Questo protocollo valuta il ruolo protettivo della sovraespressione del klotho nei cardiomiociti H9C2 durante la riossigenazione dell'ipossia utilizzando saghi molecolari e funzionali.
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Articolo di ricerca
Questo protocollo valuta il ruolo protettivo della sovraespressione del klotho nei cardiomiociti H9C2 durante la riossigenazione dell'ipossia utilizzando saghi molecolari e funzionali.
Questo studio mirava a indagare il ruolo protettivo del klotho nei cardiomiociti soggetti a lesioni da ipossia/reoxygenazione (H/R). Un modello H/ R in vitro è stato stabilito utilizzando cardiomioblasti di ratto H9C2, trasfettati con vettori lentivirali sovraespressivi con klotho. Le cellule sono state suddivise in sei gruppi sperimentali: controllo, H/R, controllo negativo (NC), iperespressione di klotho, PDTC (un inibitore di NF-κB) e un gruppo combinato trattato con klotho e lipopolisaccaridi (LPS). I livelli di espressione del klotho sono stati determinati da PCR quantitativa in tempo reale e western blotting. La vitalità cellulare è stata misurata tramite il test MTT, mentre l'apoptosi è stata verificata tramite citometria a flusso. L'espressione delle proteine coinvolte nella via di segnalazione NF-κB è stata analizzata tramite western blotting, e l'espressione cellulare delle citochine pro-infiammatorie è stata valutata tramite colorazione immunofluorescenza. La sovraespressione del klotho ha elevato significativamente i livelli di klotho nelle cellule H9C2 e ha portato a un miglioramento della vitalità cellulare, alla riduzione dell'apoptosi e alla diminuzione dell'espressione cellulare delle citochine pro-infiammatorie rispetto al gruppo H/R. L'analisi del Western blot ha rivelato che la sovraespressione del klotho, così come il trattamento con PDTC, ha soppresso l'attivazione della via NF-κB, come indicato da un rapporto p-P65/P65 ridotto e un aumento dei livelli di p-IκBα/IκBα. Questi effetti sono stati parzialmente invertiti con il trattamento condiviso con LPS. Questi risultati suggeriscono che il klotho conferisce cardioprotezione contro lesioni indotte da H/R modulando la segnalazione di NF-κB, riducendo l'infiammazione e promuovendo la sopravvivenza cellulare. Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile per studiare i meccanismi molecolari alla base della lesione ischemia-reperfusione miocardica e il potenziale terapeutico del klotho nell'infiammazione cardiaca.
L'infarto miocardico acuto (IAM) è causato principalmente da ischemia seguita da reperfusione, che ha portato a ricerche approfondite sui meccanismi della lesione miocardica di ipossia/reoxygenazione (H/R) 1,2,3. Un aspetto fondamentale della lesione miocardica H/R è l'apoptosi cellulare, che contribuisce in modo significativo alla progressione patologica dell'AMI 4,5.
Studi recenti hanno implicato la via di segnalazione del fattore nucleare kappa B (NF-κB) nella lesione H/R miocardica attraverso la modulazione delle risposte infiammatorie a stimoli come il lipopolisaccaride (LPS)6,7,8. L'attivazione di NF-κB avviene tramite due meccanismi distinti: i percorsi canonici e non canonici9. Nel percorso canonico, l'attivazione si basa sulla degradazione indotta dalla fosforilazione dell'inibitore del kappa B alfa (IκBα)10. Tuttavia, è stato anche riportato che la fosforilazione della subunità NF-κB p65 può favorire l'apoptosi, potenzialmente indipendentemente dalla degradazione di IκBα11. Klotho, una proteina transmembrana a passaggio singolo, regola il metabolismo dei fosfati e del calcio e inibisce la segnalazionedell'insulina 12,13,14. Evidenze emergenti indicano che Klotho esercita effetti inibitori sull'attivazione del NF-κB in diversi tessuti, inclusi rene, ippocampo e cellule invecchiate, mitigando così infiammazione e dannitissutali 15,16,17. Nonostante questi progressi, il ruolo del Klotho nell'AMI e la sua potenziale interazione con la via NF-κB durante la lesione miocardica H/R rimangono in gran parte inesplorati.
