Modellazione farmacoforica per bersagli con ampie librerie di ligandi: un caso di studio su SARS-CoV-2 Mpro

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo per la costruzione di un modello farmacoforico di consenso integrando caratteristiche molecolari da più ligandi. Questo metodo è applicabile alle attività di scoperta di farmaci mirati a qualsiasi bersaglio biologico con conformazioni note legate al ligando, consentendo l'identificazione di caratteristiche di interazione chiave per lo screening virtuale e la progettazione razionale di farmaci.

Abstract

Un farmacoforo definisce la disposizione spaziale delle caratteristiche molecolari necessarie per interazioni ottimali tra un composto e il suo bersaglio biologico. Questi modelli possono essere derivati analizzando le interazioni intermolecolari tra un bersaglio e un insieme di ligandi noti nelle loro conformazioni di legame. Un farmacoforo di consenso integra le caratteristiche comuni di più ligandi, riducendo le distorsioni del modello e migliorando il potere predittivo. Tuttavia, la generazione di un robusto farmacoforo di consenso da un set di ligandi ampio e chimicamente diversificato presenta sfide tecniche.

Qui, presentiamo un protocollo per la costruzione di farmacofori di consenso utilizzando ConPhar, uno strumento informatico open source progettato per identificare e raggruppare caratteristiche farmacoforiche in più complessi legati al ligando. Il protocollo include la generazione, il perfezionamento e l'applicazione del modello allo screening virtuale di librerie molecolari ultra-grandi. Come caso di studio, abbiamo applicato il metodo alla proteasi principale (Mpro) di SARS-CoV-2, utilizzando un centinaio di inibitori non covalenti co-cristallizzati con il bersaglio. Il modello farmacoforico risultante ha catturato le caratteristiche chiave dell'interazione nella regione catalitica di Mpro e ha permesso l'identificazione di nuovi potenziali ligandi.

Questa strategia è ampiamente applicabile a qualsiasi bersaglio biologico per il quale sono disponibili conformazioni legate al ligando. È particolarmente utile per i bersagli con ampi set di dati di ligandi e supporta la scoperta razionale di farmaci semplificando l'identificazione di nuovi candidati con i profili di interazione desiderati.

Introduzione

La modellazione farmacoforica è una tecnica fondamentale nella progettazione di farmaci assistita da computer, che consente l'identificazione di caratteristiche molecolari essenziali responsabili dell'attività biologica ^1,2. Un farmacoforo definisce la disposizione spaziale delle caratteristiche, come i donatori di legami idrogeno, gli accettori, gli anelli aromatici e le regioni idrofobiche, necessarie per l'interazione molecolare tra un ligando e un bersaglio biologico³. Quando sono disponibili più complessi ligando-bersaglio, sia dalla cristallografia sperimentale che dalla modellazione molecolare, i modelli di interazione condivisi possono essere integrati in modelli farmacoforici di consenso, aumentando la robustezza del modello e migliorando l'accuratezza dello screening virtuale ^4,5.

Nonostante l'utilità dei farmacofori di consenso, la loro generazione rimane tecnicamente impegnativa, specialmente quando i ligandi sono strutturalmente diversi. Sono disponibili diversi strumenti software per la generazione di farmacofori da singoli ligandi, ma mancano procedure standardizzate per l'integrazione di più set di funzionalità in un modello coerente ^6,7. Inoltre, poche piattaforme offrono flussi di lavoro end-to-end che supportano il clustering delle funzionalità, il filtraggio e l'esportazione in formati compatibili con gli strumenti di screening e visualizzazione⁸. Queste limitazioni hanno limitato l'ampia adozione di farmacofori di consenso negli sforzi di scoperta di farmaci su larga scala.

