Saggio di efflusso fosfolipidico specifico per lipoproteine ad alta densità

Sommario

In questo articolo, descriviamo i protocolli per misurare la quantità di fosfolipide fluorescente specificamente rimosso dalle particelle del donatore di lipidi mediante lipoproteine ad alta densità (HDL) presenti nell'intero plasma umano o nel siero. Abbiamo dimostrato che questa metrica della funzionalità HDL predice la malattia cardiovascolare incidente.

Abstract

I livelli plasmatici di colesterolo HDL (lipoproteine ad alta densità) (HDL-C) sono attualmente un parametro chiave per la valutazione clinica del rischio di malattie cardiovascolari (CVD). La rimozione mediata dalle HDL dei lipidi della placca dalle cellule e dai depositi extracellulari nella parete arteriosa è una delle numerose funzioni antiaterogene delle HDL che possono spiegare la sua associazione inversa con il rischio di CVD. La rimozione del colesterolo cellulare mediata da HDL in vitro ha recentemente dimostrato di essere un predittore ancora migliore del rischio di CVD rispetto all'HDL-C.

L'HDL è composto da una popolazione eterogenea di particelle, che svolgono funzioni diverse. Le particelle HDL coinvolte nella rimozione dei lipidi della placca aterosclerotica contengono apolipoproteine scambiabili, per lo più apolipoproteina A-I, che si dissociano dalla particella e quindi rimuovono i lipidi della placca. L'HDL nascente è formata dalla solubilizzazione e dalla rimozione sia dei fosfolipidi che del colesterolo dai domini di membrana plasmatica cellulare generati da ABCA1 da parte di apolipoproteine scambiabili derivate da HDL. Questo processo svolge un ruolo fondamentale sia nella prevenzione che nella regressione della placca aterosclerotica.

In questo articolo, descriviamo il protocollo per il test dell'efflusso fosfolipidico HDL-specifico (HDL-SPE) privo di cellule, che abbiamo precedentemente dimostrato in grado di prevedere il rischio di CVD incidente. Questo test misura in modo specifico la rimozione mediata da apolipoproteine HDL di un fosfolipide fluorescente non scambiabile da una particella di donatore di lipidi. I nostri studi clinici caso-controllo hanno stabilito che il test HDL-SPE funziona altrettanto bene e potenzialmente anche meglio del test della capacità di efflusso del colesterolo basato su cellule "gold standard", un test laborioso e tecnicamente complesso che spesso utilizza il colesterolo radioattivo.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di consentire ai ricercatori di base e clinici di valutare la funzionalità delle HDL nella mobilizzazione dei lipidi, utilizzando un test semplice, standardizzato, privo di cellule e ad alto rendimento. Questo test può essere utilizzato dai ricercatori di base per ottenere informazioni sui meccanismi alla base dell'efflusso lipidico mediato da HDL e per lo screening di nuovi agenti terapeutici che migliorano la funzionalità delle HDL. L'HDL-SPE può anche fungere da test diagnostico clinico di laboratorio per la valutazione del rischio di CVD.

Introduzione

Il test HDL-SPE (High-Density Lipoprotein-Specific Phosfolipid Efflux) misura la funzionalità delle HDL ed è destinato all'uso nella ricerca biomedica e nei laboratori di diagnostica clinica per (i) ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi alla base della rimozione dei lipidi mediata dalle HDL dalle lesioni aterosclerotiche, (ii) fungere da nuova piattaforma per migliorare la valutazione clinica del rischio di CVD e (iii) sviluppare nuove terapie per il trattamento delle malattie cardiovascolari.

Il colesterolo HDL (HDL-C) è un importante determinante del rischio di CVD¹, ma la sua utilità è compromessa nella misura in cui livelli elevati di HDL-C (>80 mg/dL) sono associati a un maggiore rischio di CVD 2,3,4,5. Livelli elevati di HDL-C possono rappresentare l'accumulo di HDL disfunzionale che ha una ridotta capacità di rimuovere i lipidi della placca arteriosa⁶.

