Articolo metodologico

Dinamica della locomozione età-dipendente in Caenorhabditis elegans: un'analisi dell'esponente di Lyapunov

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DOI:

10.3791/68955

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23 settembre 2025

 ,  ,  , 
1Physics and Astronomy Department, Vassar College

In questo articolo

Sommario

Questo studio esamina l'effetto dell'età sulla locomozione in C. elegans misurando il più grande esponente di Lyapunov (LLE). Con l'avanzare dell'età, C. elegans mostra un aumento e un conseguente declino del controllo motorio. I risultati mostrano un picco di LLE a cinque giorni, seguito da un calo con l'avanzare dell'età dei vermi.

Abstract

Questo studio indaga l'influenza dell'età sulla mobilità di Caenorhabditis elegans (C. elegans) impiegando la diffrazione ottica dinamica (DOD) per stimare il più grande esponente di Lyapunov (LLE). La LLE, una metrica chiave nei sistemi dinamici, quantifica il tasso di divergenza o convergenza delle traiettorie nello spazio delle fasi, indicando la prevedibilità e il caos nella dinamica del sistema, in questo caso, i comportamenti della locomotiva del verme. La luce laser a 632 nm diffrange il verme che nuota in una colonna d'acqua, formando un modello di diffrazione. Un fotodiodo rileva la luce in un singolo punto all'interno del modello di diffrazione, catturando una serie temporale unidimensionale mentre il verme ondeggia. Questa serie temporale funge da rappresentazione composita dell'intero movimento del verme, incapsulando la sua dinamica di locomozione poiché un punto nel modello di diffrazione è una sovrapposizione di tutti i punti sul verme. La serie temporale viene quindi incorporata in uno spazio delle fasi di dimensione superiore per calcolare il LLE. C. elegans vive in genere per circa 14 giorni, seguendo un modello di aumento e diminuzione del controllo motorio con l'età. Per isolare gli effetti specifici dell'età, i vermi sono stati trasferiti in piastre di agar fresche contenenti E. coli ogni due giorni, assicurandosi che fossero adeguatamente invecchiati (da 3 a 12 giorni). L'analisi di una coorte di 13 C. elegans ha rivelato che la LLE ha raggiunto il picco a cinque giorni dopo la schiusa, a un tasso di 1,34 ± 0,03 1/s. Questo picco indica un punto critico nello sviluppo in cui la locomozione dei vermi mostra la massima complessità e comportamento caotico. I valori di LLE osservati si allineano con l'equazione di Moore, un modello consolidato che descrive i cambiamenti legati all'età nell'attività volontaria, collegando la diminuzione del controllo motorio e dei livelli di attività con l'aumento dell'età in C. elegans.

Introduzione

La locomozione di Caenorhabditis elegans (C. elegans), un verme microscopico, è stata studiata per approfondire la comprensione del cablaggio dei motoneuroni perché questo nematode è neurologicamente semplice, con solo 302 neuroni1. C. elegans è un organismo modello che si mantiene facilmente con una durata di vita di soli 14 giorni2. Solo circa 72 neuroni di 302 in C. elegans sono utilizzati per la locomozione e si trovano in tutto il corpo adulto del nematode1. Il movimento a bassa dimensionalità (cioè da un lato all'altro, in avanti e all'indietro)3 di C. elegans li rende un esemplare facile da cui tracciare le distanze in LLE. Il sistema nervoso dei nematodi è compreso in misura incredibile4.

L'analisi video ha aiutato a quantificare la locomozione di C. elegans misurando quantità come il raggio di curvatura, le frequenze di ondulazione e la lunghezza d'onda5. Queste misurazioni hanno stabilito variabili di controllo che consentono il confronto delle proprietà locomotorie in diversi ambienti e in varie condizioni 6,7. Queste informazioni formano un modello in evoluzione dei circuiti che guidano la locomozione di C. elegans8 e consentono anche la creazione di simulazioni dinamiche virtuali e fisiche dei vermi9.

La diffrazione ottica dinamica (DOD)10 è stata utilizzata anche per quantificare la locomozione di C. elegans. Durante il DOD, la luce laser a bassa intensità si piega attorno al verme vivo, formando un modello di diffrazione in campo lontano noto come modello di diffrazione di Fraunhofer. La distribuzione dell'intensità nel modello vivo cambia man mano che il nematode si muove. Un punto nella diffrazione è una sovrapposizione di tutti i punti sul verme, in modo che l'intensità dipendente dal tempo nel modello di diffrazione formi una serie temporale unidimensionale contenente informazioni sulla dinamica locomotoria11. Ci concentriamo sul più grande esponente di Lyapunov (LLE) dipendente dall'età della locomozione che calcoliamo dalla serie temporale sperimentale unidimensionale. La LLE in diversi stadi dello sviluppo è paragonabile ad altri studi legati all'età, dimostrando che i circuiti neurali si manifestano in modelli locomotori che possono essere misurati utilizzando vari strumenti, come l'analisi video o il DOD5.

