Mutagenesi basata su CRISPR-Cas9 nel Nematode entomopatogeno Steinernema hermaphroditum e il mantenimento delle linee mutanti

Sommario

Questo articolo dimostra l'ingegneria genomica mediata da CRISPR-Cas9 in Steinernema hermaphroditum, un nematode entomopatogeno (EPN: insetto-parassita) e un modello genetico emergente. La tecnologia descritta è utile per creare mutanti, permettendo di chiarire le funzioni geniche nella biologia dei nematodi rilevanti per la simbiosi mutualistica e parassitaria.

Abstract

I nematodi entomopatogeni (EPN) dei generi Steinernema e Heterorhabditis mantengono interazioni mutualistiche rispettivamente con Xenorhabdus e Photorhabdus symbiotic. Insieme, queste coppie nematode-batterio infettano e uccidono insetto ospiti principalmente larve degli ordini di Lepidotteri e Coleotteri, formando un sistema tripartito e trattabile per dissezionare la base molecolare del mutualismo e del parassitismo. Un passo chiave per utilizzare appieno questo modello è lo sviluppo di strumenti genetici stabili e transgenerazionali nelle EPN. Qui dimostriamo una piattaforma affidabile di editing genomico CRISPR–Cas9 nel modello emergente Steinernema hermaphroditum, una specie facilmente mantenuta in vivo e in vitro, e altamente adatta alla microiniezione gonadicale. È importante sottolineare che la sua riproduzione ermafrodita semplifica notevolmente la generazione e il mantenimento delle linee mutanti omozigoti. Forniamo un protocollo dettagliato per la disruption genica efficiente e mirata utilizzando la somministrazione tramite microiniezione dei complessi ribonucleoproteici Cas9. Come prova di concetto, abbiamo modificato il gene associato al muscolo conservato unc-22, generando un fenotipo caratteristico di spasmi che valida la mutagenesi mirata in questo sistema. Questa piattaforma CRISPR–Cas9 apre la porta a una manipolazione genetica stabile in S. hermaphroditum, come l'espressione dei transgeni, e fornisce un quadro che può essere esteso ad altre specie EPN di importanza agricola ed ecologica.

Introduzione

I nematodi entomopatogeni (EPN) sono parassiti che uccidono insetti e formano partnership mutualistiche specifiche per specie con i loro simbionti^{batterici 1}. Le EPN sono composte da due famiglie: Steinermatidae e Heterorhabditidae, che si associano rispettivamente ai batteri Gram-negativi di Photorhabdus e Xenorhabdus spp. Durante la fase giovanile infettiva libera (IJ) dei nematodi Steinernema, i batteri Xenorhabdus sono ospitati in una tasca intestinale del nematode nota come ricettacolo, e quando l'insetto ospite penetra nell'emocoello, i batteri vengono rilasciati, dopodiché si moltiplicano e uccidono l'insetto per^{setticemia 3,4}. In questa relazione mutualistica, i batteri producono composti antimicrobici e insetticidi, che proteggono dalla risposta immunitaria dell'ospite e forniscono supporto nutrizionale al^{nematode 5}. In cambio, i batteri beneficiano della protezione fornita dal nematode ospite contro i microbi ambientali e sono facilitati nella loro dispersione verso nuove prede^{insetti 6,7}.

Negli ultimi decenni, la partnership Steinernema-Xenorhabdus è stata stabilita come un potente sistema sperimentale per studiare vari aspetti delle interazioni parassitarie e mutualistiche, come i comportamenti di ricerca di insetto^{ospite 3}, la colonizzazione batterica nel nematode^{ospite 8} e i comportamenti adattivi dei batteri simbiotici che facilitano le loro transizioni tra nematodi e animali ospiti^{insetti 9}. Gli EPN sono anche specie importanti per la sostenibilità del suolo e vengono utilizzati come agenti organici per il controllo dei parassetti per promuovere la produttività^{agricola 10,11}.