Da un punto di vista metodologico, il modello H/R in vitro che utilizza cardiomioblasti di ratto H9C2 offre diversi vantaggi rispetto ai modelli animali, tra cui tensione controllata dell'ossigeno, riproducibilità e ridotta variabilità. Inoltre, la sovraespressione di Klotho mediata dai lentivirali consente una modulazione stabile ed efficiente dell'espressione genica, consentendo un'indagine diretta sul suo impatto funzionale. Questi approcci rendono il protocollo pratico, conveniente e accessibile per studi meccanicistici, evitando al contempo le sfide etiche e logistiche della sperimentazione in vivo .
In termini di considerazioni pratiche, le cellule H9C2 sono ampiamente utilizzate nella ricerca cardiovascolare poiché mantengono molte proprietà simili a quelle dei cardiomiociti, anche se non imitano completamente il fenotipo dei cardiomiociti maturi. La condizione H/R selezionata (ipossia di 5 ore seguita da reoxygenazione di 1 ora) rientra in un intervallo comunemente impiegato per modellare lesioni ischemia-reperfusione in vitro. Analogamente, la trasduzione lentivirale con molteplicità di infezione (MOI) intorno a 100 è un approccio standard per ottenere una sovraespressione efficiente con citotossicità gestibile. Sebbene queste caratteristiche migliorino l'applicabilità del protocollo, bisogna riconoscere limitazioni come la ricapitolazione incompleta dell'ambiente in vivo . Pertanto, il presente studio mira a esplorare come Klotho protegga le cellule miocardiche da lesioni H/R e a stabilire un protocollo riproducibile per valutare la sua interazione con la segnalazione NF-κB.
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Tutte le procedure che hanno coinvolto la linea cellulare cardiomioblastica di ratto H9C2 (ATCC, CRL-1446) sono state eseguite in conformità con le normative istituzionali sulla biosicurezza. Nessun animale o umano è stato direttamente coinvolto in questo studio. La Figura 1 illustra il flusso di lavoro grafico della pipeline di progettazione e analisi sperimentale. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Coltura cellulare
La linea cellulare cardiomioblastica di ratto H9C2 (ATCC, CRL-1446) è stata criopreservata in azoto liquido utilizzando un mezzo congelante composto dal Modified Eagle Medium (DMEM, alto livello di glucosio, 4,5 g/L) integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) e 10% di dimetilsolfosido (DMSO). Per il recupero, le fiale congelate venivano rapidamente scongelate in un bagno d'acqua a 37 °C per 2-3 minuti e trasferite immediatamente in DMEM preriscaldato. Il mezzo di coltura è stato preparato con FBS al 10%, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di estreptomicina, 3,7 g/L di bicarbonato di sodio e 1 mM di piruvato di sodio. Le cellule sono state mantenute a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂. Cellule H9C2 tra i passaggi 6 e 20 sono state utilizzate per tutti gli esperimenti. I passaggi iniziali (P20) non sono stati utilizzati per evitare la deriva fenotipica correlata al passaggio.
2. Sovraespressione lentivvirale di Klotho nelle cellule H9C2
Un vettore lentivirale autoinattivante di terza generazione, codificando il gene Klotho (Kl) del ratto a lunghezza intera sotto il controllo del promotore EF1α, è stato applicato per stabilire una sovraespressione stabile nelle cellule H9C2. Il costrutto conteneva un segnalatore P2A-EGFP per la visualizzazione, elementi regolatori post-trascrizionali del virus dell'epatite della marmotta (WPRE) e elementi del tratto polipurinico centrale (cPPT) per la stabilità del trascritto, e una cassetta di resistenza alla puromicina azionata dal promotore PGK per la selezione. Le particelle lentivirali sono state prodotte nelle cellule HEK293T co-transfettando il plasmide di trasferimento con plasmidi psPAX2 (gag/pol/rev) e pMD2.G (VSV-G) in un rapporto di 4:3:1 usando polietilenemina (PEI; DNA: PEI = 1:3, a settimana). I soprannatanti venivano raccolti a 48 e 72 ore, chiariti con centrifugazione a 3.000 × g per 10 minuti, filtrati attraverso una membrana PES da 0,45 μm e concentrati tramite ultracentrifugazione a 25.000 × g per 2 ore a 4 °C. I pellet virali sono stati risosposti in PBS contenente albumina sirica bovina all'1% (BSA), e i titoli funzionali (TU/mL) sono stati determinati tramite infezione da diluizione limitante di cellule HEK293T con lettura EGFP a 72 ore. Le cellule H9C2 sono state seminate in piastre a 6 pozzi a 2 × 105 celle per pozzo, risultando in circa il 60% di confluenza al momento della trasduzione. Particelle lentivirali sono state aggiunte a una molteplicità di infezione (MOI) di 100 in 1 mL di mezzo di coltura fresca integrato con polibrene (8 μg/mL) per aumentare l'efficienza dell'infezione. L'inoculo è stato rimosso dopo 12 ore e sostituito con 2 mL di mezzo intero. A 72 ore dall'infezione, l'efficienza della trasduzione è stata verificata tramite fluorescenza EGFP al microscopio a fluorescenza. Per l'istituzione di linee cellulari stabili, è stata applicata puromicina (2 μg/mL, pre-titolata) per 3-5 giorni a partire da 48 ore dopo l'infezione, con cambi di mezzo ogni 48 ore. La sovraespressione di Klotho è stata confermata tramite RT-qPCR e immunoblotting. Tutte le procedure lentivirali sono state eseguite sotto contenimento di livello di biosicurezza 2 (BSL-2) e tutti i rifiuti virali sono stati inattivati con candeggina al 10% per almeno 30 minuti prima dello smaltimento.