Il DOD fornisce una serie temporale sensibile su più scale poiché il modello di interferenza può risolvere la locomozione a una frazione della lunghezza d'onda utilizzata, tenendo conto anche dei cambiamenti su larga scala nella plasticità (forma) della specie. Questa funzione è particolarmente utile quando un sistema è sensibile alle condizioni iniziali, come nei sistemi caotici dove piccoli cambiamenti portano a cambiamenti esponenziali nella traiettoria, noti anche come effetto farfalla12. Per questo motivo, è fondamentale acquisire le serie temporali a una velocità che consenta la registrazione di piccole modifiche, poiché queste modifiche possono comportare cambiamenti significativi man mano che il sistema si evolve. Un fotodiodo (PD) può catturare le serie temporali più velocemente di molte costose fotocamere ad alta velocità. La combinazione della sensibilità spaziale nel modello di diffrazione e di un alto tasso di accumulo di dati può catturare l'essenza di un sistema caotico13,14.

Il LLE descrive la divergenza esponenziale delle traiettorie nello spazio delle fasi. Lo spazio delle fasi contiene tutti i possibili stati di un sistema, descritti dalle loro variabili di stato (o coordinate) e dalle loro derivate (o momenti) associate15. Traiettorie diverse descrivono l'evoluzione del sistema per diverse condizioni iniziali. In un sistema caotico, due traiettorie vicine divergono esponenzialmente nel tempo e tale divergenza è quantificata da un LLE positivo. Nei sistemi fisici, questa divergenza si manifesta come la propagazione dell'incertezza nelle condizioni iniziali del sistema, e anche come l'incapacità di prevedere in modo affidabile lo stato del sistema dopo un certo tempo, come dato dal LLE14.

Nei sistemi sperimentali, le variabili di stato sono spesso sconosciute; tuttavia, la topologia dello spazio delle fasi può essere ricostruita da una sola variabile misurata utilizzando il teorema di incorporamento16 di Takens costruendo le sue versioni ritardate nel tempo (equivalenti alle derivate temporali). Ogni versione ritardata è rappresentata su un asse; Insieme, i ritardi temporali formano un diagramma di ritardo, che è topologicamente identico a un grafico di fase se la serie temporale è infinitamente lunga. Le serie temporali sperimentali sono di lunghezza limitata e, pertanto, possono restituire solo LLE stimate che sono limitate da incertezze sperimentali.

La locomozione di C. elegans porta un LLE10 positivo, un indicatore di caos. Un giovane organismo subisce cambiamenti locomotori all'età di17 anni. Un LLE più grande indica una prevedibilità inferiore rispetto a un LLE più piccolo. La LLE fornisce un metodo affidabile per quantificare i modelli locomotori di un organismo 10,13,14. Le caratteristiche locomotorie dei nematodi sono correlate ai neuroni all'interno dei nematodi18. Secondo Cohen et al.19, la locomozione dei nematodi dipende dai motoneuroni, suggerendo che lo studio della complessità nella locomozione del nematode è anche correlato ai suoi circuiti neuronali.

Calibriamo l'LLE in base all'età per ridurre al minimo le incertezze per gli studi futuri. Studi precedenti hanno calcolato la media dell'LLE nei nematodi di età compresa tra tre e sei giorni13. Questo studio ha monitorato attentamente l'età dei nematodi per facilitare un'analisi rigorosa del declino associato all'invecchiamento. Inoltre, i cambiamenti nella locomozione sono stati studiati per identificare altre alterazioni biologiche in C. elegans18. L'equazione di Moore tiene traccia dei parametri di età relativi alla locomozione20 anni. Qui, usiamo una versione modificata dell'equazione di Moore che consente di valutare la flessibilità quando il meccanismo locomotorio è in atto, introdotta come marcatore temporale T:

figure-introduction-1, (1)

dove P(t) rappresenta la performance, t è il tempo, a e c rappresentano i parametri di scala, mentre b e d sono i tempi caratteristici della crescita e del declino esponenziale, rispettivamente. L'equazione di Moore ha dimostrato di prevedere le traiettorie di quantità apparentemente non correlate, come la velocità e l'attività volontaria, man mano che gli organismi invecchiano. Le specie possono essere caratterizzate dalla forma della curva come specificato dall'equazione di Moore; cioè, alcune specie possono raggiungere il picco prima di altre21.

