Analisi di dati di microscopia multidimensionale utilizzando Cell-ACDC

Summary

L'analisi accurata dei dati di microscopia multidimensionale richiede flussi di lavoro complessi. Questo articolo mostra come utilizzare il software Cell-ACDC. Sfrutta modelli all'avanguardia basati sull'intelligenza artificiale per la segmentazione, il tracciamento, l'analisi del pedigree cellulare e la quantificazione dei dati di microscopia. Fondamentalmente, integra questi modelli con un framework innovativo per la correzione semi-automatica dell'output dei modelli.

Abstract

I recenti progressi nella microscopia quantitativa per le scienze della vita hanno permesso ai biologi sperimentali di sondare le cellule con una risoluzione e una velocità senza precedenti. Allo stesso tempo, la rivoluzione dell'intelligenza artificiale ha aumentato notevolmente la quantità di informazioni che possono essere estratte dai dati di microscopia multidimensionale. Tuttavia, la grande quantità di dati generati e la complessità dei modelli di intelligenza artificiale all'avanguardia rappresentano un grave collo di bottiglia nella fase di analisi delle immagini. Cell-ACDC è un software open source e di facile utilizzo che fornisce una potente soluzione end-to-end per la segmentazione, il tracciamento e l'analisi quantitativa di singole cellule in dati di microscopia multidimensionale. È pensato per i biologi sperimentali che potrebbero non avere le competenze tecniche avanzate necessarie per implementare tali modelli. Questo articolo mostra come utilizzare il framework per sfruttare facilmente i modelli più recenti, insieme a molti strumenti per la correzione intelligente e semi-automatica dei dati, per massimizzare la quantità di informazioni biologiche ottenibili. Cell-ACDC supporta dati di microscopia multicanale, time-lapse e z-stack e fornisce un set di strumenti dedicato su misura per ogni tipo di dimensionalità dei dati. Grazie al suo design modulare, che consente ai biologi di integrare senza problemi i nuovi modelli e di accedervi direttamente, Cell-ACDC ha il potenziale per fungere da strumento di riferimento per l'analisi dei dati al microscopio.

Introduction

La microscopia è diventata fondamentale per accelerare la scoperta biologica in ogni fase della ricerca e dello sviluppo, dalla scienza di base ^1,2,3 alla scoperta e alla sperimentazione di farmaci ^4,5 e in una notevole gamma di dimensioni, dalle colture cellulari ai tessuti ^6,7, dagli organoidi ^8,9 agli organismi interi¹⁰. Queste tecniche di microscopia avanzate, tuttavia, presentano due svantaggi principali. In primo luogo, i dati della microscopia sono intrinsecamente grandi¹¹, specialmente quando si acquisiscono più dimensioni (ad esempio, tempo e volumi). In secondo luogo, l'estrazione accurata delle ricche informazioni biologiche contenute nei dati richiede l'implementazione di framework avanzati di analisi delle immagini che spesso si basano su modelli di intelligenza artificiale. Questo compito può essere scoraggiante per i biologi sperimentali. Pertanto, le fasi di gestione, elaborazione e analisi dei dati possono rallentare notevolmente la ricerca scientifica riducendo al contempo il potenziale di nuove scoperte. Idealmente, i framework software per l'analisi delle bioimmagini dovrebbero assistere l'utente in ogni fase dell'analisi, dalla gestione dei file di microscopia grezza attraverso la segmentazione e il tracciamento fino all'analisi a valle per l'estrazione di informazioni biologiche. In pratica, il rapido sviluppo di nuovi software per l'analisi delle bioimmagini, pur essendo un risultato positivo, ha avuto l'effetto collaterale di creare un panorama sparso di strumenti specifici per una particolare fase di analisi o che richiedeva competenze di programmazione avanzate. Ciò lascia all'utente il compito impegnativo di assemblare il flusso di lavoro dell'analisi, che spesso si traduce in pipeline non ottimali in cui i dati vengono salvati, manipolati e convertiti più volte per renderli compatibili con lo strumento successivo. Inoltre, lo sviluppo dell'analisi delle bioimmagini non è standardizzato a un singolo linguaggio di programmazione, con molti strumenti sviluppati come i plug-in ImageJ¹² o QuPath¹³ (Java), i plug-in Napari (Python)¹⁴ o gli script Python. In alcuni casi, questo ambiente difficile porta gli scienziati a optare per l'analisi manuale, un processo che non solo è lento, ma introduce anche pregiudizi umani e ostacola la riproducibilità.

Per risolvere questo problema, è stato sviluppato Cell-ACDC (Cell-Analysis of the Cell Division Cycle)¹⁵, un set di strumenti software open source basato su GUI scritto in Python per analizzare i dati di microscopia multidimensionale. Fondamentalmente, Cell-ACDC fornisce una moltitudine di modelli all'avanguardia pre-implementati e installati automaticamente (quando necessario) per entrambe le segmentazioni (Cellpose, StarDist, Segment Anything, YeaZ, YeastMate, ecc.16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26^,27,28) e tracciamento (Trackastra, Trackpy, Bayesian Tracker, Cell-ACDC, ecc.19,29,30,31,32,33,34). Questi modelli sono integrati da un framework per la visualizzazione di dati annotati e correzioni manuali assistite da computer. Inoltre, all'interno dello stesso framework, Cell-ACDC fornisce un modulo per ogni fase della pipeline di analisi delle immagini, occupandosi automaticamente della gestione, dell'elaborazione e del salvataggio dei dati (Figura 1). Più specificamente, consente all'utente di eseguire la segmentazione delle istanze (ad esempio, singole cellule), il tracciamento degli oggetti, l'annotazione degli stati delle celle (ad esempio, la fase del ciclo cellulare) e varie forme di quantificazione, inclusa l'analisi dei canali di fluorescenza disponibili.

Uno dei principali punti di forza di Cell-ACDC è l'analisi dei dati di microscopia time-lapse su cellule vive, che pone sfide significative a causa della necessità di coerenza tra i punti temporali. Sebbene esistano numerosi modelli per la segmentazione e il tracciamento automatizzati di singole cellule, le correzioni manuali rimangono essenziali per affrontare questioni biologiche complesse. Cell-ACDC offre una suite di strumenti specificamente progettati per semplificare il processo di correzione. Integra algoritmi intelligenti per ridurre al minimo il numero di regolazioni manuali. In particolare, le correzioni vengono propagate automaticamente a tutti i frame futuri e passati rilevanti, preservando l'integrità dei dati durante l'analisi. Dato il suo design modulare e la crescente base di utenti, lo sviluppo continuo di questo software è una priorità, con sforzi continui concentrati sull'integrazione di nuovi modelli e sulla risposta alle esigenze in evoluzione della comunità.

Protocol

NOTA: Cell-ACDC è progettato per essere il più chiaro e intuitivo possibile per gli utenti, senza alcun background di programmazione. Ciò si ottiene principalmente suddividendo il flusso di lavoro dell'analisi in passaggi più piccoli e facili da seguire e fornendo informazioni aggiuntive tramite suggerimenti e pulsanti informativi. Poiché Cell-ACDC copre un'ampia gamma di passaggi il cui ordine di esecuzione spesso non è sequenziale, nella Figura 2 è mostrato un grafico decisionale. La seguente guida esaminerà un esempio specifico. I passaggi 10 e 11 possono essere utilizzati per importare altri dati invece di utilizzare i dati forniti scaricati nel passaggio 3.