Nonostante il rapido sviluppo di strumenti genetici nei batteri simbiotici Xenorhabdus e Photorhabdus¹², gli strumenti genetici costanti nelle EPN sono stati rari. La microiniezione gonadale è stata stabilita con successo sia nei nematodi Heterorhabditis che in quelli di Steinernema ^13,14. In precedenza, la microiniezione gonadale nel Heterorhabditis bacteriophora è stata utilizzata per fornire costantemente RNA a doppio filamento per la riduzione genica tra la prima generazione di^{progenie 13,15}. Recentemente, l'editing genomico CRISPR-Cas9 in Steinernema è stato sviluppato, emesso tramite microiniezione gonadale e ha portato a mutazioni precise, stabili ed^{ereditabili 14}.

Una specie di Steinernema, S. hermaphroditum, si è dimostrata altamente trattabile e con grande potenziale come organismo modello genetico^{emergente 4,14}. Originariamente isolato dal suolo in Indonesia¹⁶ e ri-isolato in India¹⁷, S. hermaphroditum è costantemente ermafrodita, con un piccolo numero di maschi per generazione, due caratteristiche che facilitano l'adattamento degli strumenti genetici del nematode modello classico C. elegans⁴. Inoltre, il genoma di S. hermafroditum è stato sequenziato e assemblato nei cromosomi, semplificando il compito di identificare potenziali siti target Cas9 e progettare primer¹⁸.

Durante la microiniezione di EPN, una miscela di iniezione contenente reagenti appropriati, come dsRNA, proteina Cas9 o RNA guida, viene consegnata al nematode sinciziale tramite un ago estratto da un capillare di quarzo. Il volume e la pressione appropriati di iniezione producono un 'flusso' visibile di liquido in tutto il braccio gonadale. Poiché questi nematodi hanno una coppia di gonadi sinciziali composte da nuclei germinali che condividono lo stesso citosol¹⁹, questo approccio di microiniezione consente di essere accessibili più cellule germinali per l'editaggio, prima che avvenga la citocinesi, separando i nuclei germinali in ovociti^{in sviluppo 20}. Sebbene la microiniezione gonadale serva come tecnica coerente per la modulazione genetica in diverse specie di nematodi non modello 14,21,22,23,24,25, è fondamentale adattare le tecniche di iniezione alle strutture gonadali appropriate, allo stadio vitale e alle condizioni fisiologiche di ciascuna specie di nematode per garantire successo e alta efficienza nella somministrazione. Le tecniche di recupero post-iniezione e la manutenzione delle linee mutanti sono entrambe importanti per garantire che questa tecnica sia economicamente efficiente.

Questo studio dimostra un protocollo di editing genomico CRISPR-Cas9 nello Steinernema hermaphroditum. La microiniezione gonadale è descritta nel giovane adulto, uno stadio resistente alla microiniezione ad alta pressione e ricettivo all'editing^{genico 14}. Inoltre, sono forniti metodi dettagliati per il mantenimento delle linee mutanti ereditarie e stabili, sia tramite crioconservazione che tramite la propagazione tramite insetti.

Protocollo

I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del nematode prima della microiniezione