Protocollo

1. Preparazione di C. elegans per l'acquisizione dei dati

  1. Mettere 0,5 ml di E. coli con OD600 in ciascuna piastra di agar con terreno di crescita per nematodi (NGM) affinché i nematodi possano mangiarli. Aspetta che l'E. coli si asciughi su ogni piatto di agar.
  2. Acquisire una piastra di controllo di C. elegans da qualsiasi fornitore di materiali biologici al fine di realizzare nuove piastre di C. elegans ai fini del controllo dell'età.
  3. Sterilizzare un plettro di platino usando la fiamma di un bruciatore Bunsen o equivalente. Usa un microscopio da dissezione per scegliere 5-10 esemplari adulti di C. elegans selvatici da inserire in ogni piastra.
  4. Lasciare che i nematodi depongano le uova per 4-5 ore prima di raccogliere gli adulti dal piatto. Incuba i nematodi rimanenti e lascia che siano loro a raccoglierli nel giorno desiderato.
  5. Il giorno della raccolta dei dati, riempire una cuvetta di quarzo di grado ottico da 4,5 ml con dimensioni di 10 mm x 10 mm x 45 mm con acqua distillata a temperatura ambiente appena sotto la parte superiore della cuvetta per evitare fuoriuscite quando viene aggiunto un tappo di plastica. Raccogli 2-3 nematodi e mettili delicatamente nella cuvetta. Una volta che i nematodi sono nella cuvetta, posizionala su un lato per allineare facilmente il verme nel raggio laser. Il C. elegans può galleggiare verso il fondo, ma continuerà con ondulazioni di nuoto finché è completamente immerso nell'acqua5.

2. Raccolta dei dati

NOTA: La procedura riportata di seguito per la registrazione delle serie temporali deve essere implementata ogni giorno alla stessa ora per ridurre al minimo le incertezze relative all'età.

  1. Imposta l'esperimento descritto nel precedente articolo22. Implementa una piccola modifica costruendo un periscopio con due specchi e posizionando la cuvetta su un lato tra i due specchi per facilitare il centraggio del verme nel raggio laser in un secondo momento. Al posto della telecamera, posizionare una PD nel modello di diffrazione (Figura 1).
    1. Allinea gli specchi verticalmente per costruire il suddetto periscopio.
      NOTA: Questo è l'unico lavoro di allineamento laser che deve essere completato.
  2. Accendi il laser HeNe (Helium Neon) e lascialo riscaldare per raggiungere l'equilibrio termico (~15 min).
  3. Avviare l'oscilloscopio digitale per iniziare la raccolta dei dati. Impostare i parametri dell'intervallo di tempo e del buffer di memoria sull'oscilloscopio digitale. Impostare l'intervallo di tempo su 100 s e implementare un buffer di memoria di almeno 100 kilocampioni al secondo (kS).
  4. Impostare la risoluzione su 1 kHz per la velocità di acquisizione dei dati e 12 bit per risolvere le ampiezze, il che aiuta a distinguere la complessità su piccole scale23.
  5. Impostare l'oscilloscopio in modo che centri le oscillazioni di intensità utilizzando l'offset CA automatico per centrare la serie temporale a zero volt.
  6. Raccogli 2-3 nematodi e mettili delicatamente in una cuvetta piena di acqua distillata in modo che sia più facile trovare e centrare almeno 1 verme nel raggio laser. Non agitare la cuvetta.
  7. Posizionare la cuvetta contenente 2-3 nematodi nel periscopio e centrare 1 nematode nel raggio laser.
    1. Quando il C. elegans è centrato nel raggio laser, si formerà un modello di diffrazione in campo lontano a circa 50 cm dal periscopio.
  8. Posizionare il fotodiodo nel modello di diffrazione del campo lontano quando un C. elegans attraversa il raggio laser. Assicurarsi che la PD sia posizionata fuori centro nel modello di diffrazione per catturare la luce diffratta piuttosto che il massimo centrale (raggio laser trasmesso).
  9. Raccogliere almeno 10 s di dati per calcolare il LLE in modo affidabile; ovvero, sono necessari almeno 10.000 punti dati per calcolare un LLE stabile.
    NOTA: un numero inferiore di punti dati genera un LLE che fluttua artificialmente.
  10. Ripetere la raccolta dei dati di cui sopra per ogni giorno 9-15 volte. Raccogli dati per le età di 3-12 giorni alla stessa ora del giorno.