3. Gruppi di esperimenti
Le cellule H9C2 sono state seminate in placche a 6 pozzi (area di crescita 9,6 cm²) a 3 × 10⁵ cellule per pozzo, che hanno prodotto circa il 70%-80% di confluenza dopo 24 ore, la densità richiesta per il processamento dell'ipossia/riossigenazione (H/R) e i successivi sani. Dopo l'attacco notturno, le cellule sono state assegnate in sei gruppi sperimentali: (1) gruppo di controllo, che non ha ricevuto alcun trattamento aggiuntivo; (2) gruppo H/R, che ha subito ipossia/reossigenazione (H/R) in una camera modulare sigillata per ipossia, seguita da un'esposizione a 5 ore di ipossia (1% O₂, 94% N₂, 5% CO₂) e 1 ora di riperfusione (5% CO₂), come descrittoprecedentemente 18; (3) Gruppo Controllo Negativo (NC), in cui le cellule venivano trasfettate con un vettore vuoto 24 ore prima del trattamento H/R; (4) Gruppo Klotho, in cui le cellule venivano trasfettate con vettori lentivirali che codificavano Klotho 24 ore prima del trattamento H/R; (5) Gruppo di trattamento con pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), che è stato trattato con 200 mg/L inibitore della via NF-κB PDTC per 24 ore prima del trattamentoH/R 19; (6) Gruppo Klotho + LPS, in cui le cellule sono state trasfettate con vettori lentivirali che codificano per Klotho e successivamente trattate con lipopolisaccaride a 1 mg/L per 24 ore prima del trattamento H/R 20.
4. qRT-PCR
Le cellule H9C2 sono state seminate in piastre a 6 pozzi con una densità di 1 × 10⁶ celle per pozzo. Dopo il trattamento, l'RNA totale è stato isolato utilizzando un protocollo di estrazione del fenolo-cloroformio. Per breve, è stato aggiunto 1 mL di reagente per pozzo, seguito dall'estrazione del cloroformio, dalla precipitazione dell'isopropanolo e dal lavaggio con etanolo al 75%. Il pellet di RNA è stato essiccato all'aria e sciolto in acqua priva di RNasi. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state determinate spettrofotometricamente. Per la sintesi del cDNA, 1 μg di RNA totale è stato trascritto inversamente utilizzando un kit commerciale di trascrizione inversa secondo il protocollo del produttore, inclusa la rimozione genomica del DNA e il priming casuale degli esameri. La PCR quantitativa in tempo reale è stata eseguita in un sistema PCR in tempo reale con chimica SYBR Green nelle seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 95 °C per 30 secondi, seguita da 40 cicli a 95 °C per 5 secondi e 60 °C per 30 secondi. Le sequenze di primer sono state progettate utilizzando Primer-BLAST (NCBI) e sintetizzate da un fornitore commerciale: (1) Klotho: F 5′-TAAGGTTCAAGTATGGAGAC-3′, R 5′-GGGCGTTCACACTTATTATTAT-3′; (2) β-actina (controllo interno): F 5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′, R 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′. I livelli di espressione relativa sono stati calcolati utilizzando il metodo 2^-ΔΔCT, e la specificità di amplificazione è stata confermata da un singolo picco a curva di fusione.
