Le linee cellulari resistenti ai farmaci consentono la comprensione dei meccanismi di resistenza al trattamento e la valutazione non clinica di nuovi composti, farmaci riproposti e terapie combinate. Questo articolo introduce un protocollo per la creazione di linee cellulari resistenti esponendo le linee cellulari madri ad aumenti graduali della concentrazione del farmaco bersaglio.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Sviluppo di linee cellulari resistenti ai farmaci per procedure sperimentali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo sviluppo di linee cellulari resistenti ai farmaci è essenziale per comprendere i meccanismi della resistenza ai farmaci e identificare strategie per superare il fallimento del trattamento nella terapia del cancro. I modelli di resistenza consentono la valutazione preclinica di nuovi composti, farmaci riproposti e terapie combinate. Per generare cellule resistenti, le linee cellulari tumorali parentali sono ripetutamente esposte a concentrazioni crescenti del farmaco bersaglio per diverse settimane. Le cellule che sopravvivono e proliferano in ogni fase vengono selezionate, espanse ed esposte a dosi di farmaco più elevate. Lo sviluppo della resistenza è confermato dalla quantificazione e dal confronto dei valori di concentrazione inibitoria semimassimale (IC50) tra cellule parentali e resistenti utilizzando saggi di vitalità cellulare e analisi di regressione non lineare. Valori IC50 significativamente aumentati indicano un adattamento riuscito alla pressione del farmaco e lo sviluppo di resistenza. Queste linee cellulari resistenti ai farmaci sono disponibili per analisi complete, come il sequenziamento di microarray e singole cellule, nonché per vari esperimenti in vitro o in vivo . Questi modelli forniscono strumenti preziosi per studiare potenziali strategie terapeutiche per superare la resistenza ai farmaci.
Introduzione
La chemioterapia è l'opzione di trattamento più frequentemente utilizzata per i tumori locali non suscettibili di chirurgia o radioterapia o tumori metastatici. I farmaci a bersaglio molecolare e la chemioterapia sono usati come trattamenti di prima linea per molte neoplasie maligne e la loro efficacia è ampiamente riconosciuta. Alcuni tumori mostrano resistenza a determinati farmaci fin dall'inizio del trattamento, rendendo il trattamento inefficace. Tuttavia, nei casi più comuni, il trattamento che inizialmente era efficace diventa inefficace a causa dello sviluppo di resistenza ai farmaci, portando alla progressione del cancro.
La resistenza ai farmaci è causata sia da mutazioni genetiche che dalla risposta epigenetica nelle cellule tumorali che inducono l'espressione di prodotti genici che eludono i farmaci o aiutano la crescita cellulare 1,2. Inoltre, in molti casi, questa resistenza evolve in resistenza multifarmaco, in cui la cellula tumorale diventa resistente a più farmaci 3,4. Pertanto, identificare i meccanismi della resistenza ai farmaci e sviluppare strategie per superarla è estremamente importante per l'avanzamento del trattamento del cancro.
Le linee cellulari resistenti ai farmaci sono modelli frequentemente utilizzati per studiare i meccanismi della resistenza terapeutica e svolgono un ruolo importante sia negli esperimenti in vitro che in vivo 5. Questi modelli sono strumenti essenziali per ottenere una comprensione più profonda delle vie d'azione dei farmaci, identificare i biomarcatori che influenzano l'efficacia terapeutica e trovare strategie terapeutiche per inibire la formazione di resistenza ai farmaci. Il processo di base per creare una linea cellulare resistente ai farmaci consiste nell'indurre resistenza esponendo una linea cellulare a livelli crescenti del farmaco bersaglio 3,6.
La concentrazione utilizzata e la durata dell'esposizione al farmaco sono componenti fondamentali di questo processo. Ad ogni livello di concentrazione, il sottoinsieme di cellule che sopravvivono viene amplificato e quindi esposto alla successiva concentrazione di farmaco in modo ripetitivo. In definitiva, viene derivata una linea cellulare resistente ai farmaci che ha una maggiore concentrazione inibitoria semimassima (IC50) per il farmaco rispetto alla linea cellulare parentale. Questo rapporto descrive in dettaglio la procedura per generare una linea cellulare resistente al paclitaxel (DU145-TxR) dalla linea cellulare di cancro alla prostata umana DU145, impiegando un metodo graduale con esposizioni intermittenti ai farmaci.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Colture cellulari e saggi di vitalità cellulare
NOTA: Il paclitaxel è un farmaco antitumorale ed è citotossico. Quando lo si maneggia, indossare un camice, occhiali e guanti e lavorare all'interno di un armadietto di sicurezza per evitare l'inalazione nel corpo. Il DMSO non è altamente citotossico, ma quando entra in contatto con la pelle o le mucose, la permeabilità dei farmaci disciolti aumenta, quindi indossa un camice, occhiali e guanti quando lo maneggi.