3. Analisi dei dati

NOTA: Per l'analisi dei dati, la serie temporale viene incorporata nello spazio delle fasi utilizzando un diagramma di ritardo16 e quindi si stima l'LLE calcolando la divergenza delle traiettorie.

  1. Scegli le sezioni della serie temporale in cui il nematode nuota liberamente all'interno del raggio laser esaminando attentamente la serie temporale. La Figura 2A mostra una serie temporale valida con un segnale continuo di almeno 20 s.
  2. Esaminare le serie temporali per un basso rapporto segnale/rumore (Figura 2B). Stabilire il livello di rumore registrando una serie temporale senza il verme nella cuvetta. Le caratteristiche della serie temporale, non solo l'ampiezza, devono essere più del doppio del livello di rumore.
  3. Escludere tutti i dati saturi dalla serie temporale pertinente (Figura 2C). Se la saturazione di una quantità eccessiva di dati è sufficiente per estrarre informazioni utili, tornare alla sezione Raccolta dati precedente, ripetere i passaggi da 2.7.1 a 2.9 e regolare il livello di intensità allontanando il fotodiodo dal massimo centrale.
  4. Determinare la frequenza media data da
    figure-protocol-1(2)
    dove f è la frequenza e P è lo spettro di potenza (Figura 3). Questo può essere fatto computazionalmente utilizzando una trasformata di Fourier veloce (FFT) e quindi calcolando la media delle frequenze. Molti programmi computazionali hanno una funzione integrata per calcolare la frequenza media di un set di dati.
  5. Ricostruire la topologia dello spazio delle fasi utilizzando un metodo di ritardo temporale. Scegliere una serie temporale X e ritardare la serie temporale di un ritardo τ per risolvere le traiettorie (Figura 4). Il ritardo ottimale è determinato identificando il primo minimo locale nell'informazione reciproca (MI)24:
    figure-protocol-2(3)
    dove N è il numero di punti, Xi è un punto nella serie temporale X, mentre Xi+τ è un punto ritardato nel tempo nella stessa serie temporale. p(Xi) è la probabilità che si verifichi il punto Xi e p(Xi+τ) è la probabilità che si verifichi Xi+τ. p(Xi, Xi+τ) è la probabilità congiunta25 che la coincidenza sia della serie temporale Xi che della serie temporale ritardata Xi+τ.
  6. Identificare il primo minimo nel grafico MI tra 0,140 e 0,240 s (140 e 240 punti dati), come mostrato nella Figura 5. Non esiste un numero esatto per il ritardo; Lo scopo principale è quello di risolvere le traiettorie di fase in modo sufficiente a determinare la divergenza.
  7. Utilizzare la serie temporale Xi e le relative versioni ritardate di τ, come determinato minimizzando l'MI nel passaggio precedente.
  8. Determinare la quota di incorporamento. La dimensione di incorporamento più adatta è la dimensione più bassa per la quale i falsi vicini più prossimi (FNN) si stabilizzano al minimo (Figura 6)26. Usa il metodo sviluppato da Abarbanel et al.27,28.
  9. Utilizzare l'algoritmo di Rosenstein29 per ricostruire il sistema dinamico in uno spazio delle fasi e tracciare la divergenza delle traiettorie vicine nel tempo. In particolare, utilizza la routine MATLAB di Merve Kizilkaya, come pubblicato sul forum MATLAB30, per calcolare l'LLE. Questa routine richiede il seguente input: la serie temporale, la frequenza media dell'attrattore, il ritardo τ, la velocità di acquisizione dei dati per la serie temporale e l'intervallo per adattare la divergenza.
  10. Ripetere la procedura di cui sopra per 9-15 set di dati per ridurre l'incertezza delle stime LLE. Fare la media degli LLE per ogni giorno e quindi adattare la curva di Moore (Figura 7).

Risultati

Mentre misuravamo l'LLE rispetto all'età, abbiamo anche misurato altre grandezze spesso associate a sistemi dinamici complessi, come la frequenza dell'attrattore, l'MI e l'FNN. Abbiamo raccolto i dati degli studi sull'età dai giorni 3 ai 12. I vermi sono troppo piccoli e immaturi prima di avere 3 giorni per essere maneggiati manualmente. A 12 giorni, i vermi sono invecchiati e si muovono a malapena poiché i loro circuiti neuronali si deteriorano e il loro sistema nervoso declina31.