1. Installazione di Cell-ACDC

NOTA: Cell-ACDC è attualmente distribuito come pacchetto Python tramite Python Package Index (PyPI) e può essere installato con il comando pip install "cellacdc[torch]".

1. Installazione Miniforge
   1. Scarica il programma di installazione dal sito web di Miniforge (vedi la Tabella dei materiali per i dettagli).
   2. Installa Miniforge: per Windows, esegui il programma di installazione scaricato e segui le istruzioni. Per Mac o Linux, apri il terminale ed esegui il seguente comando:
      curl -L -O "https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Miniforge3-$(uname)-$(uname -m).sh
   3. Una volta completata l'installazione, aprire il terminale corretto seguendo le istruzioni seguenti:
      1. Per Windows, premi Win + S, digita Miniforge Prompt e premi Invio.
      2. Per Mac/Linux: apri l'app Terminale.
2. Gestisci l'ambiente virtuale.
   1. Nel prompt, digitare il seguente comando per creare un ambiente virtuale. Quindi premere Invio per eseguire il comando.
      conda create -y -n acdc python=3.12
   2. Attiva l'ambiente eseguendo:
      conda attiva acdc
3. Installazione
   1. Con l'ambiente attivo, installare Cell-ACDC eseguendo il seguente comando:
      pip installa "cellacdc[torcia]"
   2. Dopo l'installazione, eseguire Cell-ACDC -y per consentire al software di completare la configurazione.

2. Esecuzione di Cell-ACDC

1. Aprire il terminale corretto (vedere il passaggio 1.1.3).
2. Attivare l'ambiente eseguendo il comando:
   conda attiva acdc
3. Avviare Cell-ACDC eseguendo il seguente comando:
   Cella-ACDC

3. Download dei dati di esempio

NOTA: i dati di esempio verranno scaricati in "C:\Users\%USERNAME%\acdc-appdata\acdc-examples\TimeLapse_2D\Position_8" su Windows e in "~/acdc-appdata/acdc-examples/TimeLapse_2D/Position_8" su MacOS e Linux. Se la guida di benvenuto non viene visualizzata, selezionare Guida > Guida di benvenuto (Figura 3B) nella barra dei menu della finestra principale del launcher Cell-ACDC (Figura 1), .

1. Selezionare Scarica e verifica con un esempio time-lapse (Figura 3B).
2. Attendi fino al termine del download.
3. Fare clic su No, grazie per interrompere il caricamento dei dati direttamente nella GUI.

4. Modulo di preparazione dei dati

NOTA: i dati possono essere allineati prima della segmentazione e possono essere selezionate le regioni di interesse (ROI). Questi passaggi sono facoltativi ma utili se il campo visivo è spostato nel tempo o se solo parti dei dati sono di interesse, rispettivamente.

1. Fare clic su Avvia modulo di preparazione dati... nella finestra principale per aprire il modulo di preparazione dati (Figura 1A, Modulo di pre-elaborazione dati).
2. Selezionare la cartella contenente i dati.
   1. Fare clic sull'icona della cartella nella barra degli strumenti della nuova finestra per caricare i dati della microscopia (Figura 4A).
   2. Selezionare la cartella contenente i dati, quindi confermare la selezione premendo Seleziona cartella.
3. Selezionare un canale per il processo di allineamento utilizzando il menu a discesa per selezionare il canale phase_contr . Quindi, premere Ok per confermare la selezione (Figura 4B).
4. Premere Ok per confermare le proprietà dell'immagine (Figura 4C).
   NOTA: Se si lavora con i dati z-stack, ma è necessario utilizzare una sola sezione per la segmentazione, selezionare la z-sezione appropriata utilizzando il dispositivo di scorrimento. Utilizzare i pulsanti nella barra degli strumenti per applicare la selezione ad altri fotogrammi, se necessario.
5. Eseguire il processo di allineamento.
   1. Fare clic sul pulsante di avvio , anch'esso situato nella barra degli strumenti (Figura 5A).
   2. Fare clic su Sì per avviare il processo di allineamento.
      NOTA: Fare clic su No per ignorare l'allineamento.
   3. Premere Ok per confermare che le informazioni sulla spaziatura interna sono state riconosciute.
      NOTA: L'allineamento potrebbe richiedere del tempo, a seconda delle dimensioni dei dati.
   4. Premere Ok per terminare l'allineamento una volta completato il processo.
6. Imposta le ROI e le ROI in background.
   1. Vai all'ultimo fotogramma del video di segmentazione utilizzando il cursore di selezione del fotogramma nella parte inferiore della GUI di preparazione dei dati.
   2. Regola il ROI dello sfondo aggiunto automaticamente trascinandolo sull'immagine o ridimensionandolo utilizzando i rombi. Assicurati che il ROI in background non abbia celle. Lasciare il ROI così com'è (Figura 5B).
      NOTA: per definire ulteriori ROI, fare clic sul pulsante Aggiungi ROI di ritaglio (situato nella barra degli strumenti) e selezionarli nel visualizzatore. Di solito, il ROI dovrebbe essere il più piccolo possibile, pur comprendendo tutte le celle di interesse nei frame pertinenti. Tuttavia, per garantire la riproducibilità all'interno di questo protocollo, si consiglia di non modificarlo.
7. Per ritagliare le ROI selezionate in nuovi file immagine, fai clic sul pulsante Ritaglia più a sinistra.
   NOTA: Questo passaggio è facoltativo. Se le immagini ritagliate non sono necessarie, la finestra può essere chiusa. Le coordinate di tutte le ROI e le ROI in background vengono salvate automaticamente e possono essere utilizzate in seguito per la segmentazione. Se il ROI non è stato modificato, questi pulsanti non faranno nulla. Le opzioni di ritaglio includono direzioni XY, sezioni z o intervalli di tempo specifici. Ogni pulsante è etichettato con le dimensioni che verranno ritagliate.
8. Salvare i dati allineati
   1. Chiudi la finestra utilizzando il pulsante di chiusura della finestra (ad esempio, la X nell'angolo in alto a destra su Windows o il punto rosso nell'angolo in alto a sinistra su macOS o Linux).
   2. Premere Sì, salva dati allineati per salvare i dati allineati.
   3. Fare clic su Sì, salvare nuovamente i dati allineati per confermare.
9. Salvare i dati ritagliati se il passaggio 4.7 non è stato saltato e il ROI non è stato modificato.
   1. Selezionare Sì, salva i dati ritagliati per salvare i dati ritagliati.
   2. Premere Sì, ritaglia per favore per confermare il salvataggio del ritaglio.
   3. Fare clic su OK per confermare il percorso predefinito della cartella.
      NOTA: Selezionare una cartella diversa per conservare i dati non ritagliati.
   4. Selezionare Sì, sovrascrivi per confermare se il percorso predefinito è stato utilizzato in precedenza.
   5. Premere Ok per confermare al termine del processo.

5. Trovare il modello e i parametri migliori per la segmentazione

NOTA: Cell-ACDC offre un'interfaccia grafica con feedback in tempo reale per trovare i migliori parametri di segmentazione (Figura 6). In generale, questi modelli sono forniti da terze parti, ognuna con la propria documentazione. È responsabilità dell'utente determinare il miglior modello di segmentazione e i suoi parametri ottimali, e gli utenti devono controllare la documentazione del rispettivo modello che stanno cercando per ulteriori informazioni.