Il test della capacità di efflusso del colesterolo cellulare (CEC) è stato il primo test in vitro sviluppato per misurare la funzionalità delle HDL. In questo test, macrofagi in coltura (topo o umano), tipicamente marcati con ³H- o colesterolo Bodipy fluorescente, vengono incubati con plasma o siero impoverito di apoB. La % di efflusso di colesterolo è calcolata in base alla quantità di fluorescenza/radioattività associata alle cellule e al mezzo ^7,8,9. Il test CEC ha dimostrato di essere un migliore predittore di CVD incidente rispetto all'HDL-C⁷. Il test CEC non è suscettibile di conversione in un test diagnostico clinico di routine, principalmente a causa dei suoi requisiti per la coltura cellulare e della lunga durata (ad esempio, giorni). Inoltre, il test CEC è limitato dalla sua variabilità intrinseca (ad esempio, diversi tipi di cellule, tecniche di marcatura e deplezione PEG di β-lipoproteine, che altera la composizione HDL¹⁰).

Diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato saggi di efflusso di colesterolo HDL liberi da utilizzare come strumenti per ottenere nuove informazioni sulla funzione HDL e per la potenziale traduzione in un test diagnostico clinico per valutare meglio il rischio di CVD^11,12. Questi saggi di efflusso in genere coinvolgono più passaggi e utilizzano una particella di donatore di lipidi marcata con un colesterolo fluorescente e, come il test CEC, richiedono la deplezione di β-lipoproteine o, in alternativa, la cattura di particelle contenenti apoA-I utilizzando anticorpi anti-apoA-I, per misurare l'efflusso plasmatico di colesterolo HDL. Sebbene sia stato convalidato che questi test alternativi siano associati in varia misura al rischio di CVD, ad oggi, solo uno¹³, che valuta il tasso di cambio apoA-I, ha dimostrato di prevedere il rischio di CVD incidente¹⁴. È interessante notare che la cinetica dello scambio di apoA-I dentro e fuori l'HDL plasmatico è stata dimostrata essere associata in modo indipendente con CEC¹⁵ e di essere marcatamente ridotta nei pazienti con sindrome coronarica acuta¹⁶. Inoltre, è stato dimostrato che diverse apolipoproteine scambiabili HDL mediano sia il colesterolo che il fosfolipide dalle cellule che esprimono ABCA1 in vitro¹⁷.

Abbiamo sviluppato un approccio alternativo per valutare la funzionalità HDL¹⁸. Il test semplice, rapido e affidabile qui descritto richiede solo due componenti, vale a dire campioni di plasma umano (o animale) intero o di siero (fresco o scongelato a freddo) e una particella donatrice fluorescente rivestita di lipidi. Il test misura la capacità dell'apoA-I e di altre apolipoproteine scambiabili associate alle HDL nell'intero plasma/siero di rimuovere una fosfatidiletanolammina (PE) fluorescente non scambiabile, marcata con il gruppo di testa, da una particella donatrice¹⁸ rivestita di lipidi (Figura 1).

Le particelle donatrici in questo test sono costituite da cristalli di silicato di calcio idrato (CSH) rivestiti di colesterolo, il fosfolipide fosfatidilcolina (PC) e un PE fluorescente. Le apolipoproteine scambiabili associate alle HDL, per lo più apoA-I, rilasciate dalle particelle HDL si legano alle particelle donatrici e poi si dissociano da esse insieme ai lipidi delle particelle donatrici, incluso il PE fluorescente. In questo modo, l'HDL, ma non le altre lipoproteine presenti nell'intero plasma/siero, acquisisce specificamente PE fluorescente dalle particelle del donatore ^18,19. L'intero plasma/siero viene incubato con le particelle donatrici di silicato di calcio idrato (LC-CSH) rivestite di lipidi fluorescenti e soluzione salina a 37 °C, agitando per 1 ora. Poiché LC-CSH è circa il doppio della densità dell'acqua, le particelle donatrici vengono facilmente separate dal plasma mediante centrifugazione a bassa velocità.