L'algoritmo di Rosenstein seleziona un punto vicino a un intervallo di almeno un periodo medio per ogni punto sulla traiettoria incorporata. A partire dal vettore di separazione tra i due punti sulle due traiettorie adiacenti (Figura 8), l'algoritmo traccia l'evoluzione della divergenza. La separazione delle traiettorie inizialmente aumenta esponenzialmente a causa della natura caotica del sistema32, e poi si stabilizza poiché la traiettoria è limitata. Il tracciamento del logaritmo della divergenza media nel tempo traccia la separazione delle traiettorie (Figura 8 e Figura 9). La pendenza dei minimi quadrati lineari che si adattano alla prima parte della curva prima che si appiattisca si traduce in una stima affidabile per il LLE33 del sistema. Si noti che l'incertezza è coinvolta nella scelta dell'intervallo per l'adattamento dei minimi quadrati e dell'adattamento stesso. La sensibilità alle condizioni iniziali fa sì che la regione di adattamento lineare mostri un comportamento oscillatorio mentre la divergenza viene tracciata sull'attrattore. La variazione biologica tra i vermi, che è stata mediata per ogni gruppo di età, supera la variabilità nell'adattamento lineare del LLE per un singolo studio, come mostrato in una precedente pubblicazione10.

La serie temporale (Figura 2A) mostra che i picchi e le depressioni coincidono con gli aspetti della locomozione del verme, come i cambiamenti nella frequenza, nella forma e nell'orientamento del nuoto. La serie temporale è aperiodica; Le oscillazioni nelle serie storiche non si ripetono mai, ma rimangono limitate in intensità. La frequenza è costante mentre fluttua leggermente, indicando complessità e limiti di frequenza. La Figura 10 mostra una tendenza al ribasso delle frequenze di nuoto con l'avanzare dell'età, che si rompe il giorno 12. La frequenza media salta dopo il giorno 12 per la maggior parte dei vermi. Questa è probabilmente un'indicazione della rottura del circuito neurale. Al contrario, il ritardo medio τ, determinato dal primo minimo dell'MI, aumenta con l'invecchiamento della popolazione, poiché il ciclo si allunga (Figura 11).

Nel nostro caso, l'MI rappresenta la sovrapposizione statistica tra due serie temporali ritardate. Se l'MI è minimo, allora c'è una sovrapposizione minima tra le traiettorie. In teoria, le traiettorie caotiche non si sovrappongono mai; Tuttavia, in pratica, con cifre significative limitate e un po' di rumore sperimentale, alcuni punti si sovrapporranno all'interno di una certa tolleranza24. Miriamo a ridurre al minimo la possibilità di sovrapposizione minimizzando l'MI. La differenza tra un infarto miocardico minimizzato e un infarto miocardico significativamente più grande è illustrata nella Figura 4.

La dimensione di incorporamento è determinata dai falsi vicini più prossimi (FNN). Il numero di FNN si appiattisce con il 5% o meno di FNN intorno alle dimensioni di incorporamento 3 o 4. Nella Figura 6, l'età dei nematodi non influisce sulla dimensione di inclusione, tranne il giorno 12, quando il verme è quasi alla fine della sua vita.

La traiettoria della LLE segue la curva di Moore (Figura 7) con un picco a 5 giorni, indicando che la locomozione più imprevedibile (e forse complessa) si verifica quando i C. elegans sono appena maturi. Nella Figura 7, un grafico delle LLE dal giorno 3 al giorno 12 mostra un aumento lineare con un picco a 5 giorni, seguito da una diminuzione dopo il giorno 5. Le barre di errore nella Figura 10 rappresentano la deviazione standard della media 4,34 e riflettono diversi fattori, tra cui la diversità all'interno delle specie biologiche e la stima LLE. La variazione tra i vermi tende a superare le incertezze nella routine di fitting LLE. La variabilità tra i giorni, come i giorni 5 e 7, non si sovrappone, quindi i dati sono chiaramente distinguibili. L'andamento delle LLE con l'età corrisponde strettamente all'equazione di Moore di uno studio precedente18, che descrive gli effetti dell'età sulla memoria e sulla locomozione in altri organismi viventi.