1. Prepara piastre di Mezzo di Crescita Nematode (NGM) con i batteri Xenorhabdus griffiniae e Comamonas aquaticus.
   NOTA: Coltivare nematodi di S. hermaphroditum sul loro batterio simbiotico nativo Xenorhabdus griffiniae prima della microiniezione per massimizzare la crescita dei nematodi e recuperare animali iniettati sul batterio Comamonas aquaticus per aumentare la sopravvivenza^{post-iniezione 14}.
   1. Strisciare il batterio X. griffiniae su piastre agar LB-piruvato (2,5 g di estratto di lievito, 5 g di triptone, 2,5 g di cloruro di sodio, 0,5 g di piruvato di sodio, 7,5 g di agar in 500 mL d'acqua) e incubare durante la notte a 30 °C.
   2. Striscia il batterio C. aquaticus su piastre di agar LB e incuba durante la notte a 37 °C.
   3. Scegli una singola colonia di batteri per inoculare il substrato liquido LB scuro (5 g di estratto di lievito, 10 g di triptone, 5 g di cloruro di sodio in 1 litro d'acqua). Coltivare la coltura batterica durante la notte (massimo 16 ore) con aerazione (X. griffiniae a 30 °C e C. aquaticus a 37 °C).
   4. Preparare agar NGM: (3 g di NaCl, 2,5 g di peptone e 20 g di agar aggiunti a 975 mL d'acqua, con 1 mL di colesterolo, 1 mL 1 M_{CaCl 2}, 1 mL 1 M MgSO₄, 25 mL 1 M_{KPO 4} aggiunto dopo l'autoclav) 10 mL per piastra di Petri da 60 mm x 15 mm.
   5. Batteri dei semi: Aggiungi alcune gocce della coltura batterica notturna su ogni piastra di agar NGM, scuote delicatamente per diffondere le gocce batteriche in una toppa.
   6. Incubare piastre NGM con semina batterica a temperatura ambiente per permettere l'agar di asciugarsi e la crescita dei batteri.
      NOTA: Le lastre con semi di X. griffinae devono essere utilizzate il prima possibile; Le piastre di C. aquaticus possono essere conservate a temperatura ambiente per 1-2 settimane.
2. Stadio del nematode
   NOTA: Scegli lo stadio J3 dell'ermafrodite la sera prima dell'iniezione e i giovani adulti il giorno dell'iniezione.
   1. Smonta o pezza i nematodi di S. hermafroditum sulle lastre NGM preparate con semine di X. griffiniae. Incubare a una temperatura di 25-28 °C per una crescita ottimale.
   2. La notte prima della microiniezione, selezionare lo stadio J3 degli ermafroditi su agar NGM seminato con X. griffiniae. Come mostrato nella Figura 1A, lo stadio J3 è stimato in base alla dimensione del nematode e alla morfologia delle gonadi e della vulva.
   3. Il giorno della microiniezione, scegliere giovani ermafroditi adulti (Figura 1B).

2. Preparazione CRISPR-Cas9 per microiniezione

1. Selezione dei crRNA CRISPR e dell'archiviazione dei reagenti
   1. Estrarre la sequenza genica target dal genoma di riferimento Steinernema hermaphroditum utilizzando BlastP, PRJNA982879.
   2. Seleziona una sequenza di esoni codificante precoce, se possibile, preferibilmente il primo esone, e inserisci la sequenza in CRISPRScan usando le impostazioni^{predefinite 26} per generare una lista di possibili RNA CRISPR (crRNA).
   3. Schietta i crRNA superiori contro il genoma di S. hermafroditum per assicurarti che vengano scelti solo crRNA unici.
      NOTA: Opzionale: Confermare la sequenza della regione bersaglio del genoma tramite amplificazione PCR e sequenziamento Sanger prima della progettazione del crRNA, per garantire un legame efficiente dei crRNA.
   4. Conservare gli RNA CRISPR (crRNA) e gli RNA CRISPR transattivanti universali (tracrRNA) a 100 μM ciascuno in un buffer duplex a -80 °C.
   5. Conserva la proteina Cas9 a 10 mg/mL a -20 °C o -80 °C. Conserva 1 M KCl a 4 °C.
2. Preparazione del tampone di agarosio al 2% per l'iniezione (adattato da Berkowitz et ^al.27)
   1. Sciogli il 2% di agarosio in acqua usando un forno a microonde.
   2. Trasferire 50 μL di agarosio fuso su un vetro di copertura (48 x 60 mm n.1). Copri immediatamente la goccia d'agarosio con un altro bicchiere da copertura.
   3. Lascia asciugare l'agarosio a temperatura ambiente per 20 minuti. Rimuovi il vetro superiore del coperchio. Etichetta il lato anteriore del tampone di agarose.
      NOTA: Opzionale: Cuocere il tampone di agarosio a 37 °C durante la notte per asciugare ulteriormente il tampone di agarosio.
   4. Conserva i cuscinetti di agarosio al 2% a temperatura ambiente per mesi o anni.
3. Preparazione dell'ago
   1. Produrre aghi al quarzo utilizzando i seguenti parametri su un estrattore di filamenti laser. Con il tiratore di ago usato in questo studio, il programma suggerito è il seguente: Calore: 700, Filamento: 4, Velocità: 60, Ritardo: 145, Tirata: 175.
   2. Estrai gli aghi al quarzo (OD: 1,0 mm, ID: 0,7 mm) immediatamente prima dell'iniezione, o in anticipo, e conservali in una scatola per le pipette.
      NOTA: In alternativa, abbiamo anche avuto successo nell'iniezione con aghi borosilicato (OD: 1,2 mm, ID: 0,68 mm). Nota che le diverse dimensioni di aghi corrispondono a diverse dimensioni di portaferri.