- Coltura di cellule DU-145 in una piastra di coltura cellulare da 10 cm utilizzando un terreno completo (RPMI-1640 + 1% penicillina-streptomicina [pen-strep] + 10% siero fetale bovino [FBS]) in un'incubatrice a 37 °C al 5% di CO2 fino all'80% confluente.
- Aspirare il terreno di coltura, lavare con DPBS, aggiungere lo 0,05% di tripsina e lasciare in incubatrice per 5 minuti.
- Dopo aver picchiettato e confermato al microscopio che le cellule sono staccate dalla piastra e galleggianti, aggiungere 1 mL di terreno completo per fermare l'azione della tripsina.
- Contare il numero di cellule e seminarle a una densità di 1,0 × 104/99 μL per pozzetto in terreno completo in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Incubare per 2 ore per consentire alle cellule di aderire al fondo della piastra. Le cellule devono essere piastrate in triplicato o quadruplicato per ciascun gruppo di prova.
- Regolare il paclitaxel e il DMSO da aggiungere a ciascun pozzetto. Assicurarsi che la quantità di DMSO aggiunta a ciascun pozzo sia la stessa e che la concentrazione finale di DMSO non sia superiore all'1%.
- Per eseguire questa operazione e seguendo il nostro protocollo, iniziare con 10 mM di paclitaxel in DMSO e aggiungere 87,2 μL di DMSO a 12,8 μL di questo farmaco in una provetta per ottenere 100 μL di paclitaxel a 1.280 μM.
- Trasferire 50 μl di questa soluzione in un'altra provetta e diluirla a metà forza con 50 μl di DMSO (640 μM).
- Ripetere questa procedura per eseguire la diluizione seriale e preparare soluzioni di paclitaxel a concentrazioni di 0 (solo DMSO), 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 e 1.280 μM.
NOTA: Il paclitaxel diluito con DMSO deve essere conservato congelato per essere riutilizzato negli esperimenti successivi (per ridurre al minimo i cicli di congelamento-scongelamento, conservare in aliquote).
- Diluire 1 μl della soluzione di paclitaxel preparata in precedenza con 9 μl di terreno completo in una provetta separata e aggiungere 1 μl di questo in ciascun pozzetto 2 ore dopo aver seminato le cellule. Le concentrazioni di paclitaxel in ciascun pozzetto saranno 0, 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 e 1.280 nM, con ogni pozzetto contenente 100 μL di terreno.
NOTA: Quando si imposta la concentrazione dei farmaci utilizzati nei saggi di vitalità cellulare, controllare i valori IC50 pubblicati negli articoli precedenti e assicurarsi che la concentrazione rientri nell'intervallo3. La concentrazione di DMSO in ciascun pozzetto è stata dello 0,1% (meno dell'1% è auspicabile). - Incubare per 48 h. Aggiungere 10 μL di reagente per la proliferazione cellulare WST-1 a ciascun pozzetto (100 μL di terreno di coltura) e incubare per ulteriori 0,5-4,0 ore.
NOTA: Il tempo di incubazione ottimale dipende dalla linea cellulare e dalla densità cellulare. In questo studio, abbiamo coltivato cellule per circa 1,5 ore. Se il tempo di incubazione è troppo breve o troppo lungo, l'assorbanza di ciascun pozzetto sarà troppo bassa o troppo alta nella fase successiva. Di conseguenza, non sarà possibile confermare la differenza nella vitalità cellulare. Pertanto, per il test iniziale, è necessario testare diversi tempi di incubazione per confermare il tempo di incubazione appropriato. - Misurare l'assorbanza WST-1 utilizzando un lettore di micropiastre.
NOTA: L'assorbanza target è di 450 nm (si consiglia 420-480 nm) e l'assorbanza di fondo è di 650 nm (si consiglia 600 nm o superiore).