Le LLE nella Tabella 1 sono coerenti e mostrano una tendenza lentamente crescente e poi decrescente con l'età. I valori sono coerenti con i risultati precedentemente pubblicati utilizzando DOD10 e l'analisi video34,35.

figure-results-1
Figura 1: Configurazione sperimentale della diffrazione in campo lontano (non disegnata in scala). Gli specchietti di guida formano un periscopio. La cuvetta contenente il C. elegans è posta tra gli specchietti di sterzo. Il raggio laser viene diffratto dalla vite senza fine e viaggia verso il PD attraverso il secondo specchio di sterzo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Serie temporali di intensità. La serie temporale DOD mostra le fluttuazioni di intensità quando il nematode si muove nel raggio laser con (A) una serie temporale praticabile per l'analisi dei dati. (B) Questa serie temporale indica che l'intervallo tra 11 e 30 s non mostra alcun segnale; Si limita a visualizzare il livello di rumore del sistema, poiché le ampiezze costanti più brevi provengono principalmente dalla luce diffusa. (C) Questa serie temporale ha alcune istanze di dati saturi. Ogni punto dati rappresenta un picco significativo nel grafico che viene tagliato e appiattito ai picchi e ai minimi. In questo esempio, i picchi si appiattiscono man mano che l'intensità varia da -100 a 100 UA tra 45 e 50 s. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Spettro di potenza. Lo spettro di potenza mostra un massimo a circa 0,95 Hz. Le frequenze sono distribuite poiché la frequenza nelle traiettorie sull'attrattore si sposta e non si ripete mai esattamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Dati sperimentali incorporati in grafici di ritardo 3D con due diversi ritardi della stessa serie temporale di un verme di 9 giorni. Questa serie temporale mostra che la locomozione è un attrattore limitato coerente con la teoria del caos. (A) La traiettoria viene risolta utilizzando il primo minimo locale (MI ≈ 2.11), con un ritardo di circa 0,183 s (183 punti dati). Gli incroci di traiettoria visibili sono il risultato di una proiezione su uno spazio bidimensionale. (B) Questo grafico del ritardo rimane irrisolto da un ritardo inappropriato di 0,002 s (2 punti dati, (MI > 7)) poiché i punti sono troppo vicini tra loro per essere distinguibili e non mostrano divergenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: La diminuzione esponenziale dell'informazione reciproca. Il primo minimo nell'MI determina il ritardo del set di dati a 0,161 s (161 punti dati) in questo caso specifico per risolvere la traiettoria di fase. Questo ritardo sposta il valore della serie temporale per ricostruire l'attrattore nello spazio delle fasi. Il ritardo deve solo essere vicino al primo minimo, sufficiente per risolvere le traiettorie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Le dimensioni medie di incorporamento rispettivamente nei giorni 3, 5, 9 e 12. Una vista ingrandita della dimensione di incorporamento viene utilizzata per mostrare la differenza specifica tra le dimensioni di incorporamento di ogni giorno. Solo il giorno 12 mostra una differenza notevole. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: La media delle LLE stimate tra i giorni 3 e 12. Il LLE raggiunge il picco di 5 giorni. Per un massimo di 5 giorni, i nematodi mostrano una traiettoria di crescita coerente con la transizione dall'immaturità alla maturità. Dopo questi 5 giorni, i nematodi subiscono un calo della divergenza. Le incertezze sono misure della deviazione standard della media, che è dominata dalle variazioni tra i vermi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Rappresentazione della divergenza presente nella teoria del caos. Un LLE positivo causerà la divergenza nel tempo di traiettorie inizialmente vicine. t è un intervallo di tempo, d è la divergenza e x(t) è un punto nello spazio delle fasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Divergenza della traiettoria di fase su scala logaritmica. L'LLE stimato è la pendenza dell'adattamento lineare (1,08 1/s) nella regione ascendente prima di appiattirsi a causa della limitatezza dell'attrattore tra 0,96 e 1,01 s. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 10: La frequenza media per ogni giorno. La media del giorno 12 denota un cambiamento significativo nei segnali neurologici che guidano la locomozione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 11: Il ritardo medio per ogni giorno. L'infarto miocardico porta in media a ritardi inferiori tra i giorni 3 e 6, mentre un ritardo medio più elevato appare tra i giorni 7 e 12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Età (giorni)Numero di set di datiLLE (1/s)Deviazione standard della media (1/s)
3111.140.02
4151.200.03
5131.340.03
6111.230.02
7101.160.03
8121.130.02
9121.070.02
1091.000.03
1190.960.03
1290.920.02

Tabella 1: Il numero di set di dati e l'LLE medio per ogni giorno dello studio sull'età. Le LLE sono coerenti con i dati precedenti raccolti attraverso il DOD e mostrano la traiettoria crescente e poi decrescente della curva di Moore dalla Figura 7. Sono stati raccolti 9-15 set di dati per ogni giorno di dati. I set di dati sono diminuiti man mano che i vermi invecchiavano a causa della natura della loro degradazione muscolare e del declino neuronale, causando una diminuzione della locomozione.