Per colmare questa lacuna, ConPhar è stato sviluppato come un nuovo strumento open source progettato specificamente per l'estrazione sistematica, il clustering e la modellazione del consenso di caratteristiche farmacoforiche da ampi set di complessi ligando-bersaglio pre-allineati. A differenza del software esistente, ConPhar offre una regolazione flessibile dei parametri, l'integrazione automatizzata delle funzioni e la compatibilità con più formati di output, facilitando la generazione di robusti modelli di consenso adatti alle pipeline di screening virtuale. Questo strumento supera così i precedenti colli di bottiglia nella gestione di librerie di ligandi grandi e chimicamente diversificate, migliorando la riproducibilità e la scalabilità nei flussi di lavoro di modellazione farmacoforica.

Per dimostrare questo approccio, presentiamo un protocollo riproducibile per la costruzione di modelli farmacoforici di consenso da raccolte di complessi ligando-bersaglio. Il flusso di lavoro integra strumenti open source per l'estrazione, il clustering, la visualizzazione e le applicazioni downstream delle caratteristiche dei farmacofori. Come caso di studio, abbiamo applicato il protocollo alla proteasi principale (Mpro) di SARS-CoV-2, un bersaglio terapeutico critico con ampi dati strutturali⁹. Abbiamo curato un set di dati di 100 ligandi non covalenti co-cristallizzati con Mpro (voci PDB al 27 maggio 2025), escludendo le forme apo e i complessi ridondanti. Le singole caratteristiche farmacoforiche sono state estratte e unite in un modello di consenso utilizzando ConPhar, uno strumento specificamente progettato per il clustering delle caratteristiche¹⁰. Questo caso illustra la capacità del protocollo di rivelare modelli di interazione conservati e supportare lo screening razionale di librerie ultra-large.

Protocollo

1. Metodo 1

1. Preparare i ligandi per la generazione di farmacofori di consenso
   1. Allineare tutti i complessi proteina-ligando utilizzando il software PyMOL¹¹.
   2. Estrarre ogni conformatore del ligando allineato e salvarlo come file separato in formato SDF.
      NOTA: Per il protocollo descritto è possibile utilizzare anche altri formati come MOL, MOL2 e PDB.
2. Genera file JSON farmacoforo utilizzando Pharmit¹²
   1. Carica ogni file ligando individualmente su Pharmit utilizzando l'opzione Carica funzioni (vedi Tabella dei materiali per un collegamento a Pharmit).
   2. Utilizzare l'opzione Salva sessione per scaricare il file JSON del farmacoforo corrispondente.
3. Organizzare i file JSON per l'uso in ConPhar
   1. Archivia tutti i file JSON scaricati in un'unica cartella. Questi file verranno caricati nell'ambiente Google Colab nel metodo successivo.