2. Calcolo della vitalità cellulare e del valore della concentrazione semi-massima inibitoria (IC50)
- Calcola la vitalità cellulare dall'assorbanza. L'assorbanza è (A450nm-A650nm).
Vitalità cellulare (%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)] × 100
As: assorbanza del campione (cellule trattate con farmaco)
Ab: assorbanza in bianco (solo terreno, senza cellule)
Ac: controllo dell'assorbanza (cellule non trattate con farmaci) - Riassumi la vitalità cellulare calcolata nella sezione precedente in un foglio di calcolo.
- Calcolare e registrare l'IC50 per le cellule parentali mediante analisi di regressione non lineare.
NOTA: Il modello logistico a quattro parametri (4PL) è spesso un metodo di calcolo adatto. Sono disponibili gli strumenti di calcolo IC50 online7. Tuttavia, il modello 4PL non deve essere utilizzato quando l'efficacia del composto è al di fuori dell'intervallo di concentrazione e i dati non possono rappresentare completamente gli asintoti inferiori e superiori della curva sigmoidea.- Per evitare tale aumento, misurare la vitalità cellulare nel maggior numero possibile di punti di concentrazione. Se non è possibile ottenere una curva sigmoidea, utilizzare una modalità a due o tre parametri con valori minimi e massimi fissi7.
- Se non si utilizzano software di calcolo o software statistici, compresi quelli disponibili sul web, utilizzare la seguente formula:
IC50=((50-C)(B-A) + A(D-C))/(D-C)
A: Il valore più basso tra le concentrazioni di farmaco misurate con una vitalità cellulare del ≤50%
B: Il valore più alto tra le concentrazioni di farmaci misurate con una vitalità cellulare del >50%
C: Vitalità cellulare a B
D: Vitalità cellulare ad A
NOTA: questa formula presuppone che il grafico tra i due punti che racchiudono il valore IC50 sia una linea retta.
3. Esposizione ai farmaci
NOTA: Una panoramica delle procedure descritte in questa sezione è mostrata nella Figura 1.
- Semina di cellule parentali su piastre di coltura cellulare (2,0 × 106 cellule/piastra per piastre da 100 mm).
- Aggiungere paclitaxel a una concentrazione inibitoria della vitalità cellulare di ~10-20% (IC10-20, ~0,5 nM in questo caso) al terreno e coltivare in un incubatore per 2 giorni.
- Sostituire con terreno privo di paclitaxel e incubare per diversi giorni.
- Una volta che le cellule sono cresciute e sono diventate confluenti all'80%, passatele in una nuova piastra di coltura cellulare. Crioconservare le cellule rimanenti.
- Aggiungere paclitaxel alle cellule passate a una concentrazione di ~1,5-2,0 volte la concentrazione iniziale (0,75-1 nM). Incubare in un'incubatrice per 2 giorni.
- Sostituire con terreno privo di paclitaxel e incubare per diversi giorni.
- Se le cellule crescono in modo simile, ripetere i passaggi 3.4-3.6, aumentando gradualmente la concentrazione di esposizione al paclitaxel.
NOTA: L'aumento della concentrazione del farmaco (1,5-2,0 volte) può essere impostato liberamente dallo sperimentatore e l'esperimento deve essere ripetuto a quella concentrazione. Si consiglia di congelare e conservare le cellule ogni volta che la concentrazione del farmaco viene aumentata. Se la concentrazione di paclitaxel continua ad aumentare ulteriormente, la proliferazione cellulare potrebbe non riprendersi e le cellule potrebbero morire. In questi casi, scongelare le cellule che proliferavano alla concentrazione prima della morte, ridurre l'aumento del paclitaxel a 1,1-1,5 volte (si raccomanda 1,2 volte) e ripetere la coltura. - Aumentare gradualmente la resistenza della linea cellulare al farmaco e quindi calcolare e registrare l'IC50 utilizzando WST-1 e il software come descritto nella Sezione 2.
NOTA: Se si osserva un aumento di IC50 di almeno 3-5 volte, si può determinare che il ceppo è una linea cellulare resistente ai farmaci.
4. Mantenimento della resistenza ai farmaci
- Per mantenere il fenotipo resistente della linea cellulare resistente ai farmaci, incubare con una concentrazione di farmaco di IC10-20.