5. Western blot
Le proteine sono state estratte dalle cellule H9C2 utilizzando un tampone con il saggio di immunoprecipitazione radio-immunoprecipitazione (RIPA) (200 μL per pozzo di una piastra a 6 pozzi) integrato con un cocktail inibitore di proteasi su ghiaccio. Le concentrazioni proteiche sono state misurate tramite saggio di acido bicinconinico (BCA) e quantità uguali di proteine (20-30 μg) sono state caricate per via su un gel SDS-PAGE al 10% per la separazione elettroforetica. Le proteine sono state trasferite sulle membrane di polivinilidene difluoruro (PVDF) utilizzando un sistema di trasferimento umido a 100 V per 90 minuti a 4 °C. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% preparato in TBST per 1 ora a temperatura ambiente, poi incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro Klotho (1:500), fosfo-p65 (1:500), p65 (1:500), fosfo-IκBα (1:500), IκBα (1:500) e β-actin (1:1000). Dopo tre lavaggi con TBST, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rapano picante (HRP) (1:1000) per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un sistema avanzato di rilevamento della chemiluminescenza e le intensità del segnale sono state quantificate con il software ImageJ utilizzando impostazioni di soglia identiche.
6. Saggio MTT
Le cellule H9C2 sono state seminate in piastre a 96 pozzi con una densità di 2 × 10³ cellule per pozzo in 100 μL di mezzo completo e incubate durante la notte per consentire l'adesione. Un volume di 10 μL di soluzione MTT (5 mg/mL in PBS) è stato aggiunto a ciascun pozzo e incubato per 4 ore a 37 °C in condizioni umidificate con il 5% di CO₂. Dopo l'incubazione, il soprantantante veniva rimosso con cura e venivano aggiunti 100 μL di dimetilsolfosido (DMSO) per dissolvere i cristalli di formazan, seguiti da un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente con lieve scuotimento. L'assorbanza veniva poi misurata a 490 nm utilizzando un lettore di microplacche. L'esito visivo atteso era la comparsa di cristalli di formazan viola in celle vitali prima dell'aggiunta del DMSO e di una soluzione omogenea viola dopo la dissoluzione.
7. Citometria a flusso
Le cellule sono state prelevate 24 ore dopo il trattamento tramite tripsinizzazione e raccolte tramite centrifugazione a 1.500 × g per 5 minuti a 4 °C. Il pellet cellulare è stato risospeso in 100 μL di buffer di legame 1× (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂, pH 7,4). Annexin V-APC e propidium ioduro (PI) sono stati miscelati a un rapporto 1:2 per preparare una soluzione di colorazione da 15 μL, che è stata aggiunta alla sospensione cellulare. La miscela è stata incubata per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo l'incubazione, sono stati aggiunti 400 μL dello stesso buffer di legame e i campioni sono stati analizzati immediatamente utilizzando un citometro a flusso. Sono stati raccolti in totale 10.000 eventi per campione. I dati sono stati analizzati utilizzando il software FlowJo. Le celle sono state inizialmente avviate in base alla diffusione diretta (FSC) e alla dispersione laterale (SSC) per escludere i detriti, seguite dalla gating tra quadranti di Annexin V vs. PI per distinguere le celle vitali (Annexin V-/PI-), le celle apoptotiche precoci (Annexin V+/PI-) e le celle apoptotiche/necrotiche tarde (Annexin V+/PI+). La colorazione Annexin V-positiva/PI-negativa ha indicato apoptosi precoce, mentre la colorazione Annexin V/PI doppiamente positiva ha indicato apoptosi tardiva o necrosi.
8. Immunofluorescenza
Le cellule H9C2 sono state seminate su vetri sterili in piastre a 6 pozzi a una densità di 1 × 10⁵ celle per pozzo e sottoposte a trattamenti. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente, permeabilizzate con lo 0,1% di Triton X-100 in PBS per 10 minuti, e bloccate con albumina sieroca bovina al 5% (BSA) in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. I coverslip sono stati incubati durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro TNF-α (1:200), IL-1β (1:200) e IL-6 (1:100). Dopo tre lavaggi in PBS, le cellule sono state incubate con anticorpi secondari marcati con ficoeritrina (PE) per 1:500 per 1 ora a temperatura ambiente al buio. I nuclei sono stati controcolorati con DAPI per 5 minuti. I copricoli venivano montati su vetrini di vetro con mezzo di montaggio antifade, e i segnali di fluorescenza venivano visualizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza. Le immagini sono state analizzate con ImageJ (versione 1.54). La fluorescenza rossa indicava l'espressione delle citochine, mentre la fluorescenza blu segnava i nuclei.