2. Metodo 2

1. Configurare l'ambiente Google Colab
   1. Avvia un nuovo taccuino di Google Colab: apri Google Colab nel browser web e crea un nuovo taccuino e regola le impostazioni per utilizzare una versione precedente selezionando Runtime → Cambia runtime → versione 2025.07 runtime.
   2. Installa Conda e PyMOL. Il codice necessario per installare Conda e PyMOL in Google Colab è fornito qui in corsivo come riferimento e lo script eseguibile completo è disponibile anche nel file di supporto 1.
      # Installa CondaColab: Abilita il supporto dell'ambiente Conda in Google Colab
      da IPython.utils import io
      Importazione di tqdm.notebook
      Importa sistema operativo
      totale = 100
      con tqdm.notebook.tqdm(total=total) come pbar:
      con io.capture_output() come acquisito:
      # Installa CondaColab
      !pip install -q condacolab
      Importazione CondacoLab
      condacolab.install()
      pbar.update(10)
      # Aggiorna il percorso Python per individuare i pacchetti installati
      Importa sistema
      sys.path.append('/usr/local/lib/python3.7/site-packages/')
      pbar.update(20)
      # Installa il bundle PyMOL usando mamba dal canale Schrodinger
      %shell mamba install -c schrodinger pymol-bundle --yes
      pbar.update(90)
   3. Verificare l'esecuzione riuscita: eseguire la cella facendo clic sull'icona di riproduzione o premendo Maiusc + Invio. Una volta eseguita correttamente, verrà visualizzata una barra verde orizzontale sopra la cella (vedere la Figura 1).
2. Installa il pacchetto Python ConPhar e importa i moduli necessari
   1. Installa e importa ConPhar. Il codice necessario per installare il pacchetto ConPhar e importare i moduli necessari in Google Colab è fornito qui in corsivo come riferimento, e lo script eseguibile completo è disponibile anche nel file di supporto 1.
      # Installa il pacchetto di analisi farmacoforica ConPhar
      Importa pymol
      !pip installa conphar
      da Conphar. Importazione di farmacofori parse_json_pharmacophore, show_pharmacophoric_descriptors, save_pharmacophore_to_pymol, save_pharmacophore_to_json, compute_concensus_pharmacophore
      Importa sistema operativo
      Importa panda come PD
      NOTA: La dichiarazione di importazione da conphar. Farmacofori è suddiviso in più righe per chiarezza, ma deve essere inserito come un'unica riga continua. Lo strumento ConPhar (https://github.com/AngelRuizMoreno/ConcensusPharmacophore) è in fase di sviluppo attivo. Il protocollo attuale utilizza una versione stabile (0.1.2), che è stata convalidata per la procedura descritta. Gli utenti sono incoraggiati a utilizzare questa versione per garantire la riproducibilità.
   2. Conferma l'installazione riuscita: Esegui la cella facendo clic sull'icona di riproduzione o premendo Maiusc + Invio. Al termine dell'installazione e dell'importazione degli strumenti ConPhar, verrà visualizzato un messaggio di conferma (vedere la Figura 2).
3. Caricamento di singoli modelli di farmacoforo da file JSON
   1. Creare una cartella per i file JSON del farmacoforo. Il codice necessario per creare una cartella per l'archiviazione dei file di input del farmacoforo in Google Colab è fornito qui in corsivo come riferimento e lo script eseguibile completo è disponibile anche nel file di supporto 1.
      # Crea una cartella per archiviare i file JSON di input
      os.makedirs("JSON_FOLDER", exist_ok=Vero)
      NOTA: questo comando crea automaticamente la cartella se non esiste già.
   2. Carica i file JSON nella cartella: fai clic sull'icona della cartella nel pannello di sinistra di Colab, apri la cartella appena creata e fai clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Carica. Aggiungere i file JSON necessari (vedere la Figura 3).
      NOTA: Assicurarsi che i file seguano il formato previsto generato da Pharmit.
4. Analizza e consolida le caratteristiche farmacoforiche
   1. Estrai le caratteristiche farmacoforiche dai file caricati. Il codice necessario per analizzare i file JSON caricati, estrarre le funzionalità farmacoforiche e archiviarli in un singolo DataFrame in Google Colab è fornito qui in corsivo come riferimento e lo script eseguibile completo è disponibile anche nel file di supporto 1.
      p4_table=PD. DataFrame()
      per il file in os.listdir('/content/JSON_FOLDER'):
      se '.json' nel file:
      provare:
      p4,lig,rec=parse_json_pharmacophore(f"/content/JSON_FOLDER/{file}")
      p4['ligand']=file.replace('.json','')
      p4_table=pd.concat([p4_table;p4];ignore_index=Vero)
      tranne l'eccezione:
      passare
      p4_table
   2. Eseguire la cella facendo clic sull'icona di riproduzione o premendo MAIUSC + INVIO per generare il DataFrame consolidato (vedere la Figura 4). Il DataFrame consolidato risultante compila tutte le caratteristiche farmacoforiche estratte dai singoli ligandi in una tabella unificata, facilitando il clustering a valle e l'analisi statistica.
      NOTA: lo script include la gestione delle eccezioni di base per ignorare i file JSON in formato non valido durante l'elaborazione per evitare l'interruzione del flusso di lavoro. Dato il gran numero di file, controllare ciascuno in anticipo non è pratico; Al contrario, lo script può essere modificato per stampare il nome di qualsiasi file che non viene caricato, in modo che l'utente possa esaminarlo e correggerlo singolarmente.
5. Genera e salva il consenso Farmacoforo
   1. Visualizza tutti i descrittori farmacoforici. Il codice necessario per visualizzare i descrittori farmacoforici estratti dai file di input in Google Colab è fornito qui in corsivo come riferimento e lo script eseguibile completo è disponibile anche nel file di supporto 1.
      show_pharmacophoric_descriptors(p4_table)
   2. Eseguire la cella facendo clic sull'icona di riproduzione o premendo MAIUSC + INVIO per visualizzare il raggruppamento delle caratteristiche farmacoforiche (vedere la Figura 5). Gli output raggruppati raggruppano caratteristiche farmacoforiche simili su più ligandi in base alle loro posizioni spaziali, consentendo l'identificazione di modelli di interazione conservati.
   3. Salva il modello del farmacoforo in formato PyMOL. Il codice necessario per generare e salvare il modello di farmacoforo di consenso in un formato compatibile con PyMOL in Google Colab è fornito qui in corsivo come riferimento e lo script eseguibile completo è disponibile anche nel file di supporto 1.
      save_pharmacophore_to_pymol(p4_table, out_file='ConPhar_pymol.pse')
   4. Eseguire la cella per produrre il file .pse corrispondente (vedere la Figura 6).
   5. Salvare il modello del farmacoforo in formato JSON. Il codice necessario per generare e salvare il modello di farmacoforo di consenso in un formato compatibile con Pharmi in Google Colab è fornito qui in corsivo come riferimento e lo script eseguibile completo è disponibile anche nel file di supporto 1.
      ​save_pharmacophore_to_json(p4_table,out_file=
      «ConPhar_pharmit.json»)
   6. Eseguire la cella per produrre il file di .json corrispondente (vedere la Figura 6).
   7. Genera output e dendrogrammi in cluster di funzionalità. Il codice necessario per generare i file farmacoforici di consenso raggruppati per tipo di funzionalità, inclusi i formati compatibili con PyMOL e Pharmit, e le visualizzazioni dei dendrogrammi in Google Colab è fornito qui in corsivo come riferimento, e lo script eseguibile completo è disponibile anche nel file di supporto 1.
      concensus,links=compute_concensus_pharmacophore
      (p4_table,save_data_per_descriptor=Vero,out_folder='/contenuto')
   8. Eseguire la cella facendo clic sull'icona di riproduzione o premendo MAIUSC + INVIO (vedere la Figura 7). I risultati mostrano visualizzazioni di dendrogrammi, che sotto forma di albero rappresentano le relazioni gerarchiche tra le caratteristiche farmacoforiche raggruppate, aiutando gli utenti a interpretare il grado di somiglianza e la vicinanza spaziale tra i cluster.
      NOTA: Questo passaggio salva più file di output e figure nella cartella specificata.
   9. Esporta i risultati del farmacoforo di consenso in un file CSV. Il codice richiesto per salvare la tabella del farmacoforo di consenso finale in formato CSV in Google Colab è fornito qui in corsivo come riferimento e lo script eseguibile completo è disponibile anche nel file di supporto 1.
      concensus.to_csv('consensus_result.csv', index=False)
   10. Eseguire la cella facendo clic sull'icona di riproduzione o premendo MAIUSC + INVIO per esportare i dati del farmacoforo di consenso in un file CSV denominato consensus_result.csv per ulteriori analisi (vedere la Figura 8).
       NOTA: Il file CSV facilita le applicazioni a valle, come l'analisi statistica o la visualizzazione in un software per fogli di calcolo.
6. Utilizzare il farmacoforo di consenso per lo screening virtuale
   1. Esporta il farmacoforo di consenso in formato JSON. Assicurarsi che il file includa le coordinate spaziali per tutte le feature. Questo formato è direttamente compatibile con gli strumenti di screening basati sul web come Pharmit¹². Per eseguire uno screening virtuale, caricare il file JSON del farmacoforo sul server Pharmit tramite l'opzione Carica funzionalità . Il server consente di perfezionare il modello modificando, aggiungendo o rimuovendo funzionalità, nonché di eseguire lo screening rispetto a librerie di composti di grandi dimensioni, come PubChem¹³o ZINC¹⁴.
      NOTA: Tutti gli script necessari per riprodurre le analisi descritte in questo studio sono forniti nel file di supporto 1 e sono accessibili in modo interattivo anche tramite https://colab.research.google.com/drive/1Zj8DjazV6mJM-we9iOpoGTZt8JfW4I7D?usp=sharing. I lettori sono incoraggiati a creare una copia personale del quaderno Colab per eseguire e modificare le analisi senza alterare lo script originale.