Discussione

Abbiamo classificato la locomozione di C. elegans valutando la LLE in diverse età, supportata da parametri come la frequenza di nuoto, l'informazione reciproca (MI) e i falsi vicini più prossimi (FNN), ognuno dei quali offre ulteriori informazioni sulle proprietà dinamiche del sistema. Le proprietà deterministiche e non lineari di questo sistema sono studiate utilizzando metodi di dati surrogati e grafici di ricorrenza36.

L'uso del DOD per quantificare gli effetti dell'invecchiamento sulla locomozione è una tecnica complementare alla microscopia tradizionale. Non sostituisce l'ispezione visiva delle specie microscopiche; Fornisce un modo coerente ed efficiente per quantificare la locomozione al di là delle tecniche tradizionali. Poiché il DOD bypassa l'analisi video, una parte del carico di lavoro computazionale è intrinsecamente gestita dalla tecnica ottica, poiché la diffrazione mappa direttamente la distribuzione dell'intensità nello spazio di Fourier. La sovrapposizione del campo ottico durante la diffrazione traccia l'intera specie microscopica. Idealmente, la risoluzione è governata dalla lunghezza d'onda λ della luce utilizzata, in questo caso 632 nm. Anche uno spostamento di una frazione della lunghezza d'onda comporterà un cambiamento nell'intensità. Per questo motivo, la risoluzione è regolata dalla portata e dalla risoluzione del fotorivelatore, nonché dalla potenza del laser. Ad esempio, se il rivelatore rileva un segnale di serie temporale che fluttua tra due tensioni, Vmin e Vmax, e la risoluzione è di n bit (vedere il passaggio 2.4 del protocollo), la risoluzione massima è λ/n o, nel nostro caso, 632 nm/12. In teoria, questo metodo può essere applicato a qualsiasi corpo che cambia forma; tuttavia, il DOD è particolarmente adatto per le specie microscopiche, poiché i laser economici con le lunghezze d'onda appropriate sono prontamente disponibili ed economici.

Per garantire un modello di diffrazione chiaro e coerente, il verme deve essere accuratamente tracciato e mantenuto centrato all'interno del raggio laser mentre nuota. Se il verme si disallinea, il segnale può degradarsi o perdersi completamente. Per mitigare i problemi di saturazione del fotodiodo e ridurre il rumore stocastico, viene utilizzato un filtro a densità neutra per attenuare l'intensità del laser. Questo filtraggio aiuta a mantenere la gamma dinamica del fotodiodo e previene la sovrasaturazione nelle serie temporali registrate. Tuttavia, tutti i segmenti dei dati che presentano una saturazione eccessiva o un basso rapporto segnale/rumore sono esclusi dall'analisi finale per mantenere la qualità dei dati.

Una deriva nella frequenza del nuoto produce uno spettro di frequenza continuo, un marcatore precoce stabilito del caos13. La relazione inversa tra frequenza media e MI suggerisce che circa 1/8 di un ciclo risolve la traiettoria con una precisione sufficiente per stimare l'LLE, simile alla risoluzione richiesta per analizzare una forma d'onda sinusoidale.

La bassa percentuale di FNN intorno alle dimensioni di inclusione 3 e 4 nella Figura 6 implica bassi livelli di rumore sia nella locomozione di C. elegans che nel sistema ottico. Tuttavia, nei vermi di 12 giorni, la percentuale di FNN aumenta leggermente ma rimane ben al di sotto del 5%, non necessariamente a causa di un aumento della dimensione di incorporamento reale, ma probabilmente a causa dell'aumento del rumore nel segnale locomotore, attribuito alla degradazione neurale negli organismi che invecchiano34,37.

I cambiamenti nel LLE durante lo sviluppo mostrano che il grado di caos nella locomozione varia con l'età, corrispondendo strettamente alle previsioni dell'equazione di Moore. Un picco di LLE precoce nella vita è coerente con le caratteristiche delle specie selezionate R, come C. elegans, che devono sviluppare rapidamente la funzionalità neuromuscolare in assenza di cure parentali. In particolare, il 70% delle connessioni neuronali a lungo raggio si forma quando il verme ha solo il 20% delle sue dimensioni adulte37,38. Al contrario, le specie K-selezionate, come gli esseri umani, mostrano uno sviluppo neurologico più lento, supportato dall'investimento dei genitori, con conseguente ritardo ma più complesso dei modelli motori. Queste differenze si riflettono nella tempistica del picco di LLE tra le specie.