3. Microiniezione CRISPR-Cas9 e recupero dei nematodi dopo microiniezione

1. Preparare la miscela di microiniezione CRISPR-Cas9 (adattata da Wang et ^al.28)
   1. Preparare nuovi duplex di RNA guida mescolando i crRNA scelti e il tracrRNA universale in un rapporto 1:1, cioè crRNA totale rispetto a tracrRNA in un tubo PCR:
      crRNA #1 (100 μM) - 1,5 μL
      crRNA #2 (100 μM) - 1,5 μL
      tracrRNA (100 μM) - 3,0 μL
      NOTA: Se si utilizza co-CRISPR, crRNA #1 mira al gene marker unc-22 , mentre crRNA #2 può essere sostituito con un'altra sequenza che mira un secondo gene di interesse.
   2. Incubare il tubo PCR in un termociclatore a 94 °C per 2 minuti e poi raffreddarlo a temperatura ambiente.
   3. Assembla la miscela di iniezione combinando quanto segue, poi incuba per 5 minuti a temperatura ambiente:
      Cas9 (10 mg/mL) - 2 μL
      1M KCl - 0,58 μL
      Duplex gRNA (dal passaggio 3.1.1) - 2,7 μL
   4. Mescola tre volte facendo scattare il tubo PCR, seguito da una breve rotazione (10-15 s) in una mini centrifuga per raccogliere il contenuto del tubo. Dopo il mix finale, gira giù per un po' più lungo, fino a 1 minuto.
2. Carica e rompi l'ago
   1. Carica l'ago con 1-2 μL di miscela iniezione usando una punta microcaricatore.
   2. Assemblare l'ago al porta-garo per la pipetta, poi aprire la punta trascinando l'ago su un pezzo di nastro adesivo a doppia faccia ricoperto di olio halocarbonico. Testare l'apertura dell'ago usando la funzione CLEAN del microiniettore.
3. Microiniezione nelle gonadi sinciziali di un neomatode giovane adulto
   1. Trasferisci una piccola goccia di olio di alocarbonio su un tampone di agarosio al 2%.
   2. Sotto lo stereoscopio dissezionante, utilizzare un sottile filo di platino (morbido) per sollevare un neotodode ermafrodita giovane adulto e lavarlo in un tampone M9 (per litro: 3 g KH₂PO4, 11,3 g_{Na 2HPO 4}, 5 g NaCl, con 1 ml 1 M MgSO₄ aggiunto dopo l'autoclav) per rimuovere i batteri (vedi nematode giovane adulto nella Figura 1).
   3. Trasferisci il nematode lavato su un tampone di agarosio e mettilo nella goccia di olio di alocarbonio. Usa un filo di platino morbido per spazzolare delicatamente il nematode finché l'animale non è immobilizzato.
   4. Posiziona con cura il tampone di agarosio sullo stadio di microiniezione. L'orientamento del sincizio gonadale dovrebbe essere puntato verso l'ago con un angolo di circa 45°. Inizia con un ingrandimento 5x, poi passa a ingrandimenti 20x e 40x per le iniezioni.
   5. Assicurarsi che l'ago penetri nel sincizio, poi utilizzare la funzione CLEAN del microiniettore per introdurre la miscela di iniezione a circa 99 psi finché non si osserva un flusso gonadale chiaro di liquido iniettato per garantire che i reagenti accedano alle cellule germinali nel sincizio gonadale.
   6. Se il secondo braccio gonadale è accessibile, sposta il palco per posizionare l'ago da iniettare nel secondo braccio.
4. Recupero dei nematodi dopo l'iniezione
   1. Immediatamente dopo l'iniezione, risospendere l'animale iniettato in 1-2 μL di tampone M9 sul cuscinetto di agarosio.
   2. Usando un sottile filo di platino, raccogli il nematode iniettato dal tampone di agarosio e lava via l'olio usando il tampone M9.
   3. Recuperare i nematodi sulle placche NGM con un prato di batteri C. aquatica (preparazione della piastra NGM: vedi passo 1.1), che aumenta il tasso di sopravvivenza dei nematodi dopo l'iniezione¹⁴. Incubare a 25 °C durante la notte.
   4. Il giorno successivo, isolare ogni nematode iniettato (P0) su una singola piastra NGM con semina di X. griffiniae. Lascia che gli animali P0 producano progenie F1 durante la notte (sia deponendo uova che mettendo in sacchi) per fenotipizzazione e genotipizzazione (vedi passo 4).