La % di efflusso di EP misurata negli studi clinici è tipicamente normalizzata dividendo per il valore della fluorescenza di EP acquisita da HDL nel surnatante della miscela di reazione di un campione clinico per il valore ottenuto da HDL in un plasma umano di controllo di riferimento. La normalizzazione in un plasma di riferimento viene eseguita per correggere le variazioni nella preparazione del reagente. Per le applicazioni di ricerca, la % di efflusso di PE può essere determinata calcolando la fluorescenza del PE surnatante divisa per la fluorescenza totale (fluorescenza PE surnatante + fluorescenza LC-CSH). I valori di misurazione della fluorescenza surnatante vengono incollati in un modello in file di fogli di calcolo per calcolare la %PE Efflux (Tabella supplementare 1 per misurazioni in triplice copia e Tabella supplementare 2 per misurazioni duplicate). Le istruzioni per l'esecuzione di questi calcoli nel foglio di calcolo sono fornite come file supplementari (File supplementare 1, File supplementare 2, File supplementare 3, File supplementare 4, File supplementare 5, File supplementare 6, File supplementare 7 e File supplementare 8) e un esempio di calcolo è fornito come Tabella supplementare 3.

Figura 1: Saggio HDL-SPE. L'efflusso fosfolipidico HDL-specifico viene analizzato in piastre a 96 pozzetti. Cristalli salini, di silicato di silicato di calcio idrato (grigio) rivestiti di lipidi (LC-CSH), tra cui fosfatidiletanolammina marcata con lissaminerhodamine non scambiabile (LRh-PE; strati di membrana rossi) e fino a 30 campioni di plasma/siero intero (giallo; in triplicato) vengono caricati su piastre a 96 pozzetti. Dopo la miscelazione per 1 ora a 37 °C in un termomiscelatore, le piastre vengono brevemente centrifugate per pellettare le particelle donatrici LC-CSH. Aliquote dei surnatanti, contenenti HDL specificamente marcato con LRh-PE, vengono trasferite su una piastra nera contenente detergente (per solubilizzare Lh-Rh-PE) e soluzione fisiologica. La fluorescenza del PE viene quindi misurata con un fluorimetro. Soluzione salina (controllo negativo; NC), per la correzione dello sfondo, e il pool di plasma umano sano (Controllo Positivo; PC) per la normalizzazione della piastra, vengono caricati al posto del campione di plasma/siero nell'ultima serie di pozzetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

La raccolta del sangue viene effettuata seguendo le regole della Dichiarazione di Helsinki del 1975 (https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/), rivista nel 2013, e deve essere conforme alle linee guida istituzionali in materia di consenso informato.