Figura 1: Screenshot del primo blocco di codice utilizzato per configurare l'ambiente Google Colab installando CondaColab. Una barra di avanzamento blu orizzontale appare sopra la cella durante l'esecuzione e diventa verde al completamento con successo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Screenshot del secondo blocco di codice utilizzato per installare il pacchetto ConPhar in Google Colab. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Screenshot che mostra i file JSON del farmacoforo caricati correttamente nella cartella designata in Google Colab. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Screenshot che mostra il codice utilizzato per estrarre le caratteristiche farmacoforiche dai file JSON e consolidarle in un singolo DataFrame. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Visualizzazione del clustering delle caratteristiche farmacoforiche generate durante la costruzione del modello farmacoforico di consenso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Schermata che mostra la corretta generazione dei file del farmacoforo di consenso nei formati compatibili con PyMOL e Pharmit. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Schermata che mostra la generazione di file farmacofori di consenso raggruppati per tipo di funzionalità, inclusi gli output per le visualizzazioni PyMOL, Pharmi e dendrogramma. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Schermata che mostra l'esportazione riuscita dei dati del farmacoforo di consenso nel file consensus_result.csv. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Cento complessi Mpro co-cristallizzati con diversi inibitori non covalenti sono stati allineati, come esemplificato nella Figura 9A. Ogni ligando è stato poi estratto come file individuale (Figura 9B) e successivamente caricato sul server Pharmit. La sessione è stata salvata per generare un file JSON corrispondente (vedere la Figura 9C).

Figura 9: Preparazione del ligando per la modellazione farmacoforica di consenso. (A) Allineamento strutturale di tre complessi Mpro rappresentativi co-cristallizzati con inibitori non covalenti. (B) Sovrapposizione dei 100 ligandi inclusi in questo studio. (C) Caricamento di ciascun ligando sul server Pharmit utilizzando l'opzione "Carica funzionalità", seguita dalla generazione di file JSON tramite l'opzione "Salva sessione". Entrambe le opzioni sono indicate con frecce rosse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il set completo di file JSON è stato utilizzato per generare il modello farmacoforico di consenso, che comprendeva 1450 caratteristiche farmacoforiche raggruppate in 110 cluster: 23 aromatici (Aro), 30 accettori di legami idrogeno (HBA), 16 donatori di legami idrogeno (HBD), 36 idrofobici (Hyd) e 5 cluster caricati negativamente (Anion) (Figura 10A, Tabella supplementare 1). Abbiamo identificato i cluster più grandi per ogni caratteristica per la loro incorporazione nel modello di consenso. Tra i cluster Aro, abbiamo selezionato quelli con più di 20 elementi. Dei gruppi HBA, HBD e Hyd, abbiamo mantenuto cluster con almeno 50 elementi. Nessuno dei cluster di anioni aveva più di 4 membri, quindi sono stati esclusi dal modello di consenso (Figura 10B). Queste soglie numeriche (>20 membri per Aro; ≥50 per HBA, HBD e Hyd) sono state definite empiricamente in base alla distribuzione delle dimensioni dei cluster per dare priorità ai modelli di interazione più conservati e densamente popolati.

Figura 10: Raggruppamento di caratteristiche farmacoforiche da 100 complessi Mpro-ligando. (A) Distribuzione di 1450 caratteristiche farmacoforiche: aromatico (Aro) in viola, accettore di legame idrogeno (HBA) in arancione, donatore di legame idrogeno (HBD) in bianco, idrofobo (Hyd) in verde e caricato negativamente (Anion) in rosso. (B) I cluster contenenti ≥10 membri sono mostrati per Aro, HBA, HBD e Hyd; vengono visualizzati tutti i cluster di anioni. I cluster più grandi, definiti come quelli con ≥20 membri per Aro, e ≥50 membri per HBA, HBD e Hyd, e ≥4 membri per Anion, sono evidenziati con sfere punteggiate. Il numero di membri in ciascuno dei cluster più grandi è indicato in modo esplicito. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Pertanto, il nostro modello farmacoforico di consenso includeva 11 caratteristiche: 3 caratteristiche aromatiche (Aro), Aro 1, 2 e 3, derivate da cluster con 20, 24 e 45 membri, rispettivamente; 4 accettori di legami idrogeno (HBA), HBA 1, 2, 3 e 4, da cluster con 51, 55, 77 e 81 membri, rispettivamente; 2 donatori di legami idrogeno (HBD) da cluster con 51 e 71 membri, rispettivamente; e 2 caratteristiche idrofobiche (Hyd) da cluster con 50 e 52 membri, rispettivamente (vedi Figura 11A).

Il modello del farmacoforo è stato utilizzato per effettuare ricerche nel database PubChem utilizzando la strategia precedentemente riportata¹⁰, ma non sono state trovate corrispondenze. Per aumentare la flessibilità della ricerca, è stata rimossa la caratteristica aromatica Aro 1, derivata dal grappolo più piccolo e meno rappresentativo. Questo aggiustamento ha portato all'identificazione di due risultati, tra cui un conformatore del composto con i CID PubChem 101267741 e 10285538 (vedi Figura 11B). La struttura chimica 2D del composto 101267741 è mostrata nella Figura 11C. È interessante notare che questo composto identificato si adatta bene all'interno della tasca dell'attacco Mpro. Un'analisi comparativa con il ligando co-cristallizzato 38a¹⁵ (PDB ID: 9HAJ) mostra che il conformero di corrispondenza farmacoforica di 101267741 è sepolto ancora più in profondità di 38a all'interno delle sottotasche S1 e S2 di Mpro. Tuttavia, il 38a occupa una regione più ampia della tasca, principalmente a causa della sua catena laterale etilcarbossammide, che si estende verso la tasca S1'. Tuttavia, le interazioni intermolecolari chiave di 38a coinvolgono altre frazioni piuttosto che questa catena laterale. Al contrario, il composto 101267741 forma 11 interazioni intermolecolari, tra cui sette legami idrogeno e quattro contatti idrofobici. Rispetto ai tre legami idrogeno e alle due interazioni idrofobiche formate da 38a, la modalità di legame del composto 101 appare più forte (Figura 11D).