4. Screening per confermare i knockout mediati da CRISPR-Cas9

1. Screening a base di nicotina (ATTENZIONE) per il fenotipo di F1 per i tremori quando si utilizza unc-22 come marcatore co-CRISPR
   1. Trasferire la progenie F1 da animali iniettati con P0 in una soluzione di nicotina al 2%.
   2. Scegli un singolo animale che s'agita dal punto di nicotina e recupera immediatamente l'animale su agar NGM con semi di X. griffiniae. Isolare ogni F1 in contrazione su una singola piastra e lasciarlo produrre animali F2 per la genotipizzazione (vedi passo 4.2).
2. Genotipizzazione
   1. Scegli otto discendenti F2 o F3 da ciascuna linea di contrazioni F1 per la genotipazione. Questi animali probabilmente includono sia eterozigoti +/mut che omozigoti mut/ mut.
   2. Prepara un nuovo tampone di estrazione del DNA aggiungendo 20 μL di proteinasi K (10 mg/mL) a 180 μL tampone di lisi di vermi (50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mM_{MgCl 2}, 0,45% NP-40, 0,45% Tween 20, 0,01% gelatina).
   3. Aggiungere nematodi a 10 μL del buffer di estrazione del DNA nei tubi PCR. Incubare a 65 °C per 10 minuti, poi 95 °C per 15 minuti per estrarre DNA genomico.
   4. Genotipare i nematodi amplificando la regione target Cas9 con PCR seguendo le istruzioni del produttore, utilizzando 1-2 μL di lisato dal passaggio 4.2.2. È importante prevedere ampio spazio, se possibile (almeno 300 bp), tra i siti di taglio Cas9 e i siti di legame dell'innesto nel caso si verifichino grandi delezioni.
      NOTA: L'elettroforesi su gel di agarosio può essere utilizzata per confermare un'amplificazione riuscita prima del sequenziamento.
   5. Pulire il prodotto PCR seguendo le istruzioni del produttore per garantire un'analisi accurata delle tracce di sequenziamento Sanger.
   6. Sequenziare gli ampliconi PCR generati nello step 4.2.4 usando il sequenziamento Sanger e analizzare i cromatogrammi utilizzando il programma^{ICE 29}.
   7. Se gli alleli mutanti sono confermati nel passo 4.2.6, torna alla piastra di contrazione originale F1 e isola almeno otto ermafroditi su singole placche. Permettere a ogni singolo nematode di produrre progenie, poi di massare il genotipo della progenie per confermare l'omozigosità. Le linee omozigoti possono essere mantenute in laboratorio come indicato nel passo 5.

5. Manutenzione della linea CRISPR

NOTA: Esistono tre metodi principali di manutenzione della linea. Questi includono criopreservazione basata su trealosio e DMSO (passo 5.1), passaggio in vivo attraverso vermi (passo 5.2) e mantenimento in vitro su placche NGM (passo 5.3).