1. Preparazione di particelle lipidiche di donatore marcate con fosfolipidi fluorescenti

1. Formazione del film lipidico
   ATTENZIONE: Preparare ed erogare le soluzioni madre in una cappa chimica. Indossa un camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi. Smaltire le soluzioni di cloroformio nei rifiuti chimici organici, le soluzioni Triton X-100 (senza plasma) nei rifiuti chimici e le soluzioni contenenti plasma nei rifiuti a rischio biologico/medici.
   1. Acquista soluzioni stock lipidiche in cloroformio da un fornitore o realizzale in laboratorio:
      25 mg/mL: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC):
      10 mg/mL: Colesterolo
      1 mg/mL: 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(lissaminerhodamine B sulfonil) [LRh-PE]
      NOTA: Utilizzare tubi di vetro a tenuta d'aria con tappo a vite. Tappo di chiusura con nastro di teflon.
      Conservare a -20 ^oC.
   2. Determinare la quantità di LC-CSH necessaria e preparare il numero appropriato di provette di vetro.
      In una cappa chimica, aggiungere quanto segue a ciascuna provetta di vetro borosilicato da 10 mm e 150 mm: 472 μl di soluzione madre DMPC (17,7 μmol, 11,8 mg), 339 μl di soluzione madre di colesterolo (8,8 μmol, 3,39 mg) e 305 μl di LRh-PE (200 nmol, 0,305 mg). Agitare brevemente per mescolare.
   3. In una cappa chimica, asciugare la miscela lipidica in una provetta di vetro sotto un getto delicato di N₂ per 1 ora, fino a formare un film lipidico secco sul fondo della provetta.
      NOTA: Il flusso di N₂ dovrebbe causare solo una leggera increspatura sulla superficie del fluido.
   4. Per i saggi che richiedono diverse piastre da 96 pozzetti nell'arco di giorni o settimane, creare un grande lotto di LC-CSH che può essere aliquotato in provette o utilizzato per realizzare piastre LC-CSH pronte all'uso, che vengono conservate a -20 °C o -80 °C. Vedere i passaggi 2.2.1-2.2.2 di seguito.
2. Rivestimento di silicato di calcio idrato con film lipidico fluorescente
   ATTENZIONE: Indossare un camice da laboratorio, guanti, una maschera facciale e occhiali protettivi durante la manipolazione dell'idrato di silicato di calcio.
   1. Inserire un cono di carta per pesare nel tubo di vetro contenente i lipidi essiccati. Aggiungere 80 mg di polvere di silicato di silicato di calcio (CSH) (reagente per la rimozione dei lipidi) nella provetta di vetro utilizzando il cono di carta per pesare per dirigere la polvere verso la base della provetta. Aggiungere immediatamente 2 mL di soluzione fisiologica normale alla provetta di vetro contenente i lipidi essiccati e il CSH. Coprire la parte superiore del tubo con parafilm.
   2. Agitare a mano per rimuovere la maggior parte del lipide dal fondo del tubo di vetro. Inserire il tubo di vetro in un foro praticato in una piattaforma di polistirolo attaccata alla parte superiore di un vortice. Fissare il tubo alla piattaforma a vortice utilizzando del nastro rinforzato.
      NOTA: Pre-regolare la velocità del vortice per consentire alla miscela di salire a circa metà del tubo di vetro.
   3. Vortice per 10 min. Dopo il vortice, verificare che non rimanga alcun lipide sulla parete del tubo. Se necessario, vorticare manualmente secondo necessità fino a quando non rimangono lipidi. Trasferire il volume totale nella provetta di vetro in una provetta di plastica conica da 15 mL, utilizzando una pipetta da 1 mL. Lavare le pareti della provetta di vetro con 3 mL di soluzione fisiologica aggiuntiva e trasferirla nella stessa provetta di plastica conica da 15 mL.
3. Lavaggio LC-CSH
   1. Centrifugare la provetta di plastica da 15 mL contenente il CSH (LC-CSH) rivestito di lipidi per 2 minuti a 935 × g a 4 °C per pellettare le particelle donatrici. Rimuovere con cautela il surnatante mediante aspirazione a vuoto utilizzando un puntale per pipetta lungo e molto sottile.
   2. Iniziare dalla parte superiore del surnatante e, facendo scorrere lentamente la punta della pipetta lungo il lato della provetta, puntare la provetta mentre il surnatante viene rimosso. Lasciare una piccola quantità (≈ 200 μl) di soluzione fisiologica per evitare l'aspirazione accidentale dell'LC-CSH dal pellet. Aggiungere una quantità di soluzione salina sufficiente a portare il volume totale a 5 ml.
   3. Ripetere i passaggi 1.3.1-1.3.2 quattro volte. Dopo il lavaggio finale, aggiungere una quantità di soluzione salina sufficiente a portare il volume finale a 2,5 ml.
      NOTA: Conservare i preparati LC-CSH a 4 °C per 2 settimane o a -20 °C o -80 °C per un massimo di 6 mesi.
4. Preparazione di grandi lotti per lastre LC-CSH pronte all'uso
   NOTA: Questo approccio consente la preparazione di piastre di misura con composizione uniforme dei reagenti dello stesso lotto LC-CSH, riducendo così al minimo la variabilità della misurazione tra le piastre.
   1. Preparare 12 provette LC-CSH (2,5 mL x 12 provette) come descritto nei passaggi 1.1.1-1.3.2 sopra. Combinare l'intero contenuto di tutte le 12 provette in una provetta di plastica conica da 50 mL (30 mL di volume totale). Agitare attentamente per ottenere una distribuzione omogenea delle particelle LC-CSH ed erogare 6 mL in una provetta conica di plastica da 15 mL. Ripetere quattro volte per ottenere un totale di 5 provette coniche di plastica, ciascuna contenente 6 mL di LC-CSH.
   2. Ogni provetta fornirà una quantità sufficiente di LC-CSH per realizzare 5 piastre LC-CSH pronte all'uso (contenenti 50 μl per pozzetto per tutti i 96 pozzetti in una singola piastra). Vedere i passaggi 2.2.1-2.2.2, di seguito.