Figura 11: Ricerca di farmacofori nel database PubChem. (A) Il modello completo di farmacoforo di consenso contiene 11 caratteristiche: 3 aromatici (viola), 4 accettori di legami idrogeno (arancione), 2 donatori di legami idrogeno (bianchi) e 2 idrofobici (verdi). (B) Il conformero del composto PubChem 101267741 allineato con il modello farmacoforo ridotto dopo la rimozione della caratteristica Aro 1 e (C) Struttura chimica bidimensionale del composto identificata. (D) Analisi comparativa delle modalità di legame del composto 38a (magenta; da PDB ID: 9HAJ) e del composto PubChem CID 101267741 (verde) alla tasca catalitica di SARS-CoV-2 Mpro. Le corrispondenti interazioni intermolecolari per ciascun composto sono mostrate a destra. I legami idrogeno e le interazioni idrofobiche sono mostrati come linee tratteggiate rispettivamente in blu e grigio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File di supporto 1: script del flusso di lavoro del farmacoforo. Clicca qui per scaricare questo file.

Supporto Tabella 1: Riepilogo del clustering delle caratteristiche farmacoforiche. Numero di cluster, membri per cluster, coordinate del centroide e raggi del cluster Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

La modellazione farmacoforica aiuta la scoperta razionale di farmaci¹⁶. Il protocollo qui descritto in dettaglio è stato impiegato per la generazione di un farmacoforo di consenso per la proteasi principale (Mpro) di SARS-CoV-2 a partire da dozzine di inibitori non covalenti, ma può essere applicato a qualsiasi bersaglio biologico con conformazioni legate al ligando note, in particolare a quelli con ampi set di dati di ligando. Rispetto ai singoli modelli basati su farmacofori o su semplici ligandi, questo approccio di consenso migliora la robustezza e riduce le distorsioni integrando più conformazioni di ligando. Il modello di farmacoforo di consenso generato da questo protocollo può essere applicato a diverse librerie molecolari, inclusi database pubblici come ChEMBL¹⁷e ZINC¹⁴, collezioni commerciali e librerie di composti proprietarie interne. Questa versatilità consente l'esplorazione di spazi chimici ampi e diversificati in campagne di screening virtuali, aumentando così la probabilità di identificare nuovi composti bioattivi. Pertanto, questo flusso di lavoro supporta l'identificazione di nuovi composti bioattivi con i profili di interazione desiderati.

Un passaggio critico di questo protocollo prevede la preparazione e l'allineamento accurati dei complessi ligando-bersaglio. Il pre-allineamento preciso dei ligandi nelle loro conformazioni bioattive è essenziale per garantire un'integrazione significativa e affidabile delle caratteristiche, poiché il disallineamento può indebolire il potere predittivo del modello¹⁰. Per ottenere un allineamento ottimale, si consiglia di eseguire la sovrapposizione strutturale utilizzando residui conservati del sito di legame delle proteine o atomi della spina dorsale. Per i set di dati con ligandi diversi, l'allineamento dei punti di interazione chiave o delle caratteristiche farmacoforiche migliora la coerenza in tutto il set. Inoltre, si consiglia un'attenta ispezione manuale e la correzione delle conformazioni dei ligandi anomali per evitare artefatti che potrebbero ridurre l'accuratezza del modello. Inoltre, la natura open source di ConPhar facilita l'integrazione in altri flussi di lavoro computazionali, nonché le regolazioni avanzate dei parametri di clustering. Gli utenti esperti possono modificare i parametri di clustering delle caratteristiche farmacoforiche per ottenere un equilibrio tra generalità e specificità del modello. Tali modifiche possono essere guidate dalla dimensione del set di dati del ligando, dalla diversità chimica o dalla complessità del bersaglio. Ad esempio, quando si ha a che fare con ligandi molto diversi, il clustering graduale o l'analisi dei sottogruppi possono catturare meglio le caratteristiche rilevanti¹⁸.