1. Fare clic su Avvia GUI... nella finestra principale (Figura 1A, Visualizza e correggi modulo).
2. Caricare i dati di esempio.
   1. Fare clic sull'icona della cartella nella barra degli strumenti della nuova finestra per aprire il menu di selezione della cartella.
   2. Selezionare la cartella contenente i dati, quindi premere Seleziona cartella per confermare la selezione.
3. Selezionare un canale per la visualizzazione. Utilizza il menu a discesa per selezionare il canale phase_contr per la segmentazione, quindi seleziona Ok per confermare.
4. Termina il caricamento dei dati.
   1. Premere Ok per confermare il nome della maschera di segmentazione predefinita.
   2. Fare clic su OK per le posizioni caricate per confermare le proprietà dell'immagine.
   3. Selezionare No per impedire il caricamento di ulteriori dati di fluorescenza.
5. Nel selettore di modalità (Figura 6, "Selettore di modalità"), selezionare la modalità Segmentazione e tracciamento.
6. Trova le migliori impostazioni di pre-elaborazione.
   1. Passare a Pre-elaborazione > immagini... nella barra dei menu in alto per aprire la finestra di pre-elaborazione personalizzata (Figura 7A).
   2. Seleziona Rimuovi pixel attivi o un altro passaggio di pre-elaborazione desiderato nel menu a discesa.
   3. Utilizzare l'icona a forma di ingranaggio per inizializzare e modificare le impostazioni per un passaggio. Utilizzare il pulsante info per visualizzare le informazioni sul passaggio e sui parametri disponibili. Lasciare invariate le impostazioni.
   4. Usa l'icona più per aggiungere un altro passaggio.
   5. Selezionare Intensità di ridimensionamento e confermare le impostazioni ripetendo i passaggi 5.6.1 e 5.6.2.
   6. Seleziona la casella di controllo di anteprima per vedere gli effetti dei passaggi in tempo reale.
   7. Fare clic su Applica a tutti i fotogrammi (Figura 7B).
   8. Premere Salva dati pre-elaborati per avviare il processo di salvataggio.
   9. Premere Ok per confermare il nome predefinito.
   10. Chiudere la finestra Ricetta di pre-elaborazione .
7. Trova le migliori impostazioni di segmentazione.
   1. Selezionare Segmento > Segmento di cornice visualizzato nella barra multifunzione superiore, quindi selezionare YeaZ_v2 (Figura 8A).
   2. Premi Ok per scaricare YeaZ_v2 se richiesto.
      NOTA: il download può richiedere diversi minuti. Lo stato di avanzamento viene visualizzato nella finestra della console. Non chiudere la GUI durante il download, anche se non risponde.
   3. Lasciare invariati i parametri predefiniti.
      NOTA: La maggior parte dei parametri dispone di pulsanti informativi che forniscono una guida dettagliata.
   4. Abilitare la post-elaborazione controllando i parametri di segmentazione della post-elaborazione (Figura 8B).
   5. Accettare i parametri facendo clic su Ok.
      NOTA: la segmentazione potrebbe richiedere un po' di tempo, a seconda della complessità del modello, delle dimensioni dell'immagine e delle specifiche del computer. In particolare, la versione 4 di Cellpose può essere molto lenta.
   6. Se ti viene chiesto di attivare la segmentazione automatica, seleziona No.
   7. Verificare che la segmentazione funzioni correttamente.
   8. Ripetere il passaggio 5.7.1 per riaprire i parametri di segmentazione.
   9. Se i risultati della segmentazione sono quelli previsti, premere Salva tutti i parametri nel file della ricetta. In caso contrario, modificare i parametri di segmentazione e ripetere i passaggi da 5.7.4 a 5.7.8.
   10. Usa l'input di testo per dare il nome test alla ricetta di segmentazione.
   11. Fare clic su OK per accettare il nome.
   12. Premere Ok per terminare il salvataggio del flusso di lavoro.
   13. Chiudere la schermata di selezione dei parametri.
8. Chiusura della finestra GUI
   1. Chiudere la finestra della GUI.
   2. Premere No per non salvare prima della chiusura.

6. Segmentazione e tracciabilità (elaborazione batch)

1. Fare clic su Avvia modulo di segmentazione... nella finestra principale (Figura 1A, modulo "Segmento e traccia").
   1. Selezionare i dati di esempio. Utilizzare il selettore di cartelle di Cell-ACDC per scegliere la cartella contenente i dati, quindi premere Seleziona cartella per confermare la selezione.
2. Selezionare i parametri per l'elaborazione batch.
   1. Selezionare il canale phase_contr_preprocessed come canale per la segmentazione. Premere Ok per confermare la selezione.
      NOTA: Alcuni modelli utilizzano un canale aggiuntivo come ingresso. Questo canale può essere selezionato in seguito quando si impostano altri parametri di segmentazione.
   2. Confermare le proprietà dell'immagine facendo clic su Ok.
3. Configurare le impostazioni del modello di segmentazione.
   1. Scegli YeaZ_v2 come modello da utilizzare per la segmentazione, quindi conferma la selezione facendo clic su Ok.
   2. Fare clic sul pulsante Carica ricetta salvata... per caricare la ricetta salvata in precedenza.
   3. Selezionare segmentation_recipe_test.ini dall'elenco, quindi confermare la selezione facendo clic su Ok.
   4. Chiudere il messaggio di caricamento riuscito premendo Ok.
   5. Confermare i parametri selezionando Ok.
4. Conferma le altre impostazioni di segmentazione.
   1. Premere Ok per accettare il nome predefinito per il file di segmentazione.
   2. Seleziona No per confermare che l'intera immagine deve essere segmentata.
   3. Selezionare Ok per impostare il fotogramma di arresto come fotogramma finale del timelapse.
5. Imposta le impostazioni di tracciamento. Selezionare YeaZ come metodo di tracciamento da utilizzare, quindi confermare la selezione premendo Ok.
6. Esegui la routine di segmentazione e tracciamento.
   1. Fare clic su Esegui ora per eseguire la pipeline di segmentazione e tracciamento.
      NOTA: questa operazione può richiedere diverse ore in base alle dimensioni dell'immagine, alla complessità del modello e alle specifiche del computer. Nelle esecuzioni dei test, la segmentazione dei dati di test con YeaZ_v2 ha richiesto circa 2 minuti su un dispositivo senza GPU.
   2. Fare clic su Ok per completare la segmentazione.

7. Correzione degli errori di segmentazione e tracciamento

NOTA: In generale, le celle mancanti nel fotogramma corrente rispetto al precedente sono indicate da un contorno e da un ID gialli. Le celle appena rilevate vengono visualizzate con un ID rosso e un contorno spesso. Le celle che sono state accettate come perse vengono mostrate con un contorno e un ID verdi.