2. Incubazione di campioni di plasma/siero con particelle lipidiche di donatore marcate con fosfolipidi fluorescenti (LC-CSH)

1. Piastre individuali per un uso immediato.
   1. Pipettare 75 μL di soluzione salina in ciascun pozzetto di una piastra da 0,3 mL a 96 pozzetti utilizzando tutti i pozzetti necessari per il set di campioni da analizzare. Pipettare 100 μL di soluzione salina nei pozzetti del controllo negativo triplato (NC) e 75 μL di soluzione salina nei pozzetti del controllo positivo duplicato (PC) (Figura 2). Utilizzare una pipetta a più pozzetti per erogare.
   2. Prima di erogare LC-CSH, agitare la provetta di plastica da 15 mL 3 volte, 10 s ciascuna. Utilizzando una pipetta a pozzetto singolo, erogare 50 μL di LC-CSH lungo il lato destro dei pozzetti contenenti soluzione fisiologica. Erogare rapidamente 50 μl ciascuno in soli 3 pozzetti. Ripetere il protocollo a vortice prima di erogare LC-CSH nei 3 pozzetti successivi.
      NOTA: Questa procedura è fondamentale per garantire che il pesante LC-CSH, che sedimenta spontaneamente, sia sospeso in modo omogeneo, consentendo quindi l'erogazione di quantità uguali a ciascun pozzetto.
   3. Ruotare la piastra a 96 pozzetti di 180° in modo che il lato sinistro dei pozzetti sia ora a destra. Pipettare 25 μl di campioni di plasma/siero lungo il lato destro del pozzetto (Figura 2). Per i pozzetti PC, aggiungere 25 μL di plasma/siero normolipidemizzante umano standard di riferimento. Il volume totale per pozzetto per il saggio è di 150 μl.
      NOTA: Questa procedura impedisce la contaminazione incrociata di plasma/siero con LC-CSH, poiché vengono dispensati lungo i lati opposti dei pozzetti.
   4. Sigillare ermeticamente la piastra con pellicola adesiva. Incubare la piastra sigillata a 96 pozzetti al buio per 1 ora a 37 °C a 1200 giri/min in un termomiscelatore. Al termine dell'incubazione, rimuovere la piastra dal termomixer e metterla sul ghiaccio. Centrifugare la piastra per 2 minuti a 4 °C (per arrestare la reazione di trasferimento) a 935 g per pellettare le particelle donatrici.
2. Piastre LC-CSH pronte all'uso
   1. Per l'uso, scongelare le piastre pronte all'uso congelate (vedere i passaggi 1.4.1-1.4.2 per la preparazione delle piastre) al freddo (da 4 °C a 10 °C) per 2 ore (o durante la notte se necessario). Centrifugare per 2 minuti a 4 °C a 935 × g per raccogliere tutto il materiale (125 μL) insieme. Rimuovere con cura la pellicola adesiva in modo da non schizzare il contenuto dei pozzetti.
   2. Erogare 25 μl di campioni di plasma/siero, soluzione fisiologica e plasma umano di riferimento, in triplicato, nei pozzetti appropriati (Figura 1) della piastra pronta all'uso, su ghiaccio e sigillare con una pellicola adesiva. Incubare il pozzetto sigillato a 96 pozzetti al buio per 1 ora a 37 °C a 1200 giri/min in un termomiscelatore. Togliete la piastra dal thermomixer e mettetela sul ghiaccio. Centrifugare la piastra per 2 minuti a 4 °C (per arrestare la reazione di trasferimento) a 935 × g (per pellettare le particelle donatrici).

