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Articolo metodologico

Imaging del calcio in vivo ed ex-vivo di un neurone del circuito olfattivo nella larva di Drosophila melanogaster di terzo stadio

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DOI:

10.3791/68956

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31 ottobre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Nevada, Reno, 2Integrative Neuroscience Program, University of Nevada, Reno, 3Molecular Biosciences Program, University of Nevada, Reno, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Presentiamo i protocolli di imaging del calcio per un neurone olfattivo larvale di Drosophila , utilizzando un adesivo tissutale topico per l'immobilizzazione. Questo metodo migliora la stabilità, facilitando esperimenti affidabili in vivo ed ex-vivo . Gli script R personalizzati analizzano i segnali del calcio, fornendo una piattaforma efficiente per la ricerca neurofisiologica dettagliata.

Abstract

L'imaging del calcio è fondamentale per studiare le dinamiche neurali e la funzione cerebrale. Tuttavia, gli attuali metodi per l'imaging del calcio nelle larve di Drosophila sono impegnativi a causa degli artefatti di movimento e delle esigenze di attrezzature specializzate. Qui, presentiamo un metodo pratico e a basso costo per eseguire l'imaging del calcio sia in vivo che ex vivo in larve di Drosophila di terzo stadio, utilizzando un adesivo tissutale topico per immobilizzare i campioni. Forniamo anche script R personalizzati e un framework per l'analisi dei dati, facilitando le misurazioni delle variazioni del calcio in diverse condizioni sperimentali. Utilizzando questo approccio, abbiamo registrato con successo i transienti di calcio in una coppia di neuroni larvali del SNC con artefatti di movimento minimi, dimostrando la riproducibilità tra le preparazioni. Il metodo è compatibile con i sistemi confocali standard a disco rotante e può essere adattato per configurazioni fai-da-te o commerciali a due fotoni, rendendolo accessibile a laboratori con risorse diverse. Questo approccio può aumentare l'accessibilità agli studi di imaging larvale del calcio e può essere adattato per esaminare gli effetti sia degli stimoli esterni, come gli odori, sia degli stimoli interni, come i neuromodulatori.

Introduzione

Comprendere le dinamiche del calcio nei neuroni è fondamentale per svelare i complessi meccanismi alla base della segnalazione neurale e della funzione cerebrale, poiché gli ioni calcio svolgono un ruolo fondamentale nella modulazione dell'attività neuronale e nel guidare le risposte cellulari agli stimoli. La dinamica neuronale del calcio può essere monitorata tramite l'imaging del calcio, che fornisce informazioni in tempo reale sulla segnalazione mediata dal calcio in un'ampia gamma di organismi, tra cui la larva di Drosophila. La larva di Drosophila sta emergendo come un potente sistema modello per studiare la funzione del circuito alla base del comportamento. È uno dei soli tre organismi per i quali è stato generato un connettoma cerebrale completo a risoluzione sinaptica1. La larva è suscettibile di una serie di strumenti sofisticati che consentono l'imaging e la manipolazione dei neuroni sia a livello di intero cervello che di singolo neurone 2,3.

La capacità di misurare la dinamica del calcio nei neuroni larvali di Drosophila tramite l'imaging del calcio è stata fondamentale per far progredire la ricerca neuroscientifica4. I recenti progressi nell'imaging del calcio hanno permesso di misurare la dinamica del calcio a livello di singole sinapsi nella larva5 fino alle registrazioni multineuronali nelle larve in movimento libero6. L'imaging del calcio può essere eseguito in vivo, dove gli eventi di calcio vengono catturati in contesti fisiologici naturali dell'intera larva 4,7,8,9, o ex vivo, dove gli eventi di calcio vengono registrati in tessuti larvali sezionati conservati in condizioni fisiologiche simulate10. Nel complesso, i ricercatori hanno utilizzato varie iterazioni del metodo di imaging del calcio nelle larve di Drosophila per scoprire meccanismi fondamentali dei circuiti neurali, delle sensazioni, dell'apprendimento e della memoria e del comportamento 8,11,12,13,14,15,16,17 . Tuttavia, gli studi di imaging larvale del calcio sono limitati a causa della necessità di apparecchiature specializzate e di problemi nell'interpretazione dei dati dovuti ad artefatti da movimento.