1. Criopreservazione Trealosio-DMSO di linee di tipo selvatico e mutante
   NOTA: Utilizzando il metodo di crioconservazione trealosio-DMSO⁴, S. hermafroditum può essere conservato stabilmente a lungo termine a -80 °C e recuperato su un mezzo NGM. I nematodi vengono congelati in fiale criogeniche da 2 mL. Il congelamento ottimale si ottiene tramite raffreddamento graduale utilizzando un contenitore in schiuma di polistirolo.
   1. Coltiva S. hermaphroditum su NMN seminata con X. griffiniae (vedi passo 1.1) finché la maggior parte della popolazione non sarà J1 o ermafroditi in sacchi.
      NOTA: Evitare gli stadi giovanili infettivi (IJ) poiché non si congelano bene con questo metodo.
   2. Lavare via i vermi nematodi dalle piastre di agar NGM nel tampone M9 e raccogliere in tubi conici da 15 mL fino al limite dei 5 mL. Concentrati tramite centrifugazione (1372 x g per 1-2:30 min è sufficiente).
   3. Rimuovere il sovrandanante e lavare una volta in un tampone di congelamento Trehalose-DMSO a temperatura ambiente da 5 mL tramite centrifugazione seguendo i parametri forniti nel passaggio 5.1.2.
   4. Risospensi i vermi in un tampone di congelamento Trehalosio-DMSO a temperatura ambiente di 5 mL. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti con il tubo di lato. Questo aumenta il tasso di sopravvivenza.
   5. Somministrare 1 mL per tubo in 4 fiale criogeniche.
   6. Metti le fiale in scatole di schiuma di polistirolo nel congelatore a -80 °C.
   7. Una settimana dopo, prova a scongelare una delle fiale.
   8. Trasferisci il resto delle fiale in scatole congelate a -80°C e conserva permanentemente.
   9. Il test di disgelo o recupero di S. hermafroditum da stock congelati
      1. Estrai una fiala dal congelatore e lasciala scongelare completamente a temperatura ambiente.
      2. Versa il contenuto liquido su un piatto nuovo NGM. Si noti che l'aggiunta di un batterio simbiotico non è necessaria poiché lo stock congelato di solito contiene sufficienti batteri simbiotici. I vermi dovrebbero iniziare a riprendersi entro pochi minuti o ore.
      3. Osserva il movimento e la riproduzione del nematode. Dopo uno o due giorni, trasferire diversi nematodi su nuove piastre NGM con X . griffiniae.
2. Manutenzione in vivo tramite Galleria mellonella
   NOTA: Per la crescita in vivo, propagare le linee mutanti di S. hermafroditum attraverso le larve di 5^° stadio di Galleria mellonella (verme della cera). Questo metodo è particolarmente utile per linee non praticabili dopo la crioconservazione. Un protocollo dettagliato e simile per la propagazione naturale dei nematodi entomopatogeni attraverso insetti e altri mezzi per la crescita dell'EPN si trova in (McMullen et ^al.30). In breve:
   1. Permettere ai nematodi di morire di fame e diventare IJ sulle placche NGM.
   2. Usa il buffer M9 per rimuovere gli IJ dalle piastre NGM.
   3. Trasferire gli IJ per infettare gli insetti Galleria usando la trappola bianca.
3. Per la manutenzione in vitro delle placche NGM, segui i passaggi:
   1. Placcare il NGM dei semi con circa 100 μL di coltura liquida fresca del simbionte di S. hermafroditum , X. griffiniae.
   2. Lascia asciugare completamente il cerotto batterico prima di trasferire i nematodi sulla piastra.
   3. Conservare i piatti a 25 °C e trasferire i nematodi su piatti appena seminati circa una volta al mese.

Risultati

Sono stati progettati due RNA CRISPR (identificati dal numero del sito Pam - Pam 3 e Pam 5) che mirano all'omologo di S. hermafroditum dell'unc-22 nei siti^{Pam 14} precedentemente pubblicati (Figura 2A). Ogni crRNA si è complesso con tracrRNA per formare un singolo RNA guida (sgRNA) ed è stato incorporato in Cas9 per formare la ribonucleoproteina come descritto nel passo 3.1. In questo protocollo, due crRNA erano proge...