Figura 2: Erogazione di reagenti nei pozzetti senza contaminazione incrociata. Erogare plasma/siero e LC-CSH sulle pareti opposte dei pozzetti. La contaminazione incrociata è ridotta al minimo se la piastra viene ruotata di 180° dopo la prima erogazione di LC-CSH. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Misurazione dell'efflusso di fosfolipidi fluorescenti alle HDL plasmatiche/sieriche

1. Trasferimento su piastra nera e misurazione della fluorescenza
   1. Rimuovere con cautela la pellicola adesiva per non disturbare il pellet LC-CSH.
      NOTA: Se si verifica la rottura del pellet, centrifugare nuovamente.
   2. Trasferire 50 μl di surnatante dalla piastra di reazione a 96 pozzetti nei pozzetti di una piastra a fondo piatto in polistirene nero a 96 pozzetti per misure di fluorescenza. Utilizzare una pipetta a più pozzetti.
      NOTA: Non aspirare alcun LC-CSH. Se ciò dovesse accadere, iniettare nuovamente nel pozzetto e centrifugare nuovamente.
   3. Riempire un serbatoio con soluzione fisiologica. Aggiungere 50 μl di soluzione fisiologica a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta a più pozzetti.
   4. Preparare l'1% di TX-100 aggiungendo 90 mL di acqua distillata a 10 mL di soluzione madre Triton X-100 al 10% in un pallone di plastica Erlenmeyer da 125 mL. Riempi un serbatoio con l'1% di Triton-X 100.
   5. Aggiungere 100 μl di Triton X-100 all'1% a temperatura ambiente a ciascun pozzetto e mescolare pipettando delicatamente su e giù 2-3 volte utilizzando una pipetta a più pozzetti. Evitare la formazione di bolle. Far scoppiare le bolle con l'aria di una pipetta di trasferimento da 3 ml.
   6. Misurare la fluorescenza della lissaminerhodamine con il fluorimetro (540 nm di eccitazione/600 nm di emissione).
2. Calcolo della %PE di efflusso
   1. Calcolo dell'efflusso di PE
      1. %EP efflusso = ([INFLUENZA totale del surnatante plasmatico o sierico - NC FLU del surnatante]/INFLUENZA totale)) × 100
         FLU = unità di fluorescenza; NC = controllo negativo. Poiché solo 50 μl dei 150 μl della miscela di reazione surnatante vengono utilizzati per misurare la fluorescenza per pozzetto, è necessario correggere come segue:
      2. FLU surnatante totale/pozzetto = FLU misurato di 50 μl (piastra nera) × 3
      3. FLU totale per 150 μL di miscela/pozzetto di reazione = FLU totale emesso da 50 μL di LC-CSH.
         NOTA: La fluorescenza LC-CSH viene calcolata come descritto di seguito (passaggio 4.2.5).
   2. Calcolo normalizzato dell'efflusso %PE
      1. Utilizzare l'efflusso %PE normalizzato per correggere la variazione tra saggi eseguiti in condizioni diverse (ad esempio, esperimento eseguito in giorni diversi, differenze di lotto).
      2. Utilizzare questa formula per calcolare l'efflusso %EP normalizzato:
         Normalizzato %PE Efflusso = Campione surnatante %PE effflusso valore (FLU)/controllo di riferimento positivo surnatante %PE effflusso FLU.
      3. Utilizzare plasma umano aggregato identico da donatori sani con un profilo lipidico normale come controllo di riferimento. Non è necessario calcolare l'FLU/pozzetto del surnatante totale, poiché questo valore è lo stesso sia per il campione che per il riferimento.
      4. Per i campioni triplicati, incollare i dati grezzi ottenuti nel passaggio 3.1.6 nel foglio di calcolo (Tabella supplementare 1). Per i campioni duplicati, incollare i dati grezzi ottenuti nel passaggio 3.1.6 nel foglio di calcolo (Tabella supplementare 2).

