Ottenere una raccolta di dati tomografici di alta qualità utilizzando il microscopio elettronico a trasmissione da 200 kV con sistema di doppia lente a condensatore

Summary

La tomografia elettronica consente l'imaging a livello vicino atomico di organelli, cellule e macromolecole all'interno dei tessuti in campioni crio-biologici. Raggiungere tale risoluzione richiede condizioni di imaging rigorosamente controllate. Qui, utilizzando come esempio un microscopio elettronico a trasmissione da 200 kV con un sistema di lenti a condensatore a due stadi, descriviamo come effettuare la raccolta di dati di alta qualità per tomografia elettronica.

Abstract

La crio-tomografia elettronica (crio-ET) è emersa come una tecnica potente per chiarire le strutture degli organelli cellulari e dei grandi complessi proteici nei loro ambienti nativi. A differenza della microscopia elettronica convenzionale a temperatura ambiente, la crio-ET minimizza i danni alle strutture interne indotti dalle radiazioni e dalla preparazione. Inoltre, a differenza dell'analisi a singola particella (SPA), la crio-ET riduce la necessità di purificazione ripetitiva, preservando così le informazioni strutturali più autentiche dei campioni. Per ottenere immagini ad alta risoluzione, la crio-ET impone anche requisiti rigorosi sulle condizioni di imaging del TEM. Nonostante il continuo miglioramento dell'efficienza dell'acquisizione dati crio-ET e l'emergere di numerose piattaforme software, la maggior parte delle soluzioni è proprietaria, specifica per il fornitore e strettamente accoppiata a determinati modelli di microscopio elettronico, portando a elevati costi di implementazione. In questo studio, abbiamo installato il software open-source SerialEM su un microscopio elettronico da 200 kV (Glacios 2 cryo-TEM) con un sistema di doppia lente a condensatore e abbiamo effettuato calibrazioni complete per consentire l'acquisizione di dati tomografici di alta qualità. Utilizzando l'apoferritina come campione modello, descriviamo l'intero flusso di lavoro: dalla preparazione del criocampione alla raccolta automatica dei dati crio-ET, seguita dalla ricostruzione del tomogramma e dall'analisi sub-tomogrammata. Questo metodo offre una soluzione conveniente e accessibile per la raccolta dati crio-ET, in particolare per laboratori che utilizzano microscopi Glacios senza accesso a software proprietario.

Introduction

La criotomografia elettronica (crio-ET) è emersa come una tecnica potente per studiare le strutture native dei complessi macromolecolari e degli organelli cellulari in situ. Un grande vantaggio della criogenica ET rispetto all'analisi a singola particella (SPA) è la sua capacità di evitare i passaggi eccessi di purificazione, preservando così lo stato nativo delle biomolecole target nel loro contesto biologico. Attualmente, un ampio spettro di campioni — inclusi organelli^{purificati 1,2,3,4}, fogli di membrana cellulari, complessi^{macromolecolari 5}, virus 6, lamelle^{cellulari 7} e sezioni^{tissutali 8,9,10} – può essere studiato tramite crio-ET. Data la diversità dei tipi di campione e degli obiettivi sperimentali, le strategie di raccolta dati variano notevolmente e devono essere accuratamente adattate sia al campione sia alla configurazione specifica dello strumento.

La raccolta dati è un passaggio fondamentale nel flusso di lavoro crio-ET, poiché sia la qualità dei dati che l'efficienza dell'acquisizione influenzano direttamente l'elaborazione a valle e il successo sperimentale complessivo dell'esperimento. Per soddisfare le esigenze sperimentali in evoluzione, sono state sviluppate diverse piattaforme di raccolta dati. Tra i più diffusi ci sono la Tomografia commerciale e il software open-source SerialEM 11,12,13. Tomografia offre un'interfaccia altamente integrata e intuitiva con una curva di apprendimento bassa, ma è meno flessibile e richiede una licenza commerciale. Al contrario, SerialEM è un pacchetto gratuito e open-source che supporta sia flussi di lavoro basati su interfaccia grafica utente (GUI) che basati su script, offrendo maggiore flessibilità ed estensibilità.

La raccolta di dati tomografici dalle crio-lamelle presenta sfide uniche. Le lamelle di alta qualità sono difficili da preparare e la loro instabilità meccanica e l'elevata sensibilità all'irradiazione elettronica complicano ulteriormente la raccolta dei dati. Per affrontare queste sfide, Fabian Eisenstein ha sviluppato il workflow^{PACEtomo 14}, un miglioramento di SerialEM che introduce lo spostamento dell'immagine del fascio per acquisire più tomogrammi per ogni serie di inclinazione, riducendo così la frequenza degli aggiustamenti di messa a fuoco e di tracciamento. Questa strategia massimizza la quantità di dati utilizzabili da ogni sezione minimizzando l'esposizione inutile agli elettroni. Funzionalità simili sono disponibili anche nel software commerciale Tomography5.

Al contrario, la raccolta dati da organelli criofissi o fogli di membrana è generalmente più semplice, poiché questi campioni sono tipicamente preparati su griglie di carbonio a foro, offrendo ampie aree per la messa a fuoco e il^{tracciamento 15,16}. In tali casi, i flussi di lavoro di acquisizione crio-ET integrati di SerialEM — accessibili direttamente tramite la sua interfaccia grafica — offrono un'opzione comoda e priva di scripting, particolarmente adatta a principianti o laboratori più piccoli. Tuttavia, dal punto di vista dell'efficienza, raccomandiamo ancora strategie basate sullo spostamento dell'immagine del fascio ogni volta che possibile.

Dato l'elevato costo dei microscopi crioelettronici, ottimizzare le strategie di raccolta dati per massimizzare l'utilizzo degli strumenti è essenziale. Un TEM da 200 kV dotato di un sistema di lenti a condensatore a due stadi offre una penetrazione elettronica leggermente inferiore per campioni spessi rispetto a uno strumento da 300 kV, ma rimane pienamente valido per la crio-ET se calibrato correttamente. Tuttavia, il suo intervallo relativamente ristretto di condizioni di fascio parallelo e la dimensione fissa dei punti attraverso ingrandimenti lo rendono generalmente meno adatto per crio-ET ad alta risoluzione, a meno che il sistema non sia ottimizzato con precisione.

Il nostro impianto di microscopia elettronica è dotato di una fotocamera Falcon 4i per il rilevamento diretto degli elettroni, che offre notevoli vantaggi in termini di conteggio singolo elettrone e imaging continuo ad alta velocità. Per sfruttare appieno le prestazioni di questo rivelatore, il TEM deve essere utilizzato in condizioni di imaging ben ottimizzate. Per i TEM che utilizzano un sistema di condensatore a due stadi, la calibrazione precisa delle condizioni di illuminazione per la luce parallela è un fattore importante per migliorare la qualità dell'immagine^17,18. Nei moderni sistemi di condensatore a due stadi, il punto focale della lente condensatrice di secondo stadio deve coincidere con il piano focale anteriore dell'obiettivo superiore per garantire che il percorso ottico che interseca il piano campione sia parallelo. Condizioni di luce parallele accuratamente stabilite sono fondamentali per garantire che i valori di sottofuoco e l'ingrandimento rimangano coerenti nelle posizioni locali delle immagini raccolte.

In questo studio, ci siamo concentrati sull'istituzione di un flusso di lavoro crio-ET di alta qualità utilizzando l'apoferritina come campione modello. Poiché il sistema di microscopio elettronico a trasmissione da 200 kV non è autorizzato per il software di tomografia commerciale, abbiamo installato e calibrato invece la piattaforma open-source SerialEM. Ottimizzando attentamente i parametri del fascio parallelo per il sistema di lenti a condensatore a due stadi del microscopio, abbiamo ottenuto la raccolta automatica dei dati tomografici tramite l'interfaccia grafica SerialEM, senza la necessità di script Python o configurazioni complesse. Questo approccio offre una soluzione intuitiva ed economica per l'acquisizione efficiente di dati crio-ET su strumenti a 200 kV come Glacios.

Protocol

1. Preparazione e caricamento di campioni criogenici

1. Per preparare il Vitrobot, accendilo e imposta la temperatura a 10 °C. Imposta l'umidità al 100%. Sostituisci la carta filtrante.
2. Inserire una griglia di cucu, a cucuola R1.2/1.3 R1.2/1.3 con fori da 300 meglie, nel sistema di scarica glow. Imposta le condizioni di scarica di glow a 15 mA per 60 s con una pressione di vuoto di 0,39 mBar, carica negativa. Esegui la scarica di luce luminosa per idrofilizzare la superficie della griglia.
3. Imposta i parametri di Vitrobot come segue: tempo di irrigazione: 3 s, tempo di attesa: 0 s, forza di contaminazione: 2, temperatura: 8 °C, umidità: 90%.
4. Prepara l'etano liquido in una tazza di etano avvolta in azoto liquido raffreddandolo con azoto liquido.
5. Applicare 3 μL di campione di apoferritina sulla griglia scaricata a luce. Velifica immediatamente il campione in etano liquido
6. Trasferire il campione dall'etano a una scatola di conservazione pre-raffreddata in azoto liquido. La preparazione del campione criogenico è ora completata.
   ATTENZIONE: I seguenti protocolli di sicurezza devono essere seguiti rigorosamente nella gestione di azoto e etano liquidi: è necessario equipaggiamento di protezione individuale (ad esempio, guanti criogenici e occhiali di sicurezza) per prevenire congelamenti durante le operazioni; prima della condensazione dell'etano, assicurarsi che la coppa ricevente sia priva di azoto liquido per evitare schizzi causati da ebollizione rapida; Dopo l'uso, chiudere saldamente le valvole principali e di regolazione della pressione del sistema a gas etano per prevenire perdite; L'etano residuo e l'azoto liquido devono essere smaltiti in apparecchiature di ventilazione designate all'interno della sala di preparazione dopo la preparazione del campione.

2. Determinazione delle condizioni di luce parallela per la microscopia elettronica

1. Prima di eseguire l'allineamento parallelo del fascio, si regolano prima i seguenti parametri del telescopio: stadio all'altezza eucentrica, lente obiettivo a fuoco, inclinazione del fascio nP ppX/ppY, punto di pivot senza coma X/Y, coma e stigma.
2. Utilizzando una griglia a reticolo trasversale, confermare che il campione sia all'altezza eucentrica e a messa a fuoco corretta a un ingrandimento di SA 73.000× (senza filtro energetico) in modalità nano-sonda.
3. Passa alla modalità diffrazione (lunghezza della fotocamera: D750 mm) e inserisci l'apertura obiettivo da 100 μm (Figura 1A, 1B).
4. Clicca sulla scheda Regola per l'apertura dell'obiettivo e usa le manopole multifunzione X e Y per spostare l'apertura dell'obiettivo fuori centro in modo che il bordo dell'apertura si sovrapponi agli anelli di diffrazione dorati e occhiua parzialmente il punto centrale (Figura 1C).
5. Porta in campo visivo il piano focale posteriore dell'obiettivo regolando la messa a fuoco di diffrazione usando la manopola di messa a fuoco finché il bordo dell'apertura dell'obiettivo non è il più nitido possibile (Figura 1D).
6. Regolare l'intensità del fascio (forza C2) finché la larghezza degli anelli di diffrazione dell'oro non è minimizzata.
7. Centra l'apertura dell'obiettivo. Aumentare la lunghezza della telecamera di diffrazione finché non è visibile solo il punto centrale (Figura 1E).
8. Clicca sulla scheda Diffrazione nel pannello Stigmator e usa le manopole multifunzione X e Y per regolare la forma del punto centrale mentre si cicla sopra e sotto il punto di incrocio per rendere il fascio circolare (Figura 1F).
9. Regola l'intensità del fascio finché il punto centrale non viene minimizzato. Questo stabilirà condizioni di illuminazione parallela. Poiché le condizioni di illuminazione parallela possono variare con diverse dimensioni di punti, documenta le corrispondenti impostazioni di C2 per ciascuna dimensione di punto comunemente usata per facilitare una configurazione rapida durante futuri esperimenti.
   NOTA: La dimensione specifica dello spot utilizzata durante l'acquisizione dei dati dipende dall'ingrandimento e dall'impostazione del diaframma C2; Dobbiamo garantire che l'imaging venga eseguito alla dose ottimale per la fotocamera.

3. Raccolta di dati di alta qualità per tomografia elettronica per campioni di apoferritina

NOTA: Questa sezione delinea una procedura standardizzata per l'acquisizione di dati tomografici ad alto rendimento, adatta sia a utenti esperti che a nuovi ricercatori.

1. Per agganciare la griglia e caricare il campione criogenico preparato nel microscopio elettronico, posizionare l'anello O nello strumento di allineamento, con la griglia preparata posizionata al centro dell'anello O. Usa la penna a molla per agganciare l'anello C all'anello O, fissando il campione tra di essi.
2. Inserisci l'Autogrid verticalmente nello slot della cassetta, trasferiscilo alla nanocup attraverso la workstation, e poi caricalo nel microscopio elettronico.
3. Per catturare un montaggio completo dell'intera griglia usando SerialEM, avvia il software SerialEM. Attiva la modalità Low Dose. Definisci la modalità di ricerca a un ingrandimento del 115×.
   NOTA: L'ingrandimento di ricerca è tipicamente utilizzato per acquisire mappe di grandi aree. Questo ingrandimento viene impostato il più basso possibile per velocizzare il processo di mappatura, garantendo al contempo l'accuratezza della cucitura dell'immagine.
4. Apri il file Navigator. Vai su Navigator > Montaggio & Griglie > imposta il montaggio completo. Nella finestra di dialogo, imposta Usa Modalità Ricerca; Salva le immagini in formato Bin4. Clicca su Start sotto i Contri Montaggio.
5. Per calibrare i campi di ricerca e visualizzazione, nella modalità Ricerca, individua un punto di riferimