In questo articolo, descriviamo i protocolli per misurare la quantità di fosfolipide fluorescente specificamente rimosso dalle particelle del donatore di lipidi mediante lipoproteine ad alta densità (HDL) presenti nell'intero plasma umano o nel siero. Abbiamo dimostrato che questa metrica della funzionalità HDL predice la malattia cardiovascolare incidente.
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Articolo metodologico
Saggio di efflusso fosfolipidico specifico per lipoproteine ad alta densità
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I livelli plasmatici di colesterolo HDL (lipoproteine ad alta densità) (HDL-C) sono attualmente un parametro chiave per la valutazione clinica del rischio di malattie cardiovascolari (CVD). La rimozione mediata dalle HDL dei lipidi della placca dalle cellule e dai depositi extracellulari nella parete arteriosa è una delle numerose funzioni antiaterogene delle HDL che possono spiegare la sua associazione inversa con il rischio di CVD. La rimozione del colesterolo cellulare mediata da HDL in vitro ha recentemente dimostrato di essere un predittore ancora migliore del rischio di CVD rispetto all'HDL-C.
L'HDL è composto da una popolazione eterogenea di particelle, che svolgono funzioni diverse. Le particelle HDL coinvolte nella rimozione dei lipidi della placca aterosclerotica contengono apolipoproteine scambiabili, per lo più apolipoproteina A-I, che si dissociano dalla particella e quindi rimuovono i lipidi della placca. L'HDL nascente è formata dalla solubilizzazione e dalla rimozione sia dei fosfolipidi che del colesterolo dai domini di membrana plasmatica cellulare generati da ABCA1 da parte di apolipoproteine scambiabili derivate da HDL. Questo processo svolge un ruolo fondamentale sia nella prevenzione che nella regressione della placca aterosclerotica.
In questo articolo, descriviamo il protocollo per il test dell'efflusso fosfolipidico HDL-specifico (HDL-SPE) privo di cellule, che abbiamo precedentemente dimostrato in grado di prevedere il rischio di CVD incidente. Questo test misura in modo specifico la rimozione mediata da apolipoproteine HDL di un fosfolipide fluorescente non scambiabile da una particella di donatore di lipidi. I nostri studi clinici caso-controllo hanno stabilito che il test HDL-SPE funziona altrettanto bene e potenzialmente anche meglio del test della capacità di efflusso del colesterolo basato su cellule "gold standard", un test laborioso e tecnicamente complesso che spesso utilizza il colesterolo radioattivo.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di consentire ai ricercatori di base e clinici di valutare la funzionalità delle HDL nella mobilizzazione dei lipidi, utilizzando un test semplice, standardizzato, privo di cellule e ad alto rendimento. Questo test può essere utilizzato dai ricercatori di base per ottenere informazioni sui meccanismi alla base dell'efflusso lipidico mediato da HDL e per lo screening di nuovi agenti terapeutici che migliorano la funzionalità delle HDL. L'HDL-SPE può anche fungere da test diagnostico clinico di laboratorio per la valutazione del rischio di CVD.
Introduzione
Il test HDL-SPE (High-Density Lipoprotein-Specific Phosfolipid Efflux) misura la funzionalità delle HDL ed è destinato all'uso nella ricerca biomedica e nei laboratori di diagnostica clinica per (i) ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi alla base della rimozione dei lipidi mediata dalle HDL dalle lesioni aterosclerotiche, (ii) fungere da nuova piattaforma per migliorare la valutazione clinica del rischio di CVD e (iii) sviluppare nuove terapie per il trattamento delle malattie cardiovascolari.
Il colesterolo HDL (HDL-C) è un importante determinante del rischio di CVD1, ma la....
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Protocollo
La raccolta del sangue viene effettuata seguendo le regole della Dichiarazione di Helsinki del 1975 (https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/), rivista nel 2013, e deve essere conforme alle linee guida istituzionali in materia di consenso informato.
1. Preparazione di particelle lipidiche di donatore marcate con fosfolipidi fluorescenti
- Formazione del film lipidico
ATTENZIONE: Preparare ed erogare le soluzioni madre in una cappa chimica. Indossa un camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi. Smaltire le soluzioni di cloroformio nei rifiu....
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Risultati
Metodi analitici
Come notato in precedenza, le analisi dei campioni HDL-SPE possono essere modificate per diverse applicazioni, come dimostrato di seguito. Prima di condurre studi con campioni di ricerca, vengono eseguiti i saggi di convalida della curva standard LC-CSH, riproducibilità e concentrazione plasmatica al fine di padroneggiare le tecniche richieste. Innanzitutto, eseguire l'analisi della curva standard LC-CSH per valutare la qualit.......
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Discussione
L'HDL-C è un determinante chiave utilizzato per valutare clinicamente il rischio di malattie cardiovascolari (CVD) e quindi la necessità di trattamenti ipolipemizzanti o di altri potenziali trattamenti di tipo preventivo1. La funzione delle HDL nell'efflusso cellulare di colesterolo in vitro ha dimostrato di essere un predittore ancora migliore di malattia cardiovascolare incidente rispetto alle HDL-C7. Sfortunatamente, questo test.......
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Dichiarazioni
BREVETTI: US20220178953A1; WO2020185598A1 (E.B.N., M.S., A.T.R.)
Masaki Sato è impiegato da Eiken Chemical Co., Ltd.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata [in parte] dal Programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health (NIH). I contributi dell'autore o degli autori NIH sono considerati opere del governo degli Stati Uniti. I risultati e le conclusioni presentati in questo articolo sono quelli degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni del NIH o del Dipartimento della salute e dei servizi umani degli Stati Uniti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,2-dimiristocil-sn-glicero-3-fosfocolina | Avanti Research | 850345 | 14:0 PC (DMPC) Solutione di cloroformio |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(lissamina rodamina B solfonil) (sale di ammonio) | Avanti Research | 810150-C | Soluzione di cloroformio LRh-PE |
| Film adesivo | Biosistemi applicati | 4306311 | MicroAmp Clear Adhesive Film & nbsp; |
| Nastro in Teflon ad alta densità Bay Corporation 1/2 pollice x 520 | Soluzioni per i test medici | 86732 | |
| Tubi di vetro borosilicato 20 mm e acuti; 150 mm | Fisher Scientific | 14-961-33 | |
| Centrifuga | Thermo Scientific | Serie Sorvall X Pro | |
| Cloroformio | Sigma-Aldrich | 366927 | adatto per HPLC, ≥ 99.8% |
| Polvere di colesterolo | Sigma-Aldrich | C8667 | 3β-Idrossi-5-colestene, 5-Colestene-3β-olo |
| Carta di pesatura vetrosina | Cole-Palmer | UX-01338-02 | Per la gestione LC-CSH |
| Piastra di incubazione | USA Scientific & nbsp; | 1402-9700 | TempPlate 96 pozzi semi-gonna 0,2 mL PCR & nbsp; |
| Agente di rimozione dei lipidi (LRA) | Supelco | 13358-U | LC-CSH |
| Targhetta di misura | Greiner bio-one | 655076 | Micropiastra PS, 96 pozzi, F-BOTTOM (CAMINO DEL CAMINO), NERA; FLUOTRAC, LEGANTE MED |
| Microsoft Excel | Microsoft 365 MSO | Versione 2507 | |
| Punte per pipette MultiFlex | Fisher Scientific | 50-550-206 | Per aspirare soprandanzante durante lavaggi LC-CSH |
| Lettore di targhe multietichetta | Perkin Elmer | 1420-050 | Contatore multietichette Victor3 Wallac1420 |
| Soluzione fisiologica normale | Biologico di Qualità | 114-055-101 | Per usi multipli |
| Parafilm | Cole-Palmer | HS23452 | Coprire la parte superiore del tubo di vetro durante il vortice |
| Fiaschette di Erlenmeyer in policabonate | Fisher Scientific | 10-041-8 | Per una soluzione Triton-X al 10% |
| Plasma umano concentrato (derivato dal sangue) Li Heparin) | Innovative Research Inc | IPLAWBLIH | Plasma di riferimento, controllo positivo (PC) e nbsp; |
| Surfact-Amps X 100 | Thermo Scientific | 28314 | 10% Triton X-100, diluire 10 volte con acqua distillata |
| Termomiscelatore | Eppendorf | 5382000023 | Termomixer C con termoblocco a 96 pozzi |
| Smartblock termomescolatore | Eppendorf | 5306000006 | SmartBlock a 96 pozzi |
| Pipette di trasferimento (3 mL, Falcon) | Fisher Scientific | 13-711-9CM | Per rimuovere bolle dalla superficie del pozzo |
| Miscelatore a vortice | Daigger | 3030A | Supporto per il tubo di vetro sopra |
Riferimenti
- Grundy, S. M., et al. 2018 AHA/ACC/AACVPR/AAPA/ABC/ACPM/ADA/AGS/APHA/ASPC/NLA/PCNA guideline on the management of blood cholesterol: A report of the american college of cardiology/american heart association task force on clinical practice guidelines. Circulation. 139 (25), e1082-e1143 (2019).
- Zhong, S., et al.
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Ristampe e permessi
