Identificazione di biomarcatori molecolari immuno-correlati nel disturbo dello spettro autistico utilizzando la proteomica di acquisizione indipendente dai dati e l'apprendimento automatico

Jun He; Qingqing Hu; Sifeng Wang; Xiaohui Gong; Ni Gan; Li Huang; Haofeng Chen; Jie Dai; Hong Yu; Shuanglin Xiang; Xiangwen Peng

doi:10.3791/68949

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Articolo metodologico

Identificazione di biomarcatori molecolari immuno-correlati nel disturbo dello spettro autistico utilizzando la proteomica di acquisizione indipendente dai dati e l'apprendimento automatico

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DOI:

10.3791/68949

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26 settembre 2025

Jun He^*¹^,² , Qingqing Hu^*³ , Sifeng Wang^*¹^,² , Xiaohui Gong^*¹ , Ni Gan¹ , Li Huang³ , Haofeng Chen⁴ , Jie Dai⁴ , Hong Yu⁴ , Shuanglin Xiang¹ , Xiangwen Peng¹^,²

¹College of Life Sciences, Hunan Normal University, ²Changsha Maternal and Child Health Hospital, Affiliated to Hunan Normal University, ³Changsha Central Hospital, Affiliated to University of South China, ⁴Shanghai Bioprofile Technology Co., Ltd.

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza la spettrometria di massa ad acquisizione indipendente dai dati e l'apprendimento automatico che ha identificato otto proteine immuno-correlate come biomarcatori accurati per la diagnosi precoce del disturbo dello spettro autistico, convalidato da un saggio di immunoassorbimento enzimatico.

Abstract

Questo studio presenta un protocollo riproducibile per l'identificazione di biomarcatori di proteine sieriche associati al disturbo dello spettro autistico (ASD) utilizzando la spettrometria di massa ad acquisizione indipendente dai dati (DIA) combinata con l'apprendimento automatico (ML). La DIA consente una profilazione imparziale e ad alta risoluzione del proteoma sierico, comprese le proteine a bassa abbondanza, garantendo al contempo la riproducibilità tra i campioni. Gli approcci ML sono stati applicati per selezionare pannelli proteici diagnosticamente informativi e migliorare la robustezza del modello. L'analisi ha incluso il siero di 99 bambini con ASD e 70 controlli di pari età. Le proteine ad alta abbondanza sono state esaurite, i peptidi sono stati preparati utilizzando procedure standardizzate di digestione e frazionamento e la DIA è stata eseguita su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. L'elaborazione e la quantificazione dei dati hanno identificato proteine differenzialmente espresse, che sono state sottoposte ad analisi di arricchimento funzionale. Otto proteine immuno-correlate sono emerse come forti candidate per lo sviluppo di biomarcatori. Un modello di regressione logistica addestrato su queste proteine ha raggiunto un'accuratezza del 95,27%, un valore Kappa di 0,9025 e un'AUC di 1,000 nella convalida incrociata. Questi risultati dimostrano il potenziale della proteomica basata sulla DIA, combinata con l'apprendimento automatico, come un solido quadro per la scoperta di biomarcatori nell'ASD e per l'adattamento in una più ampia ricerca clinica.

Introduzione

Il disturbo dello spettro autistico (ASD) è un gruppo di disturbi dello sviluppo neurologico ad esordio precoce caratterizzati da eterogeneità nell'eziologia e nella presentazione clinica. Le caratteristiche principali includono deficit persistenti nella comunicazione e nell'interazione sociale, nonché comportamenti, interessi o attività limitati e ripetitivi. Negli Stati Uniti, la prevalenza è di circa il 2,3% tra i bambini di 8 anni e di circa il 2,2% tra gli adulti, sottolineando il suo impatto sulla salute pubblica 1,2,3,4. I fattori di rischio sono diversi, tra cui le predisposizioni genetiche, la disregolazione immunitaria e le esposizioni ambientali prenatali ^5,6,7. La diagnosi e l'intervento precoci possono migliorare significativamente i risultati dello sviluppo, rendendo l'identificazione di biomarcatori oggettivi e affidabili uno dei principali obiettivi della ricerca sull'ASD ^8,9,10. Questo protocollo si basa sul nostro lavoro pubblicato in precedenza che applica la proteomica dell'acquisizione indipendente dai dati (DIA) e l'apprendimento automatico per identificare le proteine immuno-correlate come potenziali biomarcatori per la diagnosi precoce dell'ASD¹¹.

Nonostante gli sforzi estesi, attualmente non esistono biomarcatori specifici e universalmente validati per la diagnosi clinica di ASD¹². I candidati proposti – come le alterazioni del microbioma intestinale¹³, l'aumento dell'interleuchina-6 (IL-6)¹⁴, i cambiamenti nel fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)¹⁵ e i marcatori di stress ossidativo come il glutatione¹⁶ – rimangono preliminari e mancano di riproducibilità per l'uso clinico. La proteomica è emersa come un approccio promettente per l'identificazione di firme molecolari specifiche per la malattia e diversi studi hanno studiato diversi campioni biologici (sangue, saliva, urine, PBMC) per proteine differenzialmente espresse 8,17,18,19,20,21,22 . Ad esempio, Bao et al. hanno dimostrato che le proteine infiammatorie identificate dalla proteomica Olink possono aiutare nella diagnosi precoce dell'ASD (17), mentre altri studi suggeriscono che le vie proteomiche e metaboliche condivise possono produrre biomarcatori robusti nonostante l'eterogeneità genetica dell'ASD²³.

