software di controllo del tapis roulant "TSE TreadMill (USB) 5.1.7_2" sul computer collegato (Figura supplementare 1).
    2. Inizializzare un nuovo file sperimentale selezionando File > Inizializza un nuovo file dalla barra dei menu.
    3. Programmare il protocollo in esecuzione:
      1. Impostare il primo segmento: accelerazione 0-20 s da 0-0,17 m/s.
      2. Impostare il secondo segmento: velocità costante 20-150 s a 0,17 m/s.
      3. Impostare il terzo segmento: accelerazione di 150-170 s da 0,17-0,25 m/s.
      4. Impostare il segmento finale: 170-600 s velocità costante a 0,25 m/s10,12.
        NOTA: Non utilizzare la stimolazione elettrica in questo esperimento per evitare ulteriore stress.

2. Monitoraggio del ciclo estrale

  1. Spalmare i tamponi vaginali su un vetrino di colorazione ogni giorno alla stessa ora ogni giorno per 8 giorni consecutivi lavandoli con 100 μL di PBS sterile utilizzando una pipetta.
  2. Asciugare i campioni all'aria su vetrini per 24 ore in una cappa aspirante.
  3. Immergere brevemente i campioni in metanolo al 100% a temperatura ambiente.
    ATTENZIONE: Il metanolo è tossico per inalazione, ingestione o contatto con la pelle. Utilizzare in una cappa aspirante ben ventilata, indossare guanti in nitrile ed evitare scintille/fiamme.
  4. Diluire il colorante commerciale 20× Giemsa a 1× utilizzando PBS.
  5. Colorare i vetrini fissi con metanolo con 1× Giemsa al buio per 1-2 ore.
  6. Esaminare la citologia vaginale per determinare gli stadi estrali sulla base di questi studi14,15.
  7. Procedere con gli esperimenti quando i topi sono in proestro (Figura 2B).
    NOTA: Maneggiare delicatamente i topi per evitare l'interruzione del ciclo indotta dallo stress. Evitare l'inserimento profondo dei puntali delle pipette per prevenire la pseudo-gravidanza.

3. Chirurgia ovariectomica

  1. Registra il peso dei topi e anestetizza i topi con isoflurano. Utilizzare un termoforo per mantenere la temperatura corporea dell'animale durante l'operazione.
  2. Radere i peli della regione dorsolaterale bilateralmente prima delle zampe posteriori e disinfettare con etanolo al 70% e iodio alternativamente per 3 volte.
  3. Praticare un'incisione paravertebrale lunga 1 cm sulla pelle e utilizzare uno strumento a punta smussata per separare la pelle dal tessuto muscolare sottostante. Quindi, praticare l'incisione nella parete muscolare. Esporre i cuscinetti adiposi ovarici con bastoncini di cotone.
  4. Legare i vasi sanguigni ovarici con punti di sutura. Asportazione ovaie con forbice chirurgica16.
  5. Chiudere l'incisione a strati, i muscoli e la pelle con punti di sutura non assorbibili. Pulire delicatamente la pelle intorno al sito chirurgico con soluzione fisiologica per rimuovere il sangue secco o lo scrub antisettico residuo.
  6. Per i controlli fittizi, tagliare un pezzo del cuscinetto adiposo senza toccare le ovaie.
  7. Monitorare la salute dei topi ogni giorno per 7 giorni dopo l'operazione.
    NOTA: Assicurarsi che i topi siano tenuti su un termoforo a circa 35 °C durante il processo di anestesia.

4. Impianto del registratore di temperatura interna

  1. Programmazione e inizializzazione del logger (Figura 2 supplementare).
    1. Inserire il registratore di temperatura verticalmente nella docking station.
    2. Fare clic su Registratore > Connetti nella barra dei menu del software.
    3. Selezionare Modifica > Nuova Def. Seq. Misurazione dalla barra dei menu.
    4. Scegli Intervalli di registrazione multipli dalle opzioni della modalità di registrazione.
    5. Impostare i parametri: Data di inizio: [AAAA-MM-GG HH:MM], Data di fine: [AAAA-MM-GG HH:MM], Intervallo di registrazione: 5 min.
    6. Aggiungere l'impostazione degli intervalli alla sequenza.
    7. Fare clic su Registratore > avviare una nuova sequenza di misurazione.
  2. In anestesia, radere e igienizzare la pelle dell'addome.
    NOTA: Questa procedura di impianto del registratore di temperatura addominale può essere eseguita insieme alla chirurgia OVX per evitare più interventi chirurgici.
  3. Praticare un'incisione cutanea della linea mediana di 2 cm, circa 1 cm sotto il diaframma.
  4. Estendere l'incisione lungo la linea alba per aprire la cavità peritoneale.
  5. Inserire delicatamente il registratore di temperatura interna nella cavità addominale lungo il piano sagittale.
    NOTA: Il posizionamento corretto è fondamentale per letture accurate della temperatura. Evitare il posizionamento superficiale vicino alla pelle, poiché la temperatura ambiente potrebbe interferire con le misurazioni.
  6. Sutura l'incisione addominale utilizzando suture 5-0 non assorbibili.
  7. Disinfettare l'addome con una soluzione di iodio.
    NOTA: Monitorare attentamente l'animale durante il recupero. Mantieni un ambiente caldo usando un termoforo fino a quando i topi non sono completamente svegli.