4. Curva standard LC-CSH

NOTA: La curva standard LC-CSH viene utilizzata per calcolare la quantità di segnale fluorescente PE presente nell'aliquota di LC-CSH per pozzetto. Tipicamente, vengono utilizzati 50 μL di LC-CSH/pozzetto. Questo valore può essere utilizzato per calcolare la %EP efflusso a HDL in un campione normalizzato all'FLU totale (vedi passaggio 3.2.1) presente nella miscela di reazione.

%EP efflusso = ((unità di fluorescenza del campione surnatante [FLU] - soluzione salina surnatante FLU)/(totale LC-CSH FLU)) x 100.

1. Diluizione seriale di LC-CSH
   1. Preparare diluizioni di 10 e 100 volte di LC-CSH madre (come preparato nei passaggi 1.1.1-1.3.3):
      Diluizione 10 volte: 100 μL di LC-CSH + 900 μL di Triton X-100 all'1%
      Diluizione 100 volte: 100 μL di LC-CSH diluito 10 volte + 900 μL di Triton X-100 all'1%
   2. Erogare campioni triplicati di LC-CSH diluito da 10 e 100 volte in una piastra di incubazione a 96 pozzetti per la curva standard (vedere la Figura 3).
   3. Aggiungere un volume sufficiente di Triton X-100 all'1% ai pozzetti contenenti LC-CSH per portare a un volume finale di 200 μl (vedere la tabella 1).
2. Solubilizzazione di LC-CSH per la misura della fluorescenza
   1. Sigillare la piastra con pellicola adesiva e incubare per 1 h a 24 °C agitando a 1200 giri/min. Centrifugare la piastra per 2 minuti a 4 °C a 935 × g. Rimuovere con cautela la pellicola adesiva.
   2. Utilizzando una pipetta a pozzetti multipli, miscelare i campioni pipettandoli su e giù 2-3 volte. Trasferire 100 μl di LC-CSH per pozzetto su una piastra a fondo piatto in polistirene nero da 96 pozzetti per misure di fluorescenza, utilizzando una pipetta a più pozzetti.
   3. Aggiungere 100 μl per pozzetto di Triton-X all'1% a temperatura ambiente a ciascun pozzetto, utilizzando una pipetta multipozzetto. Mescolare pipettando su e giù 2-3 volte.
   4. Misurare la fluorescenza con un fluorimetro (540 nm di eccitazione/600 nm di emissione).
   5. Incollare i valori di fluorescenza misurati utilizzando il fluorimetro nel modello di analisi della regressione lineare nella Tabella supplementare 1 come indicato nel File supplementare 3. Le concentrazioni finali di LC-CSH nella piastra di misurazione della curva standard sono mostrate nella Tabella 2.

Figura 3: Piastra per curva standard LC-CSH. LC-CSH marcato con LRh-PE diluito in serie viene erogato in una piastra a 96 pozzetti, come mostrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Concentrazione finale	10 volte diluito	100 volte diluito	1% Triton X-100	Totale
LC-CSH	LC-CSH	LC-CSH	Detergente	Volume
(μL/pozzetto)	(μL)	(μL)	(μL)	(μL)
10	100	0	100	200
5	50	0	150	200
2.5	25	0	175	200
1	0	100	100	200
0.5	0	50	150	200
0.25	0	25	175	200

Tabella 1: Volumi di reagenti aggiunti ai pozzetti della piastra di incubazione per la curva standard LC-CSH.

Solubilizzato	Salino	Totale	Aggiunto	Misurato
LC-CSH	Volume	Volume	LC-CSH	LC-CSH
(μL)	(μL)	(μL)	(μL/pozzetto)	(μL/pozzetto)
100	100	200	10	5
100	100	200	5	2.5
100	100	200	2.5	1
100	100	200	1	0.5
100	100	200	0.5	0.25
100	100	200	0.25	0.125

Tabella 2: Volumi di reagenti aggiunti ai pozzetti della piastra di misura per la curva standard LC-CSH.