9. Analisi statistica
Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando il software SPSS. I risultati sono espressi come media ± deviazione standard (SD) da almeno tre esperimenti indipendenti. Per confronti tra gruppi multipli è stata applicata l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test post hoc di Tukey. Un valore P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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La sovraespressione del klotho migliora la sopravvivenza cellulare e attenua il danno infiammatorio mediato da NF-κB
Per confermare l'efficacia della somministrazione genica, l'espressione di Klotho è stata quantificata sia a livello di mRNA che di proteina. Le cellule con sovraespressione di klotho hanno mostrato un aumento robusto rispetto sia ai gruppi di controllo ipossia/reossigenazione (...
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In questo studio è stato indagato il ruolo protettivo del Klotho nei cardiomiociti esposti a lesioni da ipossia/reoxygenazione (H/R), e si è riscontrato che la sovraespressione del Klotho migliora significativamente la vitalità cellulare, riduce l'apoptosi e sopprime l'espressione delle citochine pro-infiammatorie. Questi effetti sono stati accompagnati da una fosforilazione ridotta di p65 e da una fosforilazione aumentata di IκBα, suggerendo che l'inibizione della segnalazione NF-κB con...
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldeide | Biosharp | XG1050 | |
| Soluzione di colorazione Annexin V APC/PI | Elabscience | E-CK-A217 | |
| Kit di Sintesi del cDNA | Qiagen | 205410 | |
| Soluzione DAPI | BioFroxx | 1155MG010 | |
| Dulbecco' s Eagle Medium Modificato (DMEM) | HyClone | SH30243.01B | |
| Kit di reattivi per rilevamento ECL | Meilunbio | MA0186-1 | |
| Alimentatore per elettroforesi (POWER PAC 200) | Bio-Rad | POWER PAC 200 | |
| Siero Fetale Bovino (FBS) | VivaCell | C04001-500, C04002-500 | |
| Citometro a flusso (Gallios) | Beckman Coulter | Gallios | |
| Microscopio a fluorescenza (BK6000) | Chongqing Optec | BK6000 | |
| Solvente formazan | Solarbio | M1020 | |
| Anticorpo anti-coniglio contro il coniglio coniugato HRP | Bethyl | A120-101P | |
| LPS (NF-& kappa; Agonista della via B) | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Lettore di microplacche (Modello K3) | Thermo | K3 | |
| Camera Incubatrice Modulare (Camera Ipossia) | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| Soluzione MTT | Cayman | 21795 | |
| PDTC (NF-& kappa; Inibitore della via B) | Sigma-Aldrich | P8765 | |
| Anticorpo anti-coniglio contro la PE | Bioss | bs-0295G-PE | |
| Polibrene (bromuro di esadimetrina) | Invitrogen | X2351 | |
| Membrana PVDF | Merck | ISEQ00010 | |
| Rabbit Anti-Rat IL-1 e beta; Anticorpi | Biorbyt | orb378927 | |
| Anticorpo Anti-Ratto del Coniglio | ZEN BIO | 384702 | |
| Coniglio Anti-Rat Iκ Bα Anticorpi | Biorbyt | orb223182 | |
| Anticorpo anti-Klotho del Coniglio | Biorbyt | orb333711 | |
| Anticorpo anti-ratto Rabbit p65 | Biorbyt | orb229138 | |
| Coniglio Anti-Topo Fosfo-Iκ Bα Anticorpi | Biorbyt | orb223035 | |
| Coniglio Anti-Rat Phospho-NF-& kappa; Anticorpo B p65 | Biorbyt | orb304662 | |
| Rabbit Anti-Rat TNF-α Anticorpi | Biorbyt | orb106548 | |
| Anticorpo Anti-Ratto & beta;-actin del coniglio | Huabio | ET1702 | |
| Sistema PCR quantitativo in tempo reale (LightCycler 96) | Roche | Light Cycler96 | |
| Buffer di lisi RIPA | Mreda | MO52447 | |
| Kit di preparazione gel SDS-PAGE | Elabscience | E-IR-R305 | |
| Kit Reagenti Trizol | Life Technologies | 15596-018 |
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