Discussione

I sistemi animali modello genetici non convenzionali offrono preziose opportunità per studiare la funzione genica eucariota nei contesti ecologici e fisiologici in cui tali tratti si verificano naturalmente, ad esempio in presenza di un ospite parassita o del microbioma nativo di un organismo. Nei nematodi entomopatogeni (EPN), la manipolazione genetica si è basata su alcuni casi di approcci basati su^{RNAi 13,32}. Sebbene l'RNAi permetta stud...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar (80-100 Rete)	Fisher Scientific	BP26411	Utilizzato anche nelle piastre di piruvato LB
Agarose	Fisher Scientific	16500500	Utilizzato anche nella genotipizzazione
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA	IDT	1072532
Alt-R S.p. Cas9 Nucleasi V3	IDT	1081058
Aghi borosilicati	Strumento di Precisione Mondiale	1B120F-4
Cloruro di calcio (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901
Colesterolo	VWR	433	5 mg/mL di etanolo
Comamonas aquatica (DA1877)
Vetro di copertura per il tampone di agarose	Laboratori di ricerca sul cervello	#4860-1D	Spessore No1 di 48 x 60 mm
CRISPRScan			https://www.crisprscan.org/
Dimetil Solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301	0,5 M
DNA Clean e Concentratore-5	Zymo Research	D4014
FemtoJet 4x microiniettore con set di testa di impugnatura, 4 portaago taglia 0	Eppendorf/Calibre	5253000017
Larve di 5° stadio di Galleria melonella	GrubCo		https://www.grubco.com/index.cfm
Sistema di imaging a gel	Azure400	AZI400-01
Colorante di carico gel	Thermo Fisher Scientific	B72
Gelatina (2%)	Sigma Aldrich	G1393
GelRed	Biotium	#41003
Primer per la genotipizzazione: DNA oligo, 25 nmol	IDT	N/A
Gibco Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
Gibco Bacto Triptone	Fisher Scientific	DF0123-17-3	Utilizzato anche in piastre Dark LB, LB Pyruvate & nbsp;
Estratto di lievito Gibco Bacto	Fisher Scientific	DF0127-17-9	Utilizzato anche in piastre Dark LB, LB Pyruvate & nbsp;
Set di testa dell'impugnatura: 4 portaago taglia 1	Calibre	EPE-5196083008	(abbinato all'ago di borosilicato 1B120F-4)
Olio di alocarbonio 700	Sigma Aldrich	H8898
Picker a filo di platino rigido per la manutenzione quotidiana	Ricerca Tritech	PT-9901
Inferenza delle modifiche CRISPR (ICE)	Synthego	N/A	Software utilizzato per analizzare sequenze di Sanger al fine di identificare indel
KCl	Sigma Aldrich	P9541
Estratore laser P-2000	Sutter	P-2000G
Cloruro di magnesio (MgCl2)	Sigma Aldrich	M8266
Solfato di magnesio (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506	Per il buffer M9, utilizzato anche in NGM
Punta microcaricatore 2x96ST	Calibre	930001007
Adattatore di montaggio micromanipolatore per Zeiss Axio Observer e Axiovert 200	Ricerca Tritech	NZ-19-2
Microscopio	Tritech	SMT1
Nicotina	Sigma Aldrich	N3876
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85124
Buffer duplex senza nucleasi	IDT	11-01-03-01
OneTaq MasterMix	NEB	M0486
Scatola di stoccaggio per pipette	Strumenti Sutter	BX10
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma Aldrich	793590
Fosfato di potassio, dibase (K2HPO4)	Sigma Aldrich	P3786	KOH per NGM
Fosfato di potassio, monobasico (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655	Per il buffer M9, utilizzato anche in NGM
Proteinasi K	Sigma Aldrich	P6556
Aghi di quarzo	Strumenti Sutter	QF100-70-10
S. hermaphroditium genoma	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/
sh-unc-22 crRNA Alt-R CRISPR-Cas9	IDT	N/A
Cloruro di sodio (NaCl)	VWR	SS0430	Utilizzato anche nelle piastre di piruvato M9, Dark LB, LB
Fosfato di sodio, dibase (Na2HPO4.7H20)	Sigma Aldrich	S9390	Per il buffer M9
Piruvato di sodio	Sigma Aldrich	P2256	Utilizzato anche nelle lastre di piruvato LB & nbsp;
Picker a filo di platino morbido per microiniezione	Surepure Chemetals	6824	Platino 90%, Filo di lega di iridio al 10%, diametro 0,002 pollici x 5 piedi di lunghezza
Portaago standard	Ricerca Tritech	HI-7
Steinernema hermaphroditum
Microscopio stereo	Leica	Inveta 3
Trealolose	Cole-Parmer	EW-88195-99	0,08 M
Tris	Fisher Scientific	AM9855G	pH 8,0
Preadolescenti 20	Sigma Aldrich	P1379
Adattatore di montaggio per micromanipolatore verticale	Ricerca Tritech	NR2
Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)