Qui, introduciamo una metodologia economica e facilmente implementabile per l'imaging del calcio sia in vivo che ex vivo in larve di Drosophila melanogaster di terzo stadio. Immaginiamo la dinamica del calcio in Keystone-LN, un neurone inibitorio del circuito olfattivo18,19, all'interno di preparazioni larvali intere per mostrare l'imaging del calcio in vivo, e in cervelli larvali sezionati per mostrare l'imaging del calcio ex vivo. Le larve intere e i cervelli sezionati rimangono vitali e reattivi per circa 10-15 minuti nelle nostre condizioni di imaging, consentendo l'acquisizione di più prove di stimolo per campione. Per affrontare la sfida di immobilizzare intere larve o campioni di tessuto mantenendo la vitalità dei tessuti e riducendo la variabilità sperimentale, abbiamo ottimizzato l'uso di GLUture, un adesivo tissutale topico cianoacrilato biocompatibile.

Rispetto ai metodi tradizionali di immobilizzazione larvale, come l'inclusione o il pinning dell'agarosio, questo approccio basato sull'adesivo riduce gli artefatti da movimento preservando la vitalità dei tessuti20,21; Rispetto ai sistemi di imaging a due fotoni, la configurazione a disco rotante riduce i costi della strumentazione e migliora l'accessibilità per i laboratori con risorse limitate. Infine, descriviamo approcci di imaging semplici, abbinati a script R sviluppati su misura per l'analisi dei dati. Il nostro approccio può aumentare l'accessibilità agli studi di imaging larvale del calcio e può essere adattato per esaminare gli effetti sia di stimoli esterni, come gli odori, sia di stimoli interni, come i neuromodulatori.

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Protocollo

1. Preparazione delle larve di Drosophila di terzo stadio per l'imaging del calcio

  1. Mantenere le mosche con cibo per mosche standard (vedi Tabella dei materiali) a 25 °C, con 50-60% di umidità relativa (UR) e un ciclo luce/buio di 12 ore.
  2. Esprimere la proteina fluorescente rossa (RFP) per l'identificazione dei neuroni e GCaMP6f (indicatore del calcio) nei neuroni di interesse ('X'), incrociare femmine vergini della linea X-Gal4 con maschi portatori di UAS-GCaMP6f e UAS-tdTomato22.
    NOTA: Per questo studio, la linea Keystone-Gal4 è stata utilizzata per guidare l'espressione di tdTomato e GCaMP6f in una singola coppia di neuroni locali inibitori (Keystone-LN) nel cervello larvale18,19.
  3. Dopo aver lasciato accoppiare e deporre le uova per 48 ore i maschi e le femmine, trasferire gli adulti in una fiala fresca.
  4. Estrarre le larve di terzo stadio (circa 120 ore dopo la deposizione delle uova) facendole galleggiare su una soluzione di saccarosio al 15%. Utilizzare una micropipetta P1000 per trasferire le larve galleggianti in un becher di vetro da 1.000 mL.
  5. Lavare le larve 3-4 volte sostituendo ogni volta l'acqua nel becher con 800 ml di acqua distillata fresca. Lasciare riposare le larve per 10 minuti prima di procedere con il resto del protocollo.

2. Protocollo di fame per le larve di Drosophila di terzo stadio (se si testano condizioni di fame rispetto a quelle di non fame)

  1. Preparare due camere di alimentazione mettendo un quadratino di salvietta da laboratorio in piastre di Petri da 6 cm. Per condizioni di non fame, aggiungere 350 μl di soluzione di saccarosio 0,2 M; in condizioni di fame, aggiungere 350 μL di acqua distillata.
  2. Trasferire un numero uguale di larve lavate in ciascuna camera di alimentazione. Lasciare che le larve si nutrano di saccarosio (non affamato) o di acqua distillata (affamato) per 2 ore a temperatura ambiente.

3. Imaging del calcio in vivo

NOTA: Tutti gli esperimenti che coinvolgono l'adesivo tissutale devono essere condotti utilizzando le pratiche di sicurezza standard di laboratorio. Sono necessari dispositivi di protezione individuale (DPI), tra cui guanti in nitrile, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza o una visiera; I guanti di cotone devono essere evitati a causa di reazioni esotermiche con cianoacrilato. Evitare il contatto dell'adesivo con la pelle, gli occhi o le mucose. In caso di incollaggio della pelle, immergere l'area in acqua tiepida e sapone e separare delicatamente; In caso di esposizione agli occhi, sciacquare con acqua tiepida per ≥5 minuti e consultare immediatamente un medico. L'adesivo deve essere tenuto lontano da fiamme libere e calore elevato, poiché l'adesivo indurito può rilasciare fumi irritanti se bruciato. Conservare l'adesivo a ≤30 °C, al riparo dall'umidità e dalla luce diretta del sole, in un contenitore ermeticamente chiuso quando non viene utilizzato.