1. Fare clic su Avvia GUI... nella finestra principale (Figura 1A, modulo "Visualizza e correggi").
2. Caricare i dati di esempio.
   1. Fare clic sull'icona della cartella nella barra degli strumenti della nuova finestra.
   2. Selezionare la cartella contenente i dati, quindi premere Seleziona cartella per confermare la selezione.
3. Selezionare un canale per la visualizzazione. Utilizza il menu a discesa per selezionare il canale phase_contr_preprocessed, quindi seleziona Ok per confermare.
4. Seleziona il nome della maschera di segmentazione. Selezionare Carica selezionato per caricare il file di segmentazione creato nel passaggio precedente.
5. Termina il processo di caricamento dei dati.
   1. Confermare le proprietà dell'immagine facendo clic su Ok per le posizioni caricate.
   2. Selezionare No per impedire il caricamento di ulteriori dati di fluorescenza.
6. Utilizzare il selettore di modalità (Figura 6, "Selettore di modalità") per selezionare la modalità Segmentazione e Inseguimento .
   NOTA: Utilizzare le caselle di controllo nella parte inferiore della GUI per modificare le annotazioni visualizzate. Le immagini sinistra e destra possono visualizzare annotazioni diverse.
7. Seleziona un tracker in tempo reale. Nella barra dei menu (Figura 6, "Barra dei menu"), accedere a Tracciamento > Selezionare l'algoritmo di tracciamento in tempo reale e selezionare il tracker in tempo reale desiderato. Usa Cell-ACDC o Cell-ACDC 2 passaggi per il lievito in gemmazione o la divisione simmetrica Cell-ACDC per altri organismi.
8. Correggere la segmentazione e il tracciamento.
   1. Usa i tasti freccia sinistra e destra per navigare tra i fotogrammi.
   2. Passa al fotogramma 10.
   3. Premere il tasto S per attivare lo strumento di separazione manuale delle gemme.
   4. Utilizzare il pulsante destro del mouse per dividere automaticamente la maschera di segmentazione della cella 1.
   5. Passare al fotogramma 14.
   6. Premere il tasto B per attivare la spazzola.
   7. Disegna la maschera di segmentazione mancante per l'auricolare usando il tasto sinistro del mouse.
   8. Esamina i fotogrammi successivi correggendo gli errori di segmentazione e tracciamento. Utilizzare gli strumenti disponibili (Figura 6, "Barra degli strumenti di modifica"). Correggere almeno fino al fotogramma 42.
      NOTA: la maggior parte degli strumenti dispone di un suggerimento che ne spiega la funzionalità. Passare il puntatore del mouse su uno strumento per visualizzare la descrizione comando.

8. Annotazioni del ciclo cellulare

NOTA: Passare a questo passaggio solo dopo aver terminato le correzioni di segmentazione e tracciamento per tutti i fotogrammi di interesse. Utilizzare la modalità di annotazione corretta a seconda del tipo di divisione cellulare (simmetrica, ad esempio, cellule di mammifero, o asimmetrica, ad esempio, lievito in gemmazione). Per i dati di esempio, fare riferimento a "Celle a divisione asimmetrica", passaggio 8.1. Il passaggio 8.2 descrive il flusso di lavoro generale per le celle di divisione simmetriche.

1. Celle che si dividono asimmetricamente
   NOTA: Per organismi come il lievito in erba, le gemme possono essere assegnate alle madri. Entrambi gli oggetti devono essere presenti nella stessa cornice. Per impostazione predefinita, viene visualizzata la fase del ciclo cellulare prevista in base alle annotazioni per il lievito in gemmazione. Lo stadio del ciclo cellulare delle gemme è visualizzato in rosso, mentre quello di tutti gli altri oggetti è visualizzato in bianco. Le madri sono collegate ai loro boccioli con una linea gialla tratteggiata.
   1. Attivare l'analisi del ciclo cellulare utilizzando il selettore di modalità (Figura 6, "Selettore di modalità").
   2. Selezionare Sì, passare al fotogramma 1 quando richiesto.
   3. Usa i tasti freccia sinistra e destra per navigare tra i fotogrammi.
   4. Passare al fotogramma 41. Fare clic su OK per accettare l'inizializzazione della tabella di annotazione ciclo cella quando richiesto.
   5. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla cella 1 o sulla sua gemma per separare la connessione e annotare l'evento di divisione cellulare.
   6. Continuate fino a quando tutti i fotogrammi rilevanti non sono stati visualizzati. Correggere gli errori nell'assegnazione automatica delle gemme madri utilizzando gli strumenti disponibili (Figura 6, "Modifica barra degli strumenti").
   7. Strumenti disponibili
      NOTA: Questi strumenti, ad eccezione dello strumento Spezza/Riassocia Associazione Germoglio Madre , possono essere attivati utilizzando una scorciatoia personalizzabile o premendo i pulsanti associati nella barra degli strumenti.
      1. Assegna bocciolo alla madre (A): Attiva lo strumento Assegna bocciolo alla madre . Tieni premuto il tasto destro del mouse sull'auricolare. Trascinare sulla cella madre corrispondente e rilasciare il pulsante del mouse.
         NOTA: Utilizzare questo strumento quando l'assegnazione automatica dei boccioli alle madri non è corretta.
      2. Annota cronologia sconosciuta (U): attiva lo strumento Annota cronologia sconosciuta . Usa il tasto destro del mouse per fare clic sulla cella che dovrebbe essere annotata come avente una storia sconosciuta.
         NOTA: utilizzare questo strumento per annotare manualmente le celle con una cronologia sconosciuta, aiutando a correggere le ambiguità di derivazione in cui l'inferenza automatica è insufficiente.
      3. Reinizializza l'annotazione del ciclo cellulare
         NOTA: Utilizzare questa opzione per eseguire nuovamente l'algoritmo di annotazione del ciclo di celle dal fotogramma corrente in poi. Ciò garantisce la coerenza con le recenti correzioni o aggiornamenti apportati ai dati di segmentazione/tracciamento.
      4. Interrompi/riassocia l'associazione madre-gemma: assicurati che non sia selezionato nessun altro strumento. Fare clic con il pulsante destro del mouse su una coppia madre-gemma esistente per interrompere l'associazione oppure fare nuovamente clic con il pulsante destro del mouse per ristabilire la connessione.
2. Celle divisorie simmetriche
   NOTA: questa funzione è in fase di beta testing e verrà rilasciata ufficialmente a breve. È possibile assegnare due o più cellule figlie a una singola cellula madre. Le potenziali cellule madri sono quelle presenti nel fotogramma precedente ma assenti in quello attuale, mentre le potenziali cellule figlie sono cellule che appaiono di recente nel fotogramma corrente.
   1. Attivare la divisione normale: albero di derivazione utilizzando il selettore di modalità (Figura 6, "Selettore di modalità").
   2. Selezionare Sì, passare al fotogramma 1 quando richiesto.
   3. Usa i tasti freccia sinistra e destra per navigare tra i fotogrammi.
   4. Correggere gli errori nelle assegnazioni automatiche madre-figlia utilizzando gli strumenti disponibili (Figura 6, "Modifica barra degli strumenti").
   5. Propagare le modifiche quando richiesto facendo clic su Propaga.
   6. Strumenti disponibili
      NOTA: Questi strumenti possono essere attivati utilizzando la scorciatoia o i rispettivi pulsanti nella barra degli strumenti.
      1. Trova la madre per un nuovo ID cella (F): attiva lo strumento Trova madre per un nuovo ID cella . Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla nuova cella per scorrere le cellule madri candidate. Maiusc + clic destro per scorrere all'indietro i candidati.
         NOTA: Utilizzare questo strumento per assegnare o modificare la madre di una cellula figlia.
      2. Imposta madre sconosciuta (U): Attiva lo strumento Imposta madre sconosciuta . Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla cella la cui madre è sconosciuta.
         NOTA: Utilizzare questo strumento per designare manualmente la madre di una cellula come sconosciuta.