Lo strumento ConPhar è attualmente in fase di sviluppo attivo. Ciò offre una notevole flessibilità per gli utenti che desiderano adattare lo strumento a specifiche esigenze di ricerca, compresa l'integrazione con pipeline software complementari. Tuttavia, poiché il software potrebbe ancora subire modifiche, si consiglia agli utenti di monitorare gli aggiornamenti ufficiali e di consultare la documentazione specifica della versione. La segnalazione dei problemi riscontrati contribuirà al suo continuo miglioramento e a una più ampia convalida della comunità. Il nostro protocollo costruirà modelli con modelli di interazione completi e, quindi, possono essere impiegati nello screening virtuale di grandi librerie. Nei nostri risultati rappresentativi, abbiamo impiegato il farmacoforo ottenuto nell'identificazione di due nuovi potenziali ligandi per la regione catalitica di Mpro. In definitiva, questo metodo farmacoforico di consenso semplifica l'identificazione dei risultati e accelera l'ottimizzazione dei lead.

Tuttavia, identifichiamo i seguenti limiti del protocollo: i) dipendenza da strutture legate a ligandi di alta qualità, poiché i dati a bassa risoluzione possono ridurre l'accuratezza del modello; ii) il rischio di trascurare interazioni uniche e importanti cruciali per specifici ligandi, poiché il farmacoforo di consenso enfatizza caratteristiche condivise; e iii) la riproducibilità può essere influenzata da una diversa definizione di caratteristiche in diversi strumenti software¹⁹. Tuttavia, queste limitazioni possono essere superate perfezionando la struttura di un sistema proteina-ligando mediante simulazioni di dinamica molecolare²⁰, ritenzione di cluster basata sulla conoscenza dell'utente e uso coerente di software per l'identificazione delle caratteristiche farmacoforiche.

Sebbene il modello di farmacoforo di consenso in questo protocollo non sia stato convalidato utilizzando le metriche binarie classiche, la sua capacità predittiva è stata dimostrata in uno studio precedente¹⁰. In questo lavoro, è stato utilizzato un set di test indipendente di 78 ligandi chimicamente diversi per convalidare un farmacoforo di consenso generato con la stessa metodologia. Il set di validazione comprendeva ligandi con somiglianza di Tanimoto ≤0,5, masse molecolari comprese tra 200 e 700 g/mol, legami ruotabili ≤17 e almeno tre caratteristiche farmacoforiche. Il modello ha identificato con successo principi attivi noti, supportando la sua applicabilità nei flussi di lavoro di screening virtuale e la sua robustezza in candidati chimicamente diversi.

Il protocollo qui riportato consente la costruzione di modelli farmacoforici che catturano modelli di interazione completi caratteristici del bersaglio. Ciò è particolarmente utile per i bersagli con ampi dati sui ligandi, come le proteasi virali, le chinasi e i recettori nucleari²¹. I modelli generati sono adatti per lo screening virtuale di grandi librerie di composti, facilitando l'identificazione di nuovi candidati bioattivi. Evidenziando le caratteristiche conservate e funzionalmente rilevanti, l'approccio del farmacoforo di consenso supporta sia la scoperta di hit in fase iniziale che la successiva ottimizzazione dei lead.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Google Colab	Google LLC	https://colab.google	Piattaforma web-based per l'esecuzione di notebook Python; utilizzato qui per eseguire script ConPhar e PyMOL per la modellazione farmacoforica di consenso.
Farmacia	Koes Lab presso l'Università di Pittsburgh	https://pharmit.csb.pitt.edu/search.html	Piattaforma web per lo screening virtuale interattivo dei farmacofori e l'esplorazione dello spazio chimico, che consente il caricamento di file di ligandi e la generazione di caratteristiche farmacofore
PyMOL	Schrö dinger, Inc.	https://www.pymol.org	Software di visualizzazione molecolare e allineamento strutturale utilizzato per le proteine... Sovrapposizione e analisi del complesso ligando
Supporto dello script del flusso di lavoro del farmacoforo File 1	Google LLC	https://colab.research.google.com/drive/1Zj8DjazV6mJM-we9iOpoGTZt8JfW4I7D?usp=sharing	Script eseguibile completo per l'installazione di Conda, PyMOL e l'esecuzione del flusso di lavoro del farmacoforo in Google Colab. Fornito anche come file di supporto 1.