  1. Preparare il tampone per imaging del calcio con la seguente composizione: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glucosio 10 mM e HEPES 10 mM. Conservare a 4 °C quando non in uso.
    NOTA: La soluzione salina modificata contenente 110 mM di NaCl è una formulazione ampiamente accettata per la dissezione e l'imaging larvale del SNC e rientra nell'intervallo tipico utilizzato negli studi di elettrofisiologia e imaging (≈108-128 mM NaCl)23,24,25,26.
  2. Su un vetro di copertura del microscopio di 24 x 50 mm (1,5 mm di spessore), creare un pozzetto utilizzando la vaselina erogata da una siringa.
  3. Posizionare una piccola goccia di adesivo topico per tessuti (60% 2-ottile e 40% n-butilcianoacrilato) al centro del vetro di copertura. Stendere l'adesivo in modo uniforme in uno strato sottile e uniforme utilizzando una bacchetta di vetro.
  4. Trasferire con cura una singola larva sull'adesivo utilizzando un pennello o un filo sottile. Premere delicatamente il lato ventrale della larva sull'adesivo. Lasciare asciugare l'adesivo, assicurandosi che la larva sia completamente immobilizzata.
  5. Una volta immobilizzata la larva, posizionare il vetro di copertura sul tavolino del microscopio invertito (Figura 1A).

4. Imaging del calcio ex-vivo

  1. Preparare il tampone di dissezione larvale con la seguente composizione: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 0,3 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glucosio 10 mM e HEPES 10 mM. Conservare a 4 °C quando non in uso.
  2. Sezionare le dissezioni cerebrali come descritto da Ishimoto e Sano10. Brevemente, usando un pennello o un filo sottile, trasferire una singola larva in una capsula di Petri di 3,5 cm con elastomero siliconico stratificato sul fondo.
  3. Sotto un microscopio da dissezione, posizionare la larva con il lato ventrale rivolto verso l'alto e localizzare il cervello. Usando le forbici da dissezione, fai un taglio a circa un terzo dell'estremità anteriore della larva. Fai un altro taglio ai ganci della bocca. Preserva il cervello rimuovendo il corpo e i ganci della bocca (adattato da Janelia Flylight Protocol27).
  4. Identificare il gruppo di nervi contenenti motoneuroni dal midollo ventrale. Usando una pinza, allontana delicatamente il cervello dal resto della larva sezionata. Taglia il tessuto in eccesso dal cervello.
    NOTA: Maneggiare delicatamente: una forza eccessiva può causare danni ai tessuti poiché il cervello è fragile.
  5. Preparare un vetro di copertura del microscopio con l'adesivo tissutale per l'imaging del calcio come descritto nei passaggi da 3.2 a 3.3.
  6. Utilizzando una micropipetta P10, aspirare con cura il cervello sezionato con 5 μl di soluzione di dissezione dalla capsula di Petri. Espellere lentamente il cervello sull'adesivo. Prima che l'adesivo si asciughi, orientare il cervello in una posizione con il lato dorsale rivolto verso l'alto (con i due lobi cerebrali rivolti verso il basso e il cordone ventrale dorsale rivolto verso l'alto).
  7. Utilizzando una micropipetta P200, trasferire 100 μl del tampone di imaging del calcio sul cervello larvale immobilizzato sul vetro di copertura.
  8. Posizionare il vetro di copertura con il cervello sul microscopio invertito, collegato a un modulo scanner confocale a disco rotante e a una telecamera CCD per l'imaging del calcio (Figura 1B).
    NOTA: Per le preparazioni ex-vivo , assicurarsi di orientare correttamente il cervello mentre la colla è ancora bagnata. Per una qualità dell'immagine ottimale, posizionare il cervello in modo che la ROI sia più vicina all'obiettivo del microscopio ed evitare di applicare una colla in eccesso vicino alla ROI.

5. Protocollo di imaging

  1. Aprire il software per l'imaging del calcio utilizzando il microscopio confocale. Acquisizione di immagini utilizzando un obiettivo 10x/1,4 NA con commutazione del filtro tra laser GFP (eccitazione 488 nm, intensità 70%, emissione 525 nm/50 m, OD8) e laser RFP (eccitazione 561 nm, intensità 50%, emissione 610 nm/75 m, OD8). Impostare l'esposizione tra 100 ms e 1.000 ms, il guadagno al 50% del valore di esposizione corrispondente e un fattore di binning di 2 durante l'acquisizione dell'immagine.
  2. Regola il microscopio su un ingrandimento di 10x e posiziona il cervello sotto l'illuminazione a campo chiaro.
  3. Identifica il neurone di interesse cercando il segnale tdTomato con il laser RFP (eccitazione impostata a 561 nm).
    NOTA: Selezionare la saturazione e ridurre la gamma per impostare il valore di esposizione corretto.
  4. Una volta identificata la regione di interesse (ROI), passare al laser GFP (eccitazione impostata a 488 nm) per catturare i segnali GCaMP6f. Assicurarsi che entrambi i segnali tdTomato e GCaMP siano colocalizzati prima di acquisire le immagini dello stack di entrambi i canali.
    NOTA: Regola le impostazioni dell'immagine per le registrazioni in stack tdTomato e GCaMP6f per massimizzare la fluorescenza.
  5. Cattura due registrazioni di serie temporali separate di segnali tdTomato e GCaMP6f contemporaneamente a una velocità di 0,5 fotogrammi/s (per un totale di 2 minuti).
    NOTA: Il cervello larvale sezionato rimane vitale per circa 10 minuti in queste condizioni tampone; Trascorso questo tempo, i segnali si degraderanno.
  6. Una volta che il campione è pronto per l'immagine, acquisisci due registrazioni di serie temporali separate dei segnali tdTomato e GCaMP6f contemporaneamente a una velocità di 0,5 fotogrammi/s (per un totale di 2 minuti).
    NOTA: Il cervello larvale sezionato rimane vitale per circa 10 minuti in queste condizioni tampone; Trascorso questo tempo, i segnali si degraderanno.
    NOTA: Durante l'esecuzione dell'analisi quantitativa, si consiglia di aumentare la potenza del laser e di regolare il guadagno di esposizione del rivelatore secondo necessità, mantenendo la scala lineare dell'intensità.

6. Elaborazione e analisi dei dati

  1. Apri e importa gli stack di segnali tdTomato e GCaMP6f in ImageJ (NIH)28.
  2. Per identificare la regione di interesse (ROI) corretta, unire i segnali tdTomato e GCaMP6f per confermare la colocalizzazione. Dopo la verifica, dividere i canali tdTomato e GCaMP6f.
  3. Nel menu in alto, seleziona Plugin | Nuovo, e fare clic su Macro per avviare una nuova macro. Quindi, importare le macro personalizzate basate sul ROI in ImageJ. Seleziona lo stack GCaMP6f e premi Esegui per l'analisi del calcio.
  4. Elaborare i segnali di fluorescenza utilizzando una macro ImageJ personalizzata (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). La macro genera prima proiezioni di massima intensità, esegue la correzione del movimento utilizzando il plug-in StackReg (modalità di registrazione rigida )29 e applica la correzione della decolorazione.
  5. Apparirà un pop-up "Azione richiesta" che richiede la selezione manuale del ROI, che consente agli utenti di disegnare manualmente un ROI ampio. Fare clic su OK per continuare l'analisi. Per eseguire la correzione del movimento, assicurati che la casella rettangolare copra l'intero ROI in tutti i fotogrammi per una correzione del movimento accurata, mantenendo la forma spaziale locale e il ROI tra i fotogrammi.
    NOTA: le registrazioni sono state registrate in ImageJ utilizzando StackReg. Quando il movimento nel piano era grande (spostamento XY cumulativo > 1 μM) o la deriva Z assiale portava alla perdita di messa a fuoco, la registrazione diventava inaffidabile o il campione veniva perso completamente dalla finestra di imaging. Pertanto, i campioni che mostravano una deriva estrema o segnali di calcio in declino (>30%) sono stati automaticamente etichettati ed esclusi dall'analisi a valle per garantire misurazioni accurate dell'attività neuronale. Queste soglie sono coerenti con le pratiche di controllo della qualità comunemente applicate negli studi di imaging del calcio 30,31,32,33. L'esclusione ha inoltre garantito che per le analisi venissero utilizzate solo registrazioni stabili con transitori di calcio affidabili legati allo stimolo.
  6. Per l'analisi, estrarre tracce di fluorescenza da ROI circolari definite manualmente, guidate dall'autocorrelazione dei pixel; questi ROI comprenderanno l'intero campo dei neuroni chiave.
    1. Estrarre i dati grezzi di intensità della fluorescenza per due fluorofori: GCaMP6f/GFP e tdTomato/RFP, utilizzando macro personalizzate in ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, vedere la Tabella dei materiali).
    2. Applica una finestra scorrevole con un ROI di 20 x 20 pixel e una dimensione del passo di 10 pixel su tutto il campo visivo. Per ogni ROI, la macro calcolerà: (1) l'intensità in tutti i fotogrammi, (2) la differenza di fluttuazione della linea di base (ovvero la differenza tra i valori di intensità massima e minima durante i primi 10 fotogrammi) e (3) la variazione massima di intensità da fotogramma a fotogramma (ΔF). I ROI che mostrano fluttuazioni di intensità inferiori a 10 unità verranno eliminati e solo i valori ΔF più nitidi saranno selezionati per ulteriori analisi.
    3. Normalizzare le tracce di fluorescenza utilizzando i seguenti metodi:
      1. Normalizzazione Fmax e Fmin: Calcola Δ normalizzato utilizzando la formula:
        figure-protocol-1
        Dove F è la fluorescenza grezza in ogni punto temporale, Fmin è la fluorescenza minima (linea di base) e Fmax è la fluorescenza massima durante la registrazione.
      2. Normalizzazione ΔF/F 0: inoltre, eseguire la normalizzazione ΔF/Fo, dove Fo (linea di base) è determinata dai primi 10 fotogrammi di ogni registrazione, utilizzando la formula:
        figure-protocol-2
        Dove Ft è la fluorescenza al tempo t e F0 è il valore di base calcolato dai primi 10 fotogrammi.
  7. Dopo aver estratto i segnali GCaMP6f, fai clic con il pulsante sinistro del mouse e seleziona tutto, taglia e incolla per trasferire tutti i valori in un nuovo foglio di calcolo Excel. Nella barra dei menu in alto, seleziona Dati | Testo in colonne. Apparirà un pop-up della procedura guidata "Testo in colonna". Nel passaggio 1, seleziona Delimitato, quindi fai clic su Avanti. Nel passaggio 2, in Delimitatori, selezionare Tabulazione e virgola, quindi fare clic su Avanti. Nel passaggio 3 selezionare Fine.
    FACOLTATIVO: per tracciare i segnali di calcio normalizzati, evidenziare Fnorm_FminFmax e selezionare Grafico a dispersione.
  8. Cerca un file .csv che viene generato contenente: (1) valori di fluorescenza grezzi F, (2) ΔF/Fo e (3) Fnorm (intensità di fluorescenza normalizzata). Organizzare il set di dati finale in quattro colonne: (1) tempo (frame), (2) condizione del campione (affamato o nutrito), (3) ID replica (campione singolo) e (4) intensità normalizzata (valori Fnorm scalati da 0 a 1).
  9. Infine, eseguire l'analisi e la visualizzazione dei dati in R utilizzando script R personalizzati (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging. vedere Tabella dei materiali).
    1. Importare lo script R personalizzato in un nuovo progetto R. Assicurarsi che i pacchetti R necessari, inclusi ggplot2, dplyr e readr, siano installati e aggiornati prima di eseguire l'analisi.
    2. A partire dalla riga 1 dello script R personalizzato, premere Esegui continuamente per eseguire l'analisi del calcio. Assicurarsi inoltre che l'output includa mappe di calore che illustrano l'intensità normalizzata del calcio per i primi 30 fotogrammi, 60 fotogrammi e tutti i fotogrammi della registrazione delle serie temporali e boxplot per mostrare la mediana delle intensità normalizzate.
    3. Valutare il significato dell'intensità di calcio normalizzata utilizzando il test U di Mann-Whitney.

7. Smaltimento e decontaminazione dei rifiuti

  1. Dopo gli esperimenti, rimuovere i detriti grossolani dagli strumenti e dalle superfici sotto l'acqua corrente, quindi disinfettare con etanolo al 70% o candeggina al 10% seguita da acqua sterile. Lavorare su una superficie disinfettata e lavarsi le mani dopo aver tolto il guanto; Non mangiare o bere in laboratorio.
  2. Collocare il tessuto larvale e i prodotti monouso contaminati in sacchetti a rischio biologico e in autoclave prima dello smaltimento.
  3. Gettare i rifiuti di adesivo completamente polimerizzati nella spazzatura generale; L'adesivo non polimerizzato e i prodotti monouso contaminati devono essere raccolti in un contenitore per rifiuti chimici pericolosi sigillato ed etichettato.
  4. Metti tutti gli oggetti taglienti (lame, aghi, vetri rotti) in un contenitore per oggetti taglienti resistente alla perforazione.
  5. Raccogliere i solventi infiammabili (etanolo, acetone) in contenitori per rifiuti infiammabili etichettati.

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Risultati

Per dimostrare il nostro approccio di imaging larvale del calcio, lo abbiamo applicato con successo sia a preparazioni in-vivo che ex-vivo delle larve di Drosophila (Figura 2 e Figura 3, Video 1, Video 2, Video 3 e Video 4). Abbiamo misurato la dinamica del calcio in larve di Drosophila di terzo stadio che esprimono GCaMP6f e Td-Tomato in una singola coppia di Keystone-LN nel ...

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Discussione

Qui, descriviamo un approccio per l'imaging del calcio sia in vivo che ex-vivo in larve di Drosophila melanogaster di terzo stadio. Abbiamo ripreso la dinamica del calcio in Keystone-LN, un neurone locale inibitorio nella larva di Drosophila . Abbiamo misurato la dinamica del calcio Keystone-LN in preparazioni larvali intere (in vivo) e in preparazioni sezionate del cervello larvale (ex vivo) (Figura 1).<...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Siamo grati al Dr. Jeffrey Harper, che ha messo a nostra disposizione il microscopio confocale a disco rotante del suo laboratorio per questi esperimenti. Siamo grati per il dono della flyline: w; UAS-GCaMP6f/CyO, piangere; UAS-tdTomato del Dr. Jung Hwan Kim. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi della National Science Foundation nell'ambito dei premi 2341202 e 2129234. La Figura 1 è stata creata utilizzando Biorender.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Stock per mosche e azioni Manutenzione
Cibo per mosche nutriflyGenesee Scientific66-112
UAS-GCaMP6f, tdTomatoDono del Dr. JH Kim 
w;; Keystone-Gal4 (GMR27F08-GAL4)BDSC49232
Protocollo Reagenti per la Fame
Vasa di Petri da 6 cmGenesee Scientific32-106G
SaccarosioMillipore SigmaS0389-500G
Reagenti per il buffer di imaging e dissezione
Cloruro di calcioJ.T. Baker, Avantor SciencesJT1311-1CAS: 1311-01, 500g
D-(+)-GlucosioThermo Fisher ScientificA16828.36CAS: 50-99-7, 500g
HEPES-2-[4-(2-Idrossietil)-1-piperazinil]-acido etanosulfonicoJ.T. Baker, Avantor SciencesJT4018-1CAS: 4018-01, 100g
Cloruro di magnesioVWR97064-150CAS: 7786-30-3, 100g
Cloruro di potassioThermo Fisher ScientificJ64189.36CAS: 7447-40-7, 500g
Cloruro di sodioEMD Milipore SigmaEMD-SX0420-1CAS: 7647-14-5, 500g
Strumenti e reagenti per la dissezione
Tampone di dissezioneComposizione fornita nel testo
Piastre di Petri Olympus, 60 x 15mm ventilateGenesee Scientific32-105
Base Elastomera Sylgard 184Scienze della microscopia elettronica24236-10A
Agente di polimerizzazione a base elastomera Sylgard 184Scienze della microscopia elettronica24236-10B
Pinzette Stile 5, EMSScienze della microscopia elettronica78320-5
Forbici a molla Vannas - Filo da taglio da 3mmStrumenti scientifici di qualità15000-00
Imaging e Montaggio di Apparecchiature/Reagenti
Modulo Confocal ScannerYokogawaCSU-W1collegato al microscopio
Imaging BufferComposizione fornita nel testo
Microscopio RovesciatoLeica MicrosystemsDMi8 Collegato a un modulo scanner confocale a disco rotante e a una fotocamera CCD
Vetro da copertura microscopica, 24mm x 50mm, spessore # 1.5Globe Scientific Inc.1415-15
Adesivo topico MWI Veterinary GLUTUREFisher ScientificNC0632797
Vaselina puraWalgreens912556
Collegamenti a risorse pubbliche
BioRenderhttps://www.biorender.com/
ImageJNIH912556https://imagej.net/ij/
Video del protocollo Janelia Flylighthttps://www.janelia.org/https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o
Mathew Lab Githubhttps://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging

Riferimenti

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