Risultati

Metodi analitici

Come notato in precedenza, le analisi dei campioni HDL-SPE possono essere modificate per diverse applicazioni, come dimostrato di seguito. Prima di condurre studi con campioni di ricerca, vengono eseguiti i saggi di convalida della curva standard LC-CSH, riproducibilità e concentrazione plasmatica al fine di padroneggiare le tecniche richieste. Innanzitutto, eseguire l'analisi della curva standard LC-CSH per valutare la qualit...

Discussione

L'HDL-C è un determinante chiave utilizzato per valutare clinicamente il rischio di malattie cardiovascolari (CVD) e quindi la necessità di trattamenti ipolipemizzanti o di altri potenziali trattamenti di tipo preventivo¹. La funzione delle HDL nell'efflusso cellulare di colesterolo in vitro ha dimostrato di essere un predittore ancora migliore di malattia cardiovascolare incidente rispetto alle HDL-C⁷. Sfortunatamente, questo test...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1,2-dimiristocil-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti Research	850345	14:0 PC (DMPC) Solutione di cloroformio
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(lissamina rodamina B solfonil) (sale di ammonio)	Avanti Research	810150-C	Soluzione di cloroformio LRh-PE
Film adesivo	Biosistemi applicati	4306311	MicroAmp Clear Adhesive Film & nbsp;
Nastro in Teflon ad alta densità Bay Corporation 1/2 pollice x 520	Soluzioni per i test medici	86732
Tubi di vetro borosilicato 20 mm e acuti; 150 mm	Fisher Scientific	14-961-33
Centrifuga	Thermo Scientific	Serie Sorvall X Pro
Cloroformio	Sigma-Aldrich	366927	adatto per HPLC, ≥ 99.8%
Polvere di colesterolo	Sigma-Aldrich	C8667	3β-Idrossi-5-colestene, 5-Colestene-3β-olo
Carta di pesatura vetrosina	Cole-Palmer	UX-01338-02	Per la gestione LC-CSH
Piastra di incubazione	USA Scientific & nbsp;	1402-9700	TempPlate 96 pozzi semi-gonna 0,2 mL PCR & nbsp;
Agente di rimozione dei lipidi (LRA)	Supelco	13358-U	LC-CSH
Targhetta di misura	Greiner bio-one	655076	Micropiastra PS, 96 pozzi, F-BOTTOM (CAMINO DEL CAMINO), NERA; FLUOTRAC, LEGANTE MED
Microsoft Excel	Microsoft 365 MSO	Versione 2507
Punte per pipette MultiFlex	Fisher Scientific	50-550-206	Per aspirare soprandanzante durante lavaggi LC-CSH
Lettore di targhe multietichetta	Perkin Elmer	1420-050	Contatore multietichette Victor3 Wallac1420
Soluzione fisiologica normale	Biologico di Qualità	114-055-101	Per usi multipli
Parafilm	Cole-Palmer	HS23452	Coprire la parte superiore del tubo di vetro durante il vortice
Fiaschette di Erlenmeyer in policabonate	Fisher Scientific	10-041-8	Per una soluzione Triton-X al 10%
Plasma umano concentrato (derivato dal sangue) Li Heparin)	Innovative Research Inc	IPLAWBLIH	Plasma di riferimento, controllo positivo (PC) e nbsp;
Surfact-Amps X 100	Thermo Scientific	28314	10% Triton X-100, diluire 10 volte con acqua distillata
Termomiscelatore	Eppendorf	5382000023	Termomixer C con termoblocco a 96 pozzi
Smartblock termomescolatore	Eppendorf	5306000006	SmartBlock a 96 pozzi
Pipette di trasferimento (3 mL, Falcon)	Fisher Scientific	13-711-9CM	Per rimuovere bolle dalla superficie del pozzo
Miscelatore a vortice	Daigger	3030A	Supporto per il tubo di vetro sopra