9. Salvataggio dei dati

1. Passare a File > Salva nella barra multifunzione in alto.
2. Fare clic su Imposta misure... per selezionare le misure desiderate.
3. Seleziona la casella di controllo accanto a mMetriche citrine o qualsiasi altra misurazione desiderata.
4. Fare clic su Ok per confermare.
5. Fare clic su Sì per salvare le misurazioni.
6. Fare clic su Ok per confermare il fotogramma fino al quale devono essere salvate le misurazioni.
7. Fare clic su No quando viene richiesto di specificare la concatenazione dei dati.

10. Creare la struttura dati

NOTA: questa sezione illustra la preparazione dei dati al microscopio per la segmentazione e il tracciamento. Questa operazione può essere ignorata quando si utilizzano i dati dimostrativi, che vengono scaricati in "Download dei dati di esempio". La struttura dei dati che verrà generata è illustrata nella Figura 9.

1. Inserire i file di microscopia in una cartella vuota.
   NOTA: Sono supportati i formati di microscopia come .czi (Zeiss), .lif (Leica) e .nd2 (Nikon), nonché i singoli file .tif e .png.
2. Fare clic sul modulo 0. Crea struttura dati... nella finestra principale (Figura 1A, modulo "Crea struttura dati").
3. Seleziona BioIO o Fiji Macro.
   1. Se si utilizza Windows , fare clic su Usa BioIO, mentre per gli utenti MacOS e Linux , selezionare Usa macro Fiji.
      NOTA: Di seguito, si presume che venga utilizzato Windows.
   2. Se viene richiesto di installare BioIO, premere Ok per installare.
   3. Selezionare la disposizione dei file di microscopia. Selezionare l'opzione che corrisponde alla disposizione dei file di microscopia utilizzando il menu a discesa, quindi premere Ok per confermare.
4. Selezionare le cartelle di origine e di destinazione e la strategia di caricamento dei dati
   1. Premere Fine per confermare che i file si trovano in una cartella altrimenti vuota.
   2. Utilizzare il selettore di cartelle di Cell-ACDC per scegliere la cartella contenente i file.
   3. Premere Seleziona cartella per scegliere una cartella.
   4. Premere nuovamente Seleziona cartella per scegliere la stessa cartella della cartella di destinazione.
      NOTA: Il file di microscopia non elaborato non viene eliminato.
   5. Seleziona Sì, carica l'intera posizione in una volta.
5. Se viene richiesto di installare un sottopacchetto BioIO, premere OK per installare.
6. Impostare i metadati per il file di input.
   1. Correggere i metadati.
      NOTA: Ricontrolla l'"Ordine delle dimensioni" facendo clic sull'icona a forma di occhietto accanto ai campi del nome del canale . Vengono evidenziati gli altri metadati che non è stato possibile caricare dal file raw.
   2. Premere Ok per confermare i metadati.
   3. Premere Sì per confermare l'ordine delle dimensioni.
7. Attendi il completamento del processo.
8. Premere Sì per chiudere la finestra al termine del processo.
   NOTA: La creazione della struttura dei dati può richiedere ore a seconda delle dimensioni dei dati.

11. Utilità di pre-elaborazione dei dati

NOTA: Nella finestra principale sono disponibili diverse opzioni per l'elaborazione delle immagini prima di passare all'analisi. Per accedere a questi strumenti, accedere al menu a discesa Utilità nella barra dei menu della finestra principale (Figura 1B, "Utilità"), passare il mouse su Pre-elaborazione delle immagini, quindi selezionare l'opzione da utilizzare. Due esempi sono:

1. Combina canali: utilizzare questa opzione per unire due o più canali immagine.
   NOTA: Ad esempio, è possibile calcolare la media di due canali di fluorescenza.
2. Ridimensiona immagini: utilizzare questa opzione per ridurre le dimensioni di set di dati di immagini molto grandi.
   NOTA: Ciò può accelerare notevolmente i tempi di elaborazione e, in molti casi, ha un impatto minimo o nullo sulla qualità della segmentazione.

12. Risoluzione dei problemi

1. Se Cell-ACDC si arresta in modo anomalo, creare una segnalazione di bug sulla pagina GitHub di Cell-ACDC passando alla scheda Problemi e facendo clic sul pulsante verde Nuovo problema . Segui il modello fornito per includere tutti i dettagli pertinenti necessari per diagnosticare e risolvere il problema. In alternativa, sentiti libero di cercare aiuto nel forum image.sc utilizzando il tag #cell-acdc o contatta uno degli autori corrispondenti. In molti casi, soprattutto dopo l'installazione di un pacchetto, il semplice riavvio del software può risolvere il problema.
2. Se Cell-ACDC si blocca o non risponde, controlla la console per gli aggiornamenti sullo stato di avanzamento. I lunghi tempi di segmentazione, soprattutto quando si utilizzano modelli ad alta intensità di calcolo, come Cellpose versione 4, o l'elaborazione di set di dati di grandi dimensioni, sono normali. Se Cell-ACDC continua a non rispondere, fare riferimento al passaggio 12.1 per ulteriori istruzioni.
3. Se la segmentazione automatica include erroneamente lo sfondo, verificare se un passaggio di pre-elaborazione potrebbe aver smussato eccessivamente lo sfondo. Molti modelli di segmentazione vengono addestrati su immagini non elaborate (non pre-elaborate) e possono avere prestazioni scarse quando lo sfondo non ha una texture sufficiente.

Results

Quantificazione del volume nucleare in sferoidi tumorali in 3D

La microscopia 3D automatizzata (z-stacks) consente agli scienziati di visualizzare sistemi multicellulari complessi come gli organoidi. Per quantificare le proprietà morfologiche e del segnale di fluorescenza a livello di singola cellula, è spesso necessaria la segmentazione cellulare in 3D. L'esempio seguente dimostra come Cell-ACDC possa segmentare i nuclei in organoidi contenenti migliaia di cellule dal canale di colorazione nucleare e quantificarne il volume (dati da ^Ref.9). La segmentazione è stata eseguita utilizzando un modello Cellpose personalizzato che è stato addestrato e pubblicato in ^Ref.9. Il modello Cellpose addestrato può essere utilizzato direttamente in Cell-ACDC fornendo il percorso del file dei pesi nella GUI quando si selezionano i parametri del modello per Cellpose v2. La segmentazione è stata eseguita utilizzando il secondo modulo di Cell-ACDC per elaborare in batch tutte le immagini (Figura 1A, modulo "Segmento e traccia"). Successivamente, il risultato è stato visualizzato nella GUI del terzo modulo (Figura 1A, modulo "Visualizza e correggi"). Questo modulo è stato ottimizzato per visualizzare migliaia di singoli oggetti con più opzioni di annotazione (ad esempio, contorni, maschere di segmentazione sovrapposte o ID di testo). Dopo che le misurazioni delle maschere 3D sono state calcolate, tutte le misurazioni disponibili sono state documentate direttamente nell'interfaccia grafica. Sono accessibili accedendo alla barra dei menu in alto (Figura 6, "Barra dei menu"), selezionando il menu Misure , quindi Imposta misure.... La finestra di dialogo pop-up consente agli utenti di ottenere informazioni specifiche sulla misurazione dai pulsanti informativi e di selezionare le misurazioni da salvare. Per i risultati rappresentativi nella Figura 10, è stato utilizzato "cell_vol_fl_3D", che è il volume di ciascun oggetto calcolato moltiplicando i voxel totali nell'oggetto per la dimensione del pixel al quadrato e la profondità del voxel. Queste proprietà vengono estratte automaticamente dal file raw al microscopio o fornite dall'utente. Il calcolo delle misurazioni da questa GUI richiede il caricamento delle immagini grezze. Pertanto, per semplificare il processo e abilitare l'elaborazione batch, le misurazioni possono essere calcolate anche dal menu Utilità (Figura 1B, "Utilità"), accedendo al sottomenu Misure e quindi Calcola misure per uno o più esperimenti. Infine, la distribuzione del volume nucleare è stata tracciata come risultato rappresentativo (Figura 10). Questa analisi rivela una frazione significativa di piccoli nuclei, probabilmente a causa di artefatti di segmentazione. Potrebbero essere facilmente rimossi filtrando piccoli oggetti dalla maschera di segmentazione. Allo stesso tempo, i nuclei molto grandi potrebbero essere dovuti a nuclei fusi durante la segmentazione. Si consiglia sempre di tracciare la distribuzione del volume degli oggetti (ad esempio, singole cellule) per identificare gli artefatti ed estrarre ulteriori informazioni biologiche sulle dimensioni delle cellule.

Quantificazione dei dati di microscopia time-lapse

Con la microscopia time-lapse, la dinamica cellulare può essere osservata direttamente a livello di singola cellula. Oltre alla segmentazione cellulare, l'estrazione della dinamica temporale richiede un'analisi aggiuntiva, tra cui il tracciamento delle cellule e l'annotazione del pedigree cellulare. A causa dell'interdipendenza di queste fasi di analisi, gli errori introdotti all'inizio della pipeline possono propagarsi alle fasi successive. Di conseguenza, sono necessarie una visualizzazione e una correzione continue degli errori di segmentazione, tracciamento e annotazione. Quanto segue dimostra che Cell-ACDC è adatto per affrontare questi compiti. Sono stati selezionati due dataset di due diversi organismi modello: 1) lievito in gemmazione (ceppo DCY001-1 da ^Ref.35, dove le due proteine istoniche H2B, Htb1 e Htb2, sono marcate con mCitrine), e 2) cellule staminali embrionali di topo (mESC, dati da ^Ref.22).

Questi due set di dati evidenziano due modalità di annotazione disponibili in Cell-ACDC: divisione cellulare asimmetrica e simmetrica (cioè citocinesi simmetrica o "normale"). Poiché la modalità di divisione differisce, i due organismi richiedono un diverso quadro di tracciamento e annotazione.

Nella divisione asimmetrica, la cellula madre forma una gemma che cresce e alla fine si separa per diventare una cellula figlia. Dopo la divisione, la cellula madre mantiene il suo ID di cella originale e il suo numero di generazione aumenta di uno, mentre alla cella figlia viene assegnato un nuovo ID di cella e il suo numero di generazione è impostato su uno. La fase di gemmazione corrisponde alle fasi S/G2/M del ciclo cellulare ed è annotata come tale in Cell-ACDC. Queste scelte di annotazione aiutano a rispondere alle tipiche domande biologiche relative al ciclo cellulare nel lievito in gemmazione.

Nel caso della divisione "simmetrica" (ad esempio, cellule di mammifero), la cellula madre si divide in due cellule figlie. La cellula madre, cioè il suo ID, scompare al momento della divisione e le due cellule figlie ricevono nuovi ID. Inoltre, il numero di generazione delle cellule figlie è aumentato di uno rispetto alla cellula madre. Cell-ACDC tiene traccia anche dell'ID padre, dell'ID radice (la cella antenata originale all'inizio di una derivazione) e dell'ID sorella.

Per entrambe le modalità di annotazione, è stato sviluppato un framework innovativo per correggere gli errori di annotazione, in cui la correzione viene automaticamente propagata a tutti i punti temporali rilevanti passati e futuri. La visualizzazione, l'annotazione e la correzione sono state eseguite nella GUI del terzo modulo (Figura 1A, modulo "Visualizza e correggi" e Figura 6). Per segmentare e tracciare le cellule nel set di dati 1, il modello YeaZ_v2²⁶ è stato applicato al canale di contrasto di fase, mentre per il canale nucleare (istonico) è stato utilizzato il modello StarDist²⁵ . Quindi, utilizzando l'utility Tracking and lineage > Traccia e/o conta gli oggetti sub-cellulari (Figura 1B, Barra dei menu Utility), Cell-ACDC ha assegnato a ciascun nucleo l'ID della cella corrispondente, garantendo la coerenza tra le tabelle generate dalle maschere delle celle e dei nuclei.

Per il set di dati 2 è stato utilizzato il modello di segmentazione DeepSea²² . Tutti e tre i modelli sono già disponibili in Cell-ACDC, dimostrando il vantaggio di integrare diversi modelli di segmentazione nel software.

Una volta corretti gli errori di segmentazione e tracciamento, sono stati annotati i pedigree cellulari, sono state calcolate le caratteristiche numeriche ed è stata eseguita l'analisi a valle. Per il set di dati 1, il TaYFP_amount_autoBkgr della colonna e il numero di nuclei segmentati (Figura 11A) sono stati tracciati in funzione del tempo. "TaYFP" è il nome del canale nucleare. "amount_autoBkgr" è un proxy per la quantità totale di proteine cellulari estratte dalle immagini di epifluorescenza³⁶. Viene calcolato come la differenza tra l'intensità media della fluorescenza in ciascuna maschera cellulare e la mediana dello sfondo, moltiplicata per l'area della cella (in pixel). In questo caso, la mediana dello sfondo viene calcolata da tutti i pixel che non sono segmentati come celle. Come previsto, la quantità di H2B inizia ad aumentare all'emergenza delle gemme (Figura 11A-ii) e raggiunge un valore costante prima della divisione nucleare (Figura 11A-iii). Questo è un importante controllo di qualità nell'omeostasi delle proteine istoniche, poiché si prevede che la quantità di proteine istoniche sia dipendente dal ciclo cellulare. Inoltre, il tracciamento del numero di nuclei nel tempo conferma che le quantità di proteine istoniche raggiungono il massimo all'incirca intorno alla divisione nucleare.

Per il set di dati 2, è stata tracciata l'area cellulare nel tempo per una cellula selezionata in fase di divisione cellulare. Come previsto, l'area della cella aumenta fino a raggiungere un valore massimo (Figura 11B-i). Quindi, diminuisce fino alla divisione cellulare (Figura 11B-ii) quando la cellula si contrae. Infine, il ciclo ricomincia per le due celle figlie. Questa è un'altra analisi raccomandata poiché il controllo dei cambiamenti delle dimensioni cellulari nel corso del ciclo cellulare è essenziale per confermare che le cellule stiano crescendo e dividendosi come previsto (o meno nel caso di mutanti specifici).