5. Attacco per registratore di temperatura montato sulla coda

  1. Programmazione e inizializzazione del logger (fare riferimento alla procedura del passaggio 4.1, modifica dell'intervallo di registrazione a 2 min).
  2. Pulisci la coda con un colpo di etanolo. Disinfettare la guaina 3D con etanolo al 70% e fissare il registratore di temperatura all'interno della guaina.
  3. Applicare l'adesivo a indurimento rapido sulla guaina. Posizionare il logger a 1 cm dalla base della coda (Figura 1A). Assicurarsi che la faccia di rilevamento del logger sia a stretto contatto con la pelle. Assicurarsi che il logger sia fissato sul lato ventrale della coda per ridurre al minimo il carico di movimento.
  4. Tenerlo in posizione con pressione per 2 minuti. Se necessario, utilizzare una breve anestesia per un posizionamento preciso.
    NOTA: Monitorare quotidianamente il rigonfiamento della coda o il distacco del logger dopo il posizionamento. Un dispositivo correttamente collegato potrebbe rimanere bene per almeno 3 giorni.

6. Corsa su tapis roulant e raccolta dati

  1. Acclimatare i topi al tapis roulant durante la fase di luce per 3 giorni utilizzando il protocollo al punto 1.3.
    1. Posizionare i mouse singolarmente sul nastro del tapis roulant fisso. Concedi 10 minuti per l'esplorazione e l'abitudine all'ambiente.
    2. Eseguire il protocollo:
      1. Fare clic sul pulsante Misura . Fare clic su Avvia per inizializzare il tapis roulant.
      2. Selezionare Avvia profilo per avviare il protocollo di esecuzione programmato.
  2. Collegare il registratore di temperatura di coda 24 ore prima degli esperimenti per una buona assuefazione (vedere il passaggio 5).
  3. Tapis roulant in corsa nella fase leggera della giornata sperimentale:
    1. Registrare la temperatura basale per 30 s utilizzando una telecamera a infrarossi 10 minuti prima dell'esercizio. La temperatura interna viene registrata simultaneamente utilizzando il registratore di temperatura addominale impiantato.
    2. Esegui i mouse sul tapis roulant secondo il protocollo nel passaggio 1.3.
      NOTA: Assicurarsi che i mouse funzionino continuamente per 600 s. Se i topi smettono di correre, incoraggia delicatamente il movimento continuo usando una spazzola per capelli.
    3. Dopo la corsa sul tapis roulant, trasferisci i topi in gabbie pulite. Misurare la temperatura della coda tramite termografia a infrarossi a 0 min, 5 min, 10 min e 15 min dopo l'esercizio.

7. Analisi dei dati

  1. Per i dati a infrarossi e sulla temperatura interna:
    1. Calcola il valore di base come temperatura media pre-esercizio.
    2. Traccia il ΔT (linea di base della temperatura post-esercizio) per ogni punto temporale.
  2. Per i dati del registratore di temperatura della coda:
    1. Usa la media pre-esercizio di 10 minuti come base.
    2. Calcola il ΔT a intervalli di 2 minuti per 15 minuti dopo l'esercizio.

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Risultati

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Sviluppo di un sistema di monitoraggio termoregolatorio affidabile

Per stabilire un modello affidabile per la misurazione della temperatura interna e della pelle, è stato progettato un manicotto di coda personalizzato stampato in 3D per fissare saldamente un registratore di temperatura a 1 cm dalla base della coda (Figura 1A), consentendo una misurazione continua e precisa della dis...

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Discussione

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Questo studio stabilisce un modello murino pratico e quantitativo per studiare le vampate di calore in menopausa, affrontando una lacuna critica nel campo. L'integrazione dell'ovariectomia con la termogenesi indotta dall'esercizio fisico ricapitola con successo le caratteristiche fondamentali delle vampate di calore umane, vale a dire, un rapido aumento della temperatura della pelle della coda seguito da un calo della temperatura corporea interna18. Questo modello...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio per la loro assistenza con questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi della National Natural Science Foundation of China 32171144 e dal Noncommunicable Chronic Diseases-National Science and Technology Major Project (2024ZD0530300).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Registratore di temperatura impiantabile per animaliStar-OddiDST nano-T
Topi C57BL/6JGemPharmatechN000013
Soluzione colorante GiemsaBeyotimeCodice: C0133
Immagini termiche a infrarossi VarioCAMTesta VC HD 980
Sistemi di tapis roulantTSETreadmill_6M

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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