La spettrometria di massa DIA ha guadagnato sempre più attenzione per la sua profilazione proteica completa e riproducibile. A differenza della tradizionale acquisizione dipendente dai dati (DDA), che frammenta selettivamente gli ioni più intensi, la DIA frammenta tutti gli ioni precursori attraverso finestre m/z predefinite. Ciò fornisce una copertura più profonda del proteoma e una migliore riproducibilità in grandi coorti, un vantaggio chiave per i confronti clinici¹⁴. Gli studi di benchmarking mostrano che la DIA rileva peptidi più quantificabili rispetto alla DDA, in particolare per le proteine a bassa abbondanza, con una minore variazione tra le corse¹⁴.

Sulla base di questi progressi, abbiamo applicato l'analisi proteomica basata sulla DIA a campioni di siero di 99 bambini con ASD e 70 controlli, in seguito alla deplezione di proteine ad alta abbondanza. I nostri risultati evidenziano il potenziale delle proteine immuno-correlate come marcatori molecolari per la diagnosi precoce dell'ASD e dimostrano il valore della proteomica basata sulla DIA nella scoperta di biomarcatori se combinata con una metodologia rigorosa¹¹.

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Protocollo

Il protocollo è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e il protocollo è stato approvato dal Comitato di Revisione Istituzionale presso l'Ospedale per la Salute Materna e Infantile di Changsha; Il consenso informato è stato ottenuto dai soggetti.

1. Identificazione dei bambini con autismo con il DSM-5

Raccolta di anamnesi e informazioni di base
1. Storia dello sviluppo
  1. Raccogli informazioni sullo sviluppo precoce del paziente, inclusa la progressione del linguaggio, della società e delle abilità motorie.
  2. Notare eventuali ritardi o anomalie dello sviluppo (ad esempio, ritardo del linguaggio, difficoltà nell'interazione sociale).
2. Storia familiare
  1. Informarsi su eventuali storie familiari di autismo o altri disturbi dello sviluppo neurologico.
3. Livello di funzionalità attuale
  1. Valutare le prestazioni del paziente nella vita quotidiana, compreso l'apprendimento, il lavoro, le interazioni sociali e le capacità di vita indipendente.
Utilizzo dei criteri diagnostici del DSM-5
1. Deficit persistenti nella comunicazione sociale e nell'interazione sociale
  1. Assicurarsi che siano soddisfatti almeno due dei tre criteri seguenti:
    1. Deficit nella reciprocità socio-emotiva: cerca una mancanza di normale contatto visivo, espressioni facciali o linguaggio del corpo e difficoltà a formare amicizie o relazioni adeguate all'età.
    2. Deficit nei comportamenti comunicativi non verbali: cerca sfide nell'uso dei gesti, delle espressioni facciali o del tono di voce per trasmettere emozioni e una comprensione limitata dei segnali non verbali degli altri.
    3. Deficit nello sviluppo, nel mantenimento e nella comprensione delle relazioni: cerca difficoltà di adattamento ai diversi contesti sociali e mancanza di interesse per i coetanei o incapacità di impegnarsi in giochi fantasiosi.
2. Modelli di comportamento, interessi o attività limitati e ripetitivi
  1. Assicurarsi che siano soddisfatti almeno due dei quattro criteri seguenti:
    1. Movimenti motori stereotipati o ripetitivi (ad esempio, sbattere le mani, dondolare il corpo o uso ripetitivo di oggetti).
    2. Insistenza sull'uniformità o su modelli di comportamento ritualizzati: cerca un disagio estremo per piccoli cambiamenti nella routine.
    3. Interessi molto limitati e fissati: cerca di concentrarti in modo anormalmente intenso su argomenti o attività specifici.
    4. Iper- o iporeattività agli input sensoriali: cerca risposte atipiche a stimoli sensoriali come suoni, luci o tatto.
Valutazione dell'insorgenza e della gravità dei sintomi
1. La tempistica dei sintomi conferma che i sintomi erano presenti nella prima infanzia (in genere prima dei 3 anni), anche se diventano più evidenti in seguito.
2. Impatto dei sintomi: confermare che i sintomi causano una compromissione significativa nel funzionamento sociale, lavorativo o in altre importanti aree.
3. Livelli di gravità
  NOTA: Secondo il DSM-5, la gravità dell'ASD è classificata in tre livelli (Tabella supplementare S1).
  1. Classificare come livello 1 se il paziente richiede solo un supporto lieve.
  2. Classificare come livello 2 se il paziente richiede un supporto sostanziale (moderato).
  3. Classificare come livello 3 se il paziente richiede un supporto molto sostanziale (grave).
Esclusione di altre potenziali cause
1. Condurre le valutazioni mediche necessarie (ad esempio, test genetici, imaging cerebrale) per escludere altre condizioni che possono causare sintomi simili (ad esempio, sindromi genetiche, problemi di udito, disabilità intellettive).
2. Valutazione della comorbilità: valutare la presenza di condizioni di comorbilità (ad esempio, disturbo da deficit di attenzione e iperattività, disturbi d'ansia, depressione, epilessia, ecc.).

2. Preparazione del campione per l'analisi della spettrometria di massa DIA

Conformità etica e raccolta dei campioni
1. Ottenere il consenso informato dai genitori o dai tutori legali dei bambini di età compresa tra 3 e 7 anni con diagnosi di disturbo dello spettro autistico (ASD).
2. Classificare i pazienti nei livelli di gravità da 1 a 3 secondo i criteri diagnostici delineati nel DSM-5 americano per l'autismo (passaggio 1.3.3).
3. Raccogli campioni di siero dai partecipanti. Assicurarsi che tutti i campioni vengano elaborati entro quattro ore dalla raccolta del sangue per prevenire la degradazione delle proteine. Conservare i campioni sul ghiaccio durante la lavorazione.
Rimozione di proteine ad alta abbondanza
1. Utilizzare un kit commerciale per esaurire le proteine ad alta abbondanza da 60 μl di siero per campione, seguendo le istruzioni del produttore. In breve, equilibrare la colonna di deplezione con il tampone legante, caricare il campione di siero e lasciarlo passare attraverso la colonna sotto flusso per gravità. Raccogli il flusso, che contiene la frazione proteica a bassa abbondanza.
2. Misurare la concentrazione proteica totale utilizzando un test BCA. Normalizzare tutti i campioni fino a una concentrazione finale di 0,5-1,0 μg/μL prima della digestione in soluzione. Assicurarsi che ogni campione contenga almeno 100 μg di proteine per l'analisi successiva.
Digestione delle proteine
NOTA: La digestione delle proteine è stata eseguita utilizzando il metodo FASP descritto da Wisniewski et ^al.24.
1. Aggiungere il detergente, il ditiotreitolo (DTT) e lo iodoacetammide (IAA) nel tampone UA (tampone urea) per bloccare la cisteina ridotta.
2. Digerire la sospensione proteica con tripsina in un rapporto 50:1 per una notte a 37 °C.
Desalinizzazione, pulizia e frazionamento in fase inversa ad alto pH
1. Centrifugare le miscele di peptidi a 16.000 × g per 15 minuti a °C per rimuovere i detriti insolubili.
2. Trasferire il surnatante (contenente peptidi digeriti) in una nuova provetta da microcentrifuga a basso legame per ridurre al minimo le perdite di adsorbimento.
3. . Preparare le microcolonne C18 (riempite internamente con resina C18) precondizionandole con metanolo al 100% (20 μL) ed equilibrandole con acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1% (v/v) in acqua (tampone A; 20 μL).
4. Caricare il campione di peptidi sulla microcolonna. Lavare la colonna con 20 μl di tampone A per rimuovere sali, detergenti e contaminanti non peptidici.
5. Eluire peptidi purificati con 20 μL di acetonitrile all'80% contenente lo 0,1% di TFA.
6. Essiccare i peptidi eluiti sotto vuoto utilizzando un concentratore centrifugo sotto vuoto. Conservare i peptidi essiccati a -8 °C fino a nuovo utilizzo.
7. Ricostituire i peptidi essiccati in acido formico allo 0,1% prima dell'analisi LC-MS/MS.
8. 2.4.8.Quantificare la concentrazione di peptidi misurando l'assorbanza a 280 nm (OD₂₈₀) utilizzando uno spettrofotometro, tenendo conto dei contributi dei residui di triptofano e tirosina per una quantificazione accurata.
  Per frazionare miscele di peptidi utilizzando HPLC in fase inversa ad alto pH, utilizzare una colonna C18 (3,5 μm, 2,1 x 150 mm) su un sistema HPLC con una portata di 0,3 mL/min, fase mobile A: 10 mM di formiato di ammonio in acqua, pH 10 (regolato con idrossido di ammonio), fase mobile B: 10 mM di formiato di ammonio in acetonitrile al 90%, pH 10. Eseguire un'eluizione in gradiente per raccogliere 60 frazioni per campione in ~60 minuti.
9. Combina ogni terza frazione per ridurre la ridondanza, ottenendo 20 frazioni raggruppate per campione. Essiccare ogni frazione raggruppata sotto vuoto per l'analisi a valle.
  NOTA: Le frazioni peptidiche risultanti sono ora pronte per l'analisi nano-LC-MS/MS.