Figura 1: Moduli Cell-ACDC. (A) Panoramica dei 4 moduli principali che possono essere lanciati dal lanciatore principale Cell-ACDC. Dopo aver segmentato, tracciato e annotato i dati al microscopio, le caratteristiche numeriche possono essere calcolate dal terzo modulo ("Visualizza e correggi") o dal menu (B) Utilità nella barra dei menu in alto. Le "Utility" sono le routine che possono essere eseguite automaticamente su più set di dati senza l'input dell'utente. Oltre al calcolo delle misurazioni, altre utilità includono la concatenazione di più tabelle di output in un'unica tabella, il tracciamento di oggetti subcellulari e la pre-elaborazione delle immagini. Cell-ACDC supporta dati 2D, 3D (z-stack o time-lapse) e 4D (z-stack nel tempo), con un numero qualsiasi di canali aggiuntivi. La tabella di output con le caratteristiche numeriche può quindi essere utilizzata per l'analisi a valle e la scoperta biologica (Figura 10 e Figura 11). A questo scopo, sono disponibili i notebook Jupyter sulla pagina GitHub di Cell-ACDC, che includono esempi di grafici che possono essere ottenuti dalla tabella di output. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Diagramma di flusso decisionale cellula-ACDC. Un diagramma di flusso che descrive il modulo da utilizzare a seconda del tipo di set di dati e dei requisiti di analisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Scaricare i dati di esempio. (A) Aprire la Guida di benvenuto. (B) Scaricare i dati di esempio necessari per replicare il protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Caricare i dati per la preparazione dei dati. (A) Caricare i dati nell'interfaccia grafica di preparazione dei dati. (B) Selezionare il canale da caricare. (C) Modifica e conferma i metadati dell'immagine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Eseguire il processo di preparazione dei dati. (A) Avviare il processo. (B) ROI di posizione (per il ritaglio) e ROI di sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Terza GUI del modulo per visualizzare e correggere i risultati. Screenshot della GUI del terzo modulo ("Visualizza e correggi" nella Figura 1A) con gli elementi evidenziati. Si noti che la maggior parte dei pulsanti sulle barre degli strumenti ha un suggerimento (accessibile passando il cursore del mouse sul pulsante) che spiega come utilizzare quella specifica funzione. Il selettore di modalità può essere utilizzato per passare tra 5 modalità: "Visualizzatore", "Segmentazione e tracciamento", "Analisi del ciclo cellulare" (per celle a divisione asimmetrica), "Divisione normale: albero di lignaggio" (per celle a divisione simmetrica, ad esempio cellule di mammifero) e "Annotazioni personalizzate". Si noti che una barra degli strumenti o una barra dei menu è spesso presente nelle altre GUI (ad esempio, il modulo "Pre-elaborazione dati", Figura 1). La barra degli strumenti Modifica contiene tutte le funzioni che possono essere utilizzate per modificare e correggere gli errori di segmentazione e tracciamento (ad esempio, pennello, gomma, ID di modifica, ecc.). L'immagine caricata viene visualizzata in una vista a due pannelli, utile quando sono necessarie diverse opzioni di annotazione (ad esempio, le informazioni sul ciclo cellulare sull'immagine a sinistra e gli ID sull'immagine a destra). L'immagine corretta può anche essere disattivata (fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e deselezionare Mostra immagine speculare). Ogni pannello immagine include un cursore LUT sul lato per regolare rapidamente i livelli di intensità. Facendo clic con il pulsante destro del mouse sul controllo LUT, l'utente può selezionare diverse mappe di colori per le immagini di intensità. Inoltre, sul lato destro, c'è un selettore LUT per il colore delle etichette di segmentazione da sovrapporre alle immagini di intensità (opzione di annotazione chiamata Segm. maschere). Sul lato sinistro delle opzioni di annotazione per l'immagine a sinistra, ci sono interruttori aggiuntivi per controllare alcune impostazioni, come il salvataggio automatico, la dimensione del carattere, ecc. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Visualizzazione della pre-elaborazione nella GUI principale. (A) Apertura della finestra di dialogo di pre-elaborazione. (B) Dialogo di pre-elaborazione con i parametri utilizzati nel protocollo inizializzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Visualizzare l'output della segmentazione nella GUI principale. (A) Selezionare un modello di segmentazione. (B) Impostare i parametri di segmentazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Struttura delle cartelle richiesta da Cell-ACDC. Per lavorare con Cell-ACDC, i dati devono essere disposti in una struttura di cartelle specifica. Sebbene Cell-ACDC fornisca un modulo per generare automaticamente questa struttura, è importante capire come dovrebbe apparire questa struttura. Innanzitutto, tutti i file devono essere all'interno di una cartella chiamata Immagini. Successivamente, devono iniziare tutti con lo stesso nome, il cosiddetto "basename_". Il set minimo di file richiesti è un file TIFF a canale singolo (2D, 3D z-stack o 3D+time) e un file CSV che termina con "_metadata.csv". Questo file deve essere una tabella con due colonne, la prima colonna denominata Descrizione e la seconda colonna denominata valori, e deve contenere almeno le voci per SizeT e SizeZ per il numero di frame e z-slice, rispettivamente. Se un file immagine non contiene z-slice, SizeZ deve essere impostato su 1. Lo stesso vale per le immagini senza time-lapse, dove SizeT deve essere 1. Essendo un file CSV, una voce è una singola riga di Description,value, separata da una virgola, ad esempio SizeZ,1. Per più canali, è necessario generare un file TIFF per canale. La cartella Immagini deve poi essere inserita all'interno di una cartella chiamata "Position_1". Sono consentite più posizioni e devono essere denominate con un numero progressivo. Quando si caricano i dati in uno qualsiasi dei moduli Cell-ACDC, l'utente può selezionare una cartella Position specifica o l'intera cartella dell'esperimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Quantificazione 3D di organoidi tumorali. Screenshot di un organoide tumorale rappresentativo (dati da⁹) caricato nella GUI del terzo modulo di Cell-ACDC (a sinistra), esempi di z-slice con contorni rossi che evidenziano le maschere di segmentazione (al centro) e istogramma della distribuzione del volume cellulare calcolato dalle maschere di segmentazione 3D (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: Quantificazione dei dati di microscopia time-lapse. (A) Screenshot dei dati di microscopia time-lapse di cellule di lievito in gemmazione caricate nella GUI del terzo modulo di Cell-ACDC (a sinistra) e quantificazione della quantità di proteina H2B istone nel tempo in un ciclo cellulare rappresentativo (a destra). Le immagini ingrandite mostrano la cellula di esempio e la sua gemma (frecce bianche) all'inizio del ciclo cellulare (i), all'emergenza della gemma (ii) e alla divisione nucleare (iii). I dati sono tratti da Chatzitheodoridou et ^al.35 (B) Screenshot dei dati di microscopia time-lapse di cellule staminali embrionali di topo caricate nel terzo modulo GUI di Cell-ACDC (a sinistra) e area cellulare (μm²) tracciate in funzione del tempo di una cellula rappresentativa in fase di divisione cellulare. Le immagini ingrandite mostrano la cellula di esempio e le sue figlie alla massima area cellulare prima della divisione (i), la divisione in due cellule figlie (ii) e l'ultimo fotogramma analizzato dopo la divisione (iii). I dati sono tratti da Zargari et ^al.22,33. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

L'analisi di dati di microscopia multidimensionale richiede spesso l'uso di modelli all'avanguardia basati sull'intelligenza artificiale. Tuttavia, questi strumenti vengono sviluppati rapidamente e presentano una significativa barriera all'ingresso per l'adozione. Inoltre, i biologi hanno spesso bisogno della visualizzazione del risultato per un'efficace correzione degli errori. Qui, viene dimostrato come gli scienziati possono utilizzare Cell-ACDC per affrontare queste sfide.