Il breve ciclo di vita di C. elegans, circa 14 giorni, con un rapido sviluppo durante i primi due giorni su quattro stadi larvali2, lo rende particolarmente adatto per lo studio della complessità di picco nella locomozione. Mentre studi precedenti si sono concentrati sul declino della struttura neuronale per spiegare i cambiamenti legati all'età nella locomozione34,39, il nostro lavoro collega questi cambiamenti fisici alle dinamiche caotiche sottostanti del sistema. L'integrazione del DOD con la dinamica non lineare consente una caratterizzazione quantitativa precisa su più scale di lunghezza, offrendo nuove intuizioni sui driver neuronali del comportamento. La LLE costantemente positiva nelle fasi di sviluppo supporta fortemente la presenza di un comportamento caotico nel sistema locomotore.

Questo studio offre un nuovo quadro metodologico per esaminare i cambiamenti comportamentali legati all'età in C. elegans, estendendo così l'attuale comprensione dei correlati biologici e dinamici del declino motorio. Convalida ulteriormente l'uso del LLE come biomarcatore sensibile per i cambiamenti neurologici associati all'età e dimostra che il LLE è una misura quantitativa affidabile della dinamica locomotoria influenzata dall'invecchiamento.

Il DOD è un metodo potente e non invasivo per quantificare la locomozione e il caos negli organismi microscopici, meglio visto come complementare all'analisi video piuttosto che come sostituto. Nella sua attuale implementazione, l'esperimento richiede che i nematodi abbiano almeno tre giorni, poiché i vermi più giovani sono troppo piccoli per produrre segnali di diffrazione affidabili. La serie temporale unidimensionale estratta da un singolo punto nel modello di diffrazione comprime necessariamente le informazioni spaziali, che possono oscurare le dinamiche localizzate lungo il corpo dell'organismo. Gli approcci multicanale aiutano a risolvere questa limitazione verificando la coerenza dei parametri nel campo di diffrazione, anche se le sottili eterogeneità spaziali possono ancora essere trascurate. Una stima accurata dell'LLE dipende inoltre dall'ottenimento di serie temporali sufficientemente lunghe e prive di rumore; sfide pratiche come il movimento delle viti senza fine fuori dal fascio o le fluttuazioni ambientali possono compromettere la qualità dei dati e ridurre la fiducia nei valori LLE. Come con tutti i metodi sperimentali, il rumore di misura e le decisioni soggettive durante l'adattamento LLE introducono ulteriore incertezza, che per le singole misurazioni rimane tipicamente entro circa il 15%.

Il lavoro futuro si concentrerà sulla misurazione della LLE in varie condizioni sperimentali, consentendo confronti tra LLE modellati e misurati. Ciò faciliterà lo sviluppo di modelli neurologici predittivi che potrebbero approfondire la nostra comprensione di come il controllo motorio complesso emerga e si deteriori nel tempo. Continueremo anche a esplorare la coerenza dei nostri risultati esplorando altri metodi computazionali, come il calcolo del piano Entropia-Complessità per verificare nuovamente la natura deterministica di questo sistema biologico40.

Dichiarazioni

L'autore non ha nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Vassar College e il Lucy Maynard Salmon Research Fund per il sostegno finanziario. Ringraziamo anche la dottoressa Kathleen Susman, il dottor Juan Merlo e la dottoressa Susannah Zhang per aver fornito la loro visione e assistenza durante tutte le fasi di questa ricerca.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2 Specchietti in alluminio a superficie anterioreThorlabsPF10-03-F01
Laser HeNe a 632 nmNewportLGX1Qualsiasi laser a luce rossa
Piastra di Petri vuotaCarolina971632Piastre di Petri di plastica in cui versiamo l'agar di crescita del nematode
Escherichia coli K12, Ospite vivente e batteriofago-ospitaleCarolina124500Utilizzata come fonte di cibo per la C. elegans; OD600
Microscopio Leica S9iLeica MicrosystemsLED2500Microscopio dissezionale
AccendinoAccendini BicQualsiasi tipo di strumento di sterilizzazione utilizzato per sterilizzare il piccone prima e dopo la raccolta di ogni verme
MATLABMathWorksRosenstein Algorithm-Routine sul forum MATLAB creato da Merve Kizilkaya
Agar di crescita dei nematodiCarolina173520Bottiglia di mezzo preparato, 135 mL
FotodiodoThorlabsDET36ARivelatore polarizzato in Si a 350-1100 nm
Picoscope5204Pico TechnologyPP376PC Oscilloscopio www.picotech.com
Plettro PlatinoUsata per prendere C. elegans; È un piccolo, fatto a mano, con un pezzo portatile in vetro e un cucchiaio in platino;
Cuvette al quarzoCellule di Starna21/G/5Riempito con acqua distillata per mettere al suo interno C. elegans

Riferimenti

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