3. Presentazione per l'analisi di spettrometria di massa DIA

Analisi della spettrometria di massa DIA
1. Addizionare il peptide di acquisizione dipendente dai dati (DDA) dalla frazione HPRP con peptidi standard iRT e separarli utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa (RP-HPLC) su un sistema nano-HPLC con una colonna (75 μm x 150 mm; 2 μm di perle C18, 120 Å) a una velocità di flusso di 300 nL/min con fase mobile A: 0,1% di acido formico in acqua, fase mobile B: 0,1% di acido formico in acetonitrile al 95%.
2. Eluire i peptidi in 60 min con un gradiente lineare del tampone B impostato come segue: 0 - 2 min, gradiente lineare dal 2% al 5% del tampone B; 2 - 42 min, gradiente lineare dal 5% al 20% buffer B; 42 - 50 min, pendenza lineare dal 20% al 35% del buffer B; 50 - 52 min, pendenza lineare dal 35% al 90% del buffer B; 52 - 60 min, buffer B mantenuto al 90%.
3. Analizzare i peptidi eluiti sullo spettrometro di massa di riferimento. Acquisire dati MS utilizzando un metodo top20 dipendente dai dati, scegliendo dinamicamente gli ioni precursori più abbondanti dalla scansione dell'indagine (350 - 1500 m/z) per la frammentazione dell'HCD.
4. Eseguire lo strumento con la modalità di riconoscimento dei peptidi abilitata. Utilizzare una massa di blocco di 445.120025 Da come standard interno per la calibrazione della massa. Acquisisci le scansioni MS complete con una risoluzione di 70.000 a m/z 200 e 17.500 a m/z 200 per la scansione MS/MS. Impostare il tempo massimo di iniezione su 50 ms per MS e 30 ms per MS/MS, l'energia di collisione normalizzata su 28, la finestra di isolamento su 1,6 Th e la durata dell'esclusione dinamica su 30 s.
Analisi LC-MS/MS per l'acquisizione indipendente dai dati (DIA)
1. Peptidi di ciascun campione con iRT in modo uniforme e separato.
2. Esecuzione di LC-MS/MS su uno spettrometro di massa a quadrupolo abbinato a un sistema nano-HPLC. Impostare la condizione LC nello stesso modo del metodo DDA precedente. Eseguire una scansione di rilievo da 400 a 1.200 m/z alla risoluzione 60.000 con obiettivo AGC di 3E6 e tempo di iniezione di 30 ms. Acquisisci le scansioni DIA MS/MS alla risoluzione 15.000 con una finestra di isolamento di 20 m/z e con un target AGC di 1E6 e un tempo di iniezione di 50 ms. Impostate l'energia di collisione normalizzata su 30.
3. Registra gli spettri delle scansioni MS e DIA complete rispettivamente nei tipi di profilo e centroide.
Ricerca nel database delle sequenze
1. Analizza i dati DDA MS utilizzando il software DIA².
2. Cerca i dati MS nel database umano UniProtKB (186.532 voci totali, scaricato il 10/2019), arricchito con proteine costituite da 11 sequenze peptidiche iRT.
3. Seleziona la tripsina come enzima della digestione. Definire i due siti di scissione mancanti massimi e la tolleranza di massa di 4,5 ppm per gli ioni precursori e di 20 ppm per gli ioni frammento per la ricerca nel database. Definire la carbamidometilazione delle cisteine come modificazione fissa e l'acetilazione della proteina N-terminale e l'ossidazione della metionina come modificazioni variabili per la ricerca in database.
4. Filtra i risultati della ricerca nel database ed esportali con un tasso di false scoperte (FDR) del <1% rispettivamente a livello di spettro peptidico e proteine.
Eseguire l'elaborazione dei dati grezzi
1. Analizzare i dati DIA MS sono stati analizzati con il software DIA [34, 35] per la generazione di una libreria spettrale dai risultati della ricerca. Utilizzare le impostazioni predefinite per la ricerca e l'iRT dinamico per la previsione del tempo di conservazione. Assicurarsi che la correzione delle interferenze per la scansione MS/MS sia abilitata.
2. Esporta i risultati con FDR del <1% a livello di peptidi.

4. Analisi differenziale delle proteine

Eseguire test di ipotesi utilizzando il test t di Student combinato con il cambio di piega (FC) a http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=70.
1. Accedi alla piattaforma cloud e vai allo strumento di analisi dei test di ipotesi . Caricare il file di dati di quantificazione delle proteine pre-elaborate (ad esempio, in formato CSV o TXT).
2. Nelle impostazioni dei parametri, selezionare il test t di Student come metodo statistico e la soglia di significatività al valore p < 0,05. Definire la soglia di cambio piega come FC > 1.5 o FC < 1/1.5. Fare clic su Esegui analisi e attendere la generazione dei risultati.
3. Scarica il file di output contenente i valori p, log2(FC) e lo stato di significatività per ciascuna proteina.
  NOTA: Questo approccio a doppio criterio bilancia la significatività statistica con la rilevanza biologica, garantendo una solida identificazione delle proteine differenzialmente espresse (DEP).

5. Analisi del percorso del segnale

Visualizzazione del grafico del vulcano
1. Passare allo strumento in http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=63 e quindi alla pagina dello strumento di grafico del vulcano .
  1. Caricare il file dei risultati dell'analisi DEP dalla sezione 4.
  2. Configura parametro di visualizzazione: Asse X: log2 (Fold Change) - indica la direzione del cambiamento; Asse Y: -log10(p-value) - riflette la significatività statistica; Codifica a colori: Rosso : proteine significativamente sovraregolate (p < 0,05 e FC > 1,5); Blu : proteine significativamente sottoregolate (p < 0,05 e FC < 0,667); Grigio : proteine non significative (p ≥ 0,05 o 1/1,5 ≤ FC ≤ 1,5).
  3. Fare clic su Genera immagine e scaricare l'immagine ad alta risoluzione (formato PDF/SVG) per la pubblicazione.
Mappa termica del clustering gerarchico
1. Passare allo strumento in http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=17
  1. Accedi allo strumento mappa termica di clustering .
  2. Caricare la matrice di espressione DEP filtrata.
  3. Impostare i seguenti parametri: Metodo di normalizzazione: Z-score per riga per eliminare le differenze di scala; Metrica della distanza: distanza euclidea; Metodo di clustering: clustering gerarchico completo di linkage; Facoltativo: abilita il clustering di colonne e/o righe a seconda del raggruppamento del campione.
  4. Fare clic su Esegui per generare la mappa termica.
  5. Scarica e salva la mappa di calore come immagine pronta per la pubblicazione.
    NOTA: La heatmap rappresenta visivamente la somiglianza e la divergenza dei modelli di espressione proteica tra i campioni.
Analisi dell'annotazione funzionale e dell'arricchimento GO
1. Installare e caricare i pacchetti R necessari:
  libreria (clusterProfiler)
  biblioteca (org. Hs.eg.db)
  Libreria(ggplot2)
2. Converti gli ID delle proteine (ad esempio, Uniprot o simboli genetici) in ID Entrez:
  entrez_ids <- bitr(diff_proteins, fromType = "UNIPROT", toType = "ENTREZID", OrgDb = org. Hs.eg.db)
3. Eseguire l'analisi dell'arricchimento GO:
  go_enrich <- enrichGO(gene = entrez_ids$ENTREZID, OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = "ENTREZID", ont = "BP")
4. Visualizza i risultati utilizzando i dot plot:
  1. dotplot(go_enrich; showCategory = 20)
    Formula:
    Fattore di ricchezza = (a/b) / (c/d)
    Dove:
    a = numero di DEP annotati al termine;
    b = numero totale di DEP;
    c = numero di proteine di fondo annotate al termine;
    d = numero totale di proteine di fondo.
Analisi dell'annotazione e dell'arricchimento del percorso KEGG
1. Condurre l'analisi dell'arricchimento KEGG:
  kegg_enrich <- enrichKEGG(gene = entrez_ids$ENTREZID, organismo = "ha")
2. Visualizza i risultati del percorso KEGG:
  barplot(kegg_enrich, showCategory = 20)
3. Personalizza i grafici utilizzando ggplot2 per la formattazione della pubblicazione.

6. Screening iniziale delle proteine mediante analisi della curva ROC

Preparazione dei dati: Caricare il set di dati di proteomica contenente tutte le proteine differenzialmente espresse (DEP) identificate dal disturbo dello spettro autistico (ASD) e dai gruppi di controllo. Assicurati che il set di dati includa i valori di espressione proteica per entrambi i gruppi, con etichette chiare che indichino ASD e campioni di controllo.
Esegui l'analisi della curva ROC.
1. Utilizzare il pacchetto pROC in R per eseguire l'analisi della curva ROC (Receiver Operating Characteristic) per ciascuna proteina.
2. Valutare la capacità di ciascuna proteina di distinguere tra l'ASD e i gruppi di controllo calcolando l'area sotto la curva (AUC).
  AUC = 0,5: Nessuna discriminazione (equivalente al caso).
  0,7 ≤ AUC < 0,8: Discriminazione accettabile.
  0,8 ≤ AUC < 0,9: Ottima discriminazione.
  AUC ≥ 0,9: Eccezionale discriminazione.
  NOTA: L'AUC rappresenta la probabilità che un individuo selezionato casualmente dal gruppo ASD abbia un livello proteico più elevato rispetto a un individuo selezionato casualmente dal gruppo di controllo. Un'AUC più elevata indica una migliore performance diagnostica, con valori superiori a 0,8 generalmente considerati clinicamente significativi negli studi sui biomarcatori.
3. Registrare i valori di AUC per tutte le proteine.
Seleziona i biomarcatori candidati.
1. Identificare le proteine con un'AUC maggiore di 0,7 come biomarcatori candidati.
2. Esporta l'elenco dei biomarcatori candidati per ulteriori analisi.
Visualizza i risultati.
1. Utilizzare il pacchetto ggplot2 in R per creare visualizzazioni delle curve ROC per le proteine con le prestazioni migliori.
2. Includere i valori AUC nelle legende del tracciato per maggiore chiarezza.

7. Screening secondario utilizzando Random Forest

Preparare i dati di input.
1. Utilizzare l'elenco dei biomarcatori candidati ottenuti dall'analisi ROC come input per l'analisi casuale delle foreste.
2. Assicurarsi che il set di dati sia formattato in modo appropriato, con righe che rappresentano i campioni e colonne che rappresentano i valori di espressione delle proteine.
Eseguire il training del modello Random Forest.
1. Applicare l'algoritmo della foresta casuale utilizzando il pacchetto randomForest in R.
2. Imposta il numero di alberi (ntree) a 500 e il numero di variabili campionate casualmente ad ogni divisione (mtry) alla radice quadrata del numero totale di funzionalità.
3. Valutare l'importanza delle funzionalità usando la metrica MeanDecreaseAccuracy, che misura la riduzione dell'accuratezza del modello quando una funzionalità specifica viene rimossa.
4. Eseguire il training di un modello di foresta casuale utilizzando il pacchetto randomForest in R:
  R. biblioteca(foresta casuale)
  # Esempio: gruppo predittivo (ad esempio, ASD vs. controllo) utilizzando i livelli proteici
  rf_model <- Foresta casuale(x = protein_data,
  y = as.factor(gruppo),
  importance = TRUE, # Necessario per calcolare l'importanza delle funzionalità
  ntree = 500) # Numero di alberi
5. Estrai le metriche di importanza delle funzionalità utilizzando la funzione importance():
  R. importance_scores <- importanza(rf_model)
6. Recuperare i valori di MeanDecreaseAccuracy e ordinarli in ordine decrescente:
  R. mean_dec_acc <- importance_scores[ , "MeanDecreaseAccuracy"]
  importance_rank <- ordinamento(mean_dec_acc, decrescente = VERO)
7. Visualizza l'importanza delle funzionalità utilizzando la funzione integrata varImpPlot():
  R. varImpPlot(rf_model, main = "Importanza della funzione (diminuzione media dell'accuratezza)")
  NOTA: la metrica MeanDecreaseAccuracy riflette l'importanza di ogni funzionalità per le prestazioni predittive del modello. Una forte diminuzione della precisione al momento della rimozione indica un'elevata importanza. Questo approccio è particolarmente utile per la scoperta di biomarcatori, in quanto aiuta a dare priorità alle proteine o ai geni con il più forte potere discriminatorio tra i gruppi.
8. Esportare i punteggi di importanza per la creazione di report o l'analisi a valle:
  R. importance_table <- data.frame(
  Caratteristica = nomi(importance_rank),
  MeanDecreaseAccuracy = importance_rank
  )
  write.csv(importance_table, "feature_importance.csv", nome.riga = FALSO)
9. Classificare le proteine in base ai punteggi MeanDecreaseAccuracy.
10. Selezionare le prime 15 proteine con i punteggi MeanDecreaseAccuracy più elevati come funzionalità più significative per la modellazione successiva.
11. Esporta l'elenco di queste proteine per un'ulteriore convalida.
  NOTA: le proteine con valori MeanDecreaseAccuracy bassi possono avere un impatto minimo sulle prestazioni del modello se rimosse.
12. Evidenziare la rilevanza biologica delle proteine selezionate, in particolare quelle correlate alle funzioni immunitarie o ai percorsi implicati nell'ASD.

8. Combina i risultati per la selezione finale dei biomarcatori.

NOTA: Assicurarsi che R sia installato con i seguenti pacchetti: pROC, randomForest e ggplot2. Assicurarsi che il set di dati di proteomica sia pre-elaborato e normalizzato prima dell'analisi. Salva gli elenchi dei biomarcatori candidati e i grafici di visualizzazione come file separati come riferimento.

Integra i risultati.
1. Incrocia i risultati dell'analisi ROC e dello screening forestale casuale per identificare le proteine sovrapposte.
2. Dare priorità alle proteine che compaiono in entrambe le analisi come biomarcatori candidati altamente affidabili.
3. Esegui ulteriori passaggi di convalida, come la convalida incrociata leave-one-out (LOOCV), per confermare la robustezza dei biomarcatori selezionati.
4. Utilizza i modelli di regressione logistica per valutare l'accuratezza predittiva del set di biomarcatori combinato.
5. Crea curve ROC e grafici di richiamo di precisione per il set finale di biomarcatori utilizzando il pacchetto ggplot2.
6. Includi metriche come l'AUC e i valori di richiamo di precisione per dimostrare il potenziale diagnostico dei biomarcatori selezionati.

9. Selezione bidirezionale delle funzioni

Preparare i dati e definire il modello.
1. Caricare il set di dati contenente i valori di espressione proteica e le etichette corrispondenti (ad esempio, ASD vs. controllo). Assicurarsi che il set di dati sia pre-elaborato e normalizzato.
2. Definire il modello iniziale: utilizzare un modello lineare generalizzato (GLM) con una famiglia binomiale per la classificazione.
3. Utilizzare AIC come metrica di valutazione per confrontare i modelli durante la selezione delle funzionalità.
Eseguire la selezione della funzione in avanti.
1. Iniziate con un modello vuoto contenente solo il termine di intercettazione.
2. Aggiungi una funzionalità alla volta in base alla massima riduzione dell'AIC.
3. Registrare il valore AIC dopo ogni aggiunta. Interrompere quando non si osserva un'ulteriore riduzione dell'AIC.
Eseguire la selezione delle funzioni a ritroso.
1. Eseguire il training di un modello utilizzando tutte le funzionalità disponibili.
2. Rimuovi una funzione alla volta in base al più piccolo aumento di AIC.
3. Registrare il valore AIC dopo ogni rimozione. Interrompere quando non si osserva un'ulteriore riduzione dell'AIC.
4. Combina i passi avanti e indietro.
Alterna la selezione in avanti e all'indietro.
1. Eseguite un ciclo di selezione delle feature in avanti, seguito immediatamente da un round di selezione delle feature all'indietro. Ripetere questo processo fino a quando non si osservano ulteriori miglioramenti nell'AIC.
2. Approccio alternativo: iniziare con la selezione delle funzioni a ritroso, quindi eseguire la selezione delle funzioni in avanti. Valutate l'effetto dell'aggiunta di feature rimosse in precedenza nel modello.
Finalizzate le feature selezionate.
1. Esportare l'elenco finale delle caratteristiche selezionate e i coefficienti corrispondenti (Figura supplementare S1).

10. Convalida incrociata della selezione bidirezionale delle caratteristiche utilizzando la regressione logistica con il metodo leave-one-out

NOTA: Assicurarsi che R sia installato con i seguenti pacchetti: caret, pROC e ggplot2. Il set di dati di proteomica deve essere pre-elaborato e normalizzato prima dell'analisi. Salvate la matrice di confusione, la curva ROC e il riepilogo del modello come file separati come riferimento.

Preparare i dati e definire il modello.
1. Caricare il set di dati contenente i valori di espressione proteica e le etichette corrispondenti (ad esempio, ASD vs. controllo) dal file GLMSTEP/bothFitModel.txt. Assicurarsi che il set di dati sia pre-elaborato e normalizzato.
2. Definisci il modello iniziale utilizzando un modello lineare generalizzato (GLM) con una famiglia binomiale per la classificazione.
3. Utilizza l'accuratezza e il coefficiente Kappa come metriche di valutazione per valutare le prestazioni del modello durante la convalida incrociata.
Eseguire la convalida incrociata leave-one-out.
1. Inizializzare la convalida incrociata usando il pacchetto caret in R per implementare la convalida incrociata leave-one-out (LOOCV).
2. Adattare il modello di regressione logistica utilizzando le otto funzionalità selezionate.
3. Registra l'accuratezza e il coefficiente Kappa per ogni iterazione di convalida incrociata.
Analizzare i risultati della convalida incrociata.
1. Riepiloga i risultati.
  NOTA: I risultati del processo LOOCV saranno simili (come in questo studio): Modello lineare generalizzato, 169 campioni, 8 predittori, 2 classi: 'A', 'B', Ricampionamento: Leave-One-Out Cross-Validation , Riepilogo delle dimensioni del campione: 168, 168, 168, 168, 168, 168, ... , Risultati del ricampionamento: Precisione Kappa 0.9526627 0.9024531.
2. Interpretare le metriche.
  NOTA: In questo caso, il modello ha raggiunto un'accuratezza di 0,9527 e un coefficiente Kappa di 0,9025, indicando un eccellente accordo tra i risultati previsti e quelli osservati.
  1. Osserva il coefficiente Kappa per valutare il potere predittivo del modello. Il coefficiente Kappa varia da -1 a 1, dove 0 indica una previsione casuale e 1 indica un accordo perfetto.
    NOTA: In questo studio, il valore Kappa di 0,9025 riflette il forte potere predittivo del modello.
Valutare i coefficienti del modello.
1. Esaminare i coefficienti del modello di regressione logistica per comprendere il contributo di ciascuna funzionalità. Valutare la devianza nulla, la devianza residua e l'AIC per confermare l'adattamento del modello.
  NOTA: Ad esempio, in questo studio, abbiamo ottenuto la devianza nulla: 2,2928e+02 su 168 gradi di libertà, la devianza residua: 2,2378e-07 su 160 gradi di libertà, AIC: 18, numero di iterazioni del Fisher Score: 25.
Visualizza i risultati.
1. Creare una matrice di confusione per visualizzare le prestazioni predittive del modello.
2. Tracciare la curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) per valutare le prestazioni di classificazione del modello.
3. Interpretare il risultato s. Calcolare l'area sotto la curva (AUC) per ottenere l'indice di prestazione di classificazione del modello.
  NOTA: la curva ROC mostra il compromesso tra il tasso di veri positivi e il tasso di falsi positivi. L'area sotto la curva (AUC) dovrebbe essere vicina a 1, indicando eccellenti prestazioni di classificazione. La curva ROC riflette le variazioni del tasso di veri positivi e del tasso di falsi positivi del modello a soglie diverse. Maggiore è il valore dell'area audiovisiva, migliori saranno le prestazioni del modello.

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Risultati

Lo studio ha incluso 99 bambini con ASD e 70 controlli di pari età (3-7 anni), con distribuzione equilibrata per sesso (Tabella supplementare S2). Il siero è stato raccolto dopo il digiuno notturno utilizzando protocolli standardizzati: il sangue è stato prelevato in provette di separazione del siero, lasciato coagulare a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi centrifugato a 1.500 × g per 10 minuti a 4 °C. Il surnatante è stato aliquotato e conservato a -80 ...

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Discussione

Il protocollo descritto in questo manoscritto delinea un approccio completo per l'identificazione di biomarcatori molecolari immuno-correlati nel disturbo dello spettro autistico (ASD) utilizzando tecniche di spettrometria di massa e apprendimento automatico con acquisizione indipendente dai dati (DIA). I passaggi importanti all'interno del protocollo garantiscono risultati affidabili e riproducibili, evidenziando anche le aree in cui potrebbero essere necessarie modifiche o risoluzione ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Grazie a tutti i membri del laboratorio centrale e a coloro che hanno contribuito a questo progetto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti e prodotti chimici	Acetonitrile (grado HPLC)	Fisher Scientifico	A18-50
Reagenti e prodotti chimici	Il bicarbonato di ammonio (NH? HCO?)	Sigma-Aldrich	38939
Reagenti e prodotti chimici	Formiato di ammonio	Sigma-Aldrich	90265
Reagenti e prodotti chimici	Albumina sierica bovina (BSA)	Thermo Fisher Scientifico	23212
Reagenti e prodotti chimici	Ditiotreitolo (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Reagenti e prodotti chimici	Acido formico (0,1%)	Thermo Fisher Scientifico	28905
Reagenti e prodotti chimici	Iodoacetammide (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149
Reagenti e prodotti chimici	Metanolo (grado HPLC)	Fisher Scientifico	A452-4
Reagenti e prodotti chimici	Acido trifluoroacetico (TFA)	Sigma-Aldrich	T6508
Reagenti e prodotti chimici	Urea	Sigma-Aldrich	U5378
Kit e reagenti specializzati	Kit per il dosaggio delle proteine BCA	Thermo Fisher Scientifico	23227
Kit e reagenti specializzati	Cartucce C18 Sep-Pak	Acque	WAT023590
Kit e reagenti specializzati	C18 StageTips (fatti in casa)	3M Empore&commercio;
Kit e reagenti specializzati	Kit per la deplezione delle proteine ad alta abbondanza	Millipore Sigma	122642
Kit e reagenti specializzati	Peptidi standard iRT	Biognosys AG
Kit e reagenti specializzati	Kit ELISA per lisozima	Wuhan Fine Biotech Co.	Ltd.
Kit e reagenti specializzati	Miscela di enzimi tripsina/lisc	Promega	V5071
Equipaggiamento	Centrifuga	Eppendorf	5430R
Equipaggiamento	Sistema Easy-nLC 1200	Thermo Fisher Scientifico
Equipaggiamento	Spettrofotometro Nanodrop One	Thermo Fisher Scientifico	ND-ONE-W
Equipaggiamento	Spettrometro di massa HF-X exattivo Q	Thermo Fisher Scientifico
Equipaggiamento	Concentratore SpeedVac	Thermo Fisher Scientifico	SPD131DDA
Equipaggiamento	Centrifuga rotore a secchiello	Diverso
Equipaggiamento	Waters XBridge BEH130 Colonna	Acque	C18, 3,5 e mu; m, 2,1 & volte; 150 millimetri
Equipaggiamento	Sistema HPLC Agilent 1260	Agilent	1260 Infinito II
Software e strumenti online	Bioconduttore (pacchetti R)	bioconductor.org
Software e strumenti online	cursore (pacchetto R)	CRAN	caret_6,0-93
Software e strumenti online	clusterProfiler (pacchetto R)	Bioconduttore	4.0.5
Software e strumenti online	DIA-NN	Software DIA-NN	v1.8
Software e strumenti online	ggplot2 (pacchetto R)	CRAN	3.4.0
Software e strumenti online	MaxQuant	Istituto Max Planck	1.6.17
Software e strumenti online	omickits.com	Piattaforma cloud OmiKits	http://www.omickits.com
Software e strumenti online	pROC (pacchetto R)	CRAN	1.18.0
Software e strumenti online	randomForest (pacchetto R)	CRAN	4.7-1.1
Software e strumenti online	Pulsar Spettronautica X	Biognosys AG	17
Software e strumenti online	Database umano UniProtKB	uniprot.org	Versione 2019_10
Altri materiali	Provette per microcentrifuga a basso legame	Eppendorf	30120094
Altri materiali	Provette separatori di siero (SST)	BD Bioscienze	367988
Altri materiali	3M Empore&commercio; Dischi C18	3M

Riferimenti

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Tag

Biomarcatori immunitari proteoma sierico biomarcatori proteici espressione proteica differenziale arricchimento funzionale regressione logistica