NOTA: Si raccomanda di misurare periodicamente l'IC50 in un test di sopravvivenza cellulare, poiché la resistenza ai farmaci può cambiare.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Utilizzando questo metodo, in precedenza abbiamo trascorso 9 mesi a stabilire con successo cellule DU145 resistenti al paclitaxel (DU145-TxR). I risultati del test di vitalità cellulare hanno mostrato che il valore IC50 di paclitaxel per la linea cellulare madre DU145 era 1,1 nM, mentre il valore IC50 per DU145-TxR era 149,6 volte superiore a quello della linea cellulare madre (IC50: 164,6 nM) (Tabella 1 e Figura 2). Questo risultato indica c...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Lo sviluppo di linee cellulari tumorali resistenti ai farmaci è un metodo consolidato per studiare la tossicità dei farmaci e i meccanismi di resistenza, ma la prima sfida che i ricercatori devono affrontare è la selezione di un modello appropriato per esprimere la resistenza. Un metodo comune per creare linee cellulari resistenti ai farmaci in vitro consiste nell'esporre la linea cellulare al farmaco bersaglio, ma è necessario considerare come impostare la concentrazione di esposizione ...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere potenziali conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla sovvenzione P01 CA093900 del National Institutes of Health.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Pipetta sierologica monouso da 10 mL | Fisher scientific | 13-678-11E | |
| Piatto da 100 mm | Corning | 353003 | |
| Tubo conico da 15 mL | Corning | 352097 | |
| Fiale criogeniche da 2,0 mL | Piastra | ||
| 96 pozzetti | Corning | 353072 | |
| Vetrino della camera di conteggio delle cellule | Invitrogen | C10228 | |
| Reagente per la proliferazione cellulare WST-1 | Sigma | 5015944001 | |
| Centrifuga 5702 R | eppendorf | ||
| innumerevoli II | Invitrogen | Contatore di cellule | |
| Dimetilsolfossido | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | D4W2J | |
| DU145 | ATCC | HTB-81 | Linea cellulare per il cancro alla prostata |
| EVOS FLc | Thermo Fisher Scientific | Microscopio invertito digitale | |
| FBS | Gibco | A5670701 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| Penicillina... streptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Synergy H1 | BioTek | Lettore di micropiastre | |
| Trypan Blue soluzione 0,4% | Invitrogen | 15250061 |
Riferimenti
- Zahreddine, H., Borden, K. L. Mechanisms and insights into drug resistance in cancer. Fron Pharmacol. 4, 28(2013).
- Emran, T. B., et al. Multidrug resistance in cancer: understanding molecular mechanisms, immunoprevention and therapeutic approaches. Fron Oncol. 12, 891652(2022).
- Takeda, M. The establishment of two paclitaxel-resistant prostate cancer cell lines and the mechanisms of paclitaxel resistance with two cell lines. Prostate. 67 (9), 955-967 (2007).
- Abelman, R. O., et al. TOP1 mutations and cross-resistance to antibody-drug conjugates in patients with metastatic breast cancer. Cli Cancer Res. 31 (10), 1966-1974 (2025).
- McDermott, M. In vitro development of chemotherapy and targeted therapy drug-resistant cancer cell lines: a practical guide with case studies. Fron Oncol. 4, 40(2014).
- Breen, L., Murphy, L., Keenan, J., Clynes, M. Development of taxane resistance in a panel of human lung cancer cell lines. Toxico In Vitro. 22 (5), 1234-1241 (2008).
- Bioquest, A. A. IC50 calculator. , AA Bioquest. https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator (2025).
- Kawai, H. Characterization of non small-cell lung cancer cell lines established before and after chemotherapy. Lun Cancer. 35 (3), 305-314 (2002).
- Berendsen, H. H., et al. Characterization of three small cell lung cancer cell lines established from one patient during longitudinal follow-up. Cance Res. 48 (23), 6891-6899 (1988).
- Sakai, W. Functional restoration of BRCA2 protein by secondary BRCA2 mutations in BRCA2-mutated ovarian carcinoma. Cance Res. 69 (16), 6381-6386 (2009).
- Schnepp, P. M., et al. Single-cell transcriptomics analysis identifies nuclear protein 1 as a regulator of docetaxel resistance in prostate cancer cells. Mo Cancer Res. 18 (9), 1290-1301 (2020).
- Grigoreva, T., Sagaidak, A., Novikova, D., Tribulovich, V. New insights into chemoresistance mediated by Mdm2 inhibitors: the benefits of targeted therapy over common cytostatics. Biomedicines. 12 (3), 547(2024).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