Un passaggio critico del protocollo presentato è la selezione del modello di segmentazione ottimale. Cell-ACDC include un'interfaccia grafica che consente la selezione visiva (Figura 1A, modulo "Visualizza e correggi"). Vengono inoltre forniti strumenti per la preparazione dei dati e l'elaborazione batch di più set di dati (Figura 1A, Creazione della struttura dei dati, Pre-elaborazione dei dati, Moduli Segment e Track e Utility). Gli utenti sono incoraggiati a segnalare problemi e fornire feedback sul forum image.sc (utilizzando il tag #cell-acdc) o aprendo un problema sulla pagina GitHub di Cell-ACDC.

Mentre Cell-ACDC è già stato utilizzato su dati relativamente grandi, come con sferoidi in immagini con migliaia di nuclei⁹, o dati time-lapse di lievito in erba con centinaia di cellule per fotogramma, il programma deve caricare tutti i dati a canale singolo nella RAM per funzionare correttamente. Si consiglia di utilizzare una quantità di memoria disponibile pari a circa tre volte la dimensione del file immagine per garantire prestazioni stabili. Al momento, i set di dati che superano la memoria di sistema disponibile non possono essere elaborati, ma il supporto per il caricamento out-of-core (lazy) è previsto attraverso l'integrazione di OME-Zarr³⁷.

Attualmente, uno dei principali limiti di Cell-ACDC è il supporto parziale per i set di dati 3D+tempo, poiché la maggior parte degli strumenti sono stati sviluppati sia per dati 3D z-stack che 2D+tempo. Pertanto, le versioni future di Cell-ACDC estenderanno le sue capacità con il pieno supporto per i dati 3D+time. Inoltre, stiamo lavorando sull'estensione del quadro di annotazione del pedigree cellulare per le cellule che si dividono "simmetricamente" (ad esempio, le cellule dei mammiferi), che sono quelle cellule in cui la cellula madre si divide in due cellule figlie (al contrario del lievito in gemmazione, in cui la cellula madre, una volta per ciclo cellulare, dà origine a una singola cellula figlia attraverso la gemmazione). Infine, a partire da ora, Cell-ACDC è limitato ai dati i cui dati a canale singolo si adattano interamente alla RAM. Pertanto, prevediamo di implementare il caricamento lento come menzionato in precedenza.

Dalla sua uscita, Cell-ACDC è stato costantemente migliorato, ad esempio, aggiungendo nuovi modelli di segmentazione e tracciamento, nuovi framework di annotazione (ad esempio, per le cellule di mammifero, attualmente in fase di beta-testing) e vari miglioramenti delle prestazioni. Grazie a questi sviluppi, gli scienziati potrebbero impiegare Cell-ACDC per accelerare la ricerca e consentire la scoperta scientifica 6,9,16,35,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48 ^,49. Ciò che rende unico questo framework software rispetto ai metodi esistenti 14,27,50,51 è la sua capacità di sfruttare e integrare i modelli esistenti, beneficiando quindi degli sviluppi della comunità. Il continuo sviluppo di Cell-ACDC viene mantenuto attivamente per affermarlo come framework di riferimento per l'analisi dei dati di microscopia multidimensionale.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEONATO	Julian Pietsch	10.7554/eLife.79812	Software di segmentazione e tracciamento, opzionali, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
Tracciatore bayesiano	Kristina Ulicna	10.3389/fcomp.2021.734559	Il software di tracciamento, opzionale, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
Cell-ACDC	Francesco Padovani	10.1186/s12915-022-01372-6	Software
Nuclei della linea germinale della posizione cellulare	Cristina Piñ eiro Ló pez / Ana Rita Rodrigues Neves / Ivana avka	10.17912/MICROPUB. BIOLOGY.001062	Il software di segmentazione, opzionale, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
Cellpose versione 2	Carsen Stringer	10.1038/s41592-020-01018-x	Il software di segmentazione, opzionale, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
Cellpose versione 3	Carsen Stringer	10.1038/s41592-025-02595-5	Il software di segmentazione, opzionale, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
Cellpose versione 4 (Cellpose-SAM)	Marius  Pachitariu	10.1101/2025.04.28.651001	Il software di segmentazione, opzionale, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
Computer	-	-	Vedi le specifiche consigliate di seguito
Computer - CPU	Qualunque	-	Minimo raccomandato 4 Core, 2,5Ghz & nbsp;
Computer - GPU	Nvidia (preferibile)	-	(Opzionale) Minimo raccomandato 8GB di VRAM
Computer - Spazio su disco rigido	Qualunque	-	4GB + 3 x dimensione del file microscopico
Computer - Sistema operativo	Microsoft, Apple, altri	-	Sono supportati Windows, MacOS e Linux
Computer - RAM	Qualunque	-	3 x file di singola posizione, minimo 16GB
DeepSea	Abolfazl  Zargari	10.1016/j.crmeth.2023.100500	Software di segmentazione e tracciamento, opzionali, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
DeLTA & nbsp;	Jean-Baptiste Lugagne / Owen M. O' Connor	10.1101/720615 / 10.1371/journal.pcbi.1009797	Software di segmentazione e tracciamento, opzionali, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
InstanSeg	Thibaut Goldsborough	10.48550/arXiv.2408.15954	Il software di segmentazione, opzionale, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
Miniforge	Conda-Forge	-	Link per scaricare l'installatore dal sito di Miniforge: https://conda-forge.org/download/
Omnipose	Kevin Cutler	10.1038/s41592-022-01639-4	Il software di segmentazione, opzionale, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
pomBseen	Makoto Ohira	10.1371/journal.pone.0291391	Il software di segmentazione, opzionale, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
SAM (Modello Segment Anything)	Alexander Kirillov	10.48550/arXiv.2304.02643	Il software di segmentazione, opzionale, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
StarDist	Uwe Schmidt / Martin Weigert	10.1007/978-3-030-00934-2_30 / 10.1109/WACV45572.2020.9093435 / 10.1109/ISBIC56247.2022.9854534	Il software di segmentazione, opzionale, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
TAPIRO	Carl Doersch	10.48550/arXiv.2306.08637	Il software di tracciamento, opzionale, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
Trackastra	Benjamin Gallusser	https://doi.org/10.48550/arXiv.2405.1570	Il software di tracciamento, opzionale, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
Trackpy	Daniel Allan	10.5281/zenodo.1213240	Il software di tracciamento, opzionale, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
YeastMate	David Bunk	10.1093/bioinformatica/btac107	Il software di segmentazione, opzionale, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC
YeaZ	Nicola Dietler	10.1038/s41467-020-19557-4	Software di segmentazione e tracciamento, opzionali, può essere installato automaticamente con Cell-ACDC