Questo studio presenta un protocollo riproducibile per l'identificazione di biomarcatori di proteine sieriche associati al disturbo dello spettro autistico (ASD) utilizzando la spettrometria di massa ad acquisizione indipendente dai dati (DIA) combinata con l'apprendimento automatico (ML). La DIA consente una profilazione imparziale e ad alta risoluzione del proteoma sierico, comprese le proteine a bassa abbondanza, garantendo al contempo la riproducibilità tra i campioni. Gli approcci ML sono stati applicati per selezionare pannelli proteici diagnosticamente informativi e migliorare la robustezza del modello. L'analisi ha incluso il siero di 99 bambini con ASD e 70 controlli di pari età. Le proteine ad alta abbondanza sono state esaurite, i peptidi sono stati preparati utilizzando procedure standardizzate di digestione e frazionamento e la DIA è stata eseguita su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. L'elaborazione e la quantificazione dei dati hanno identificato proteine differenzialmente espresse, che sono state sottoposte ad analisi di arricchimento funzionale. Otto proteine immuno-correlate sono emerse come forti candidate per lo sviluppo di biomarcatori. Un modello di regressione logistica addestrato su queste proteine ha raggiunto un'accuratezza del 95,27%, un valore Kappa di 0,9025 e un'AUC di 1,000 nella convalida incrociata. Questi risultati dimostrano il potenziale della proteomica basata sulla DIA, combinata con l'apprendimento automatico, come un solido quadro per la scoperta di biomarcatori nell'ASD e per l'adattamento in una più ampia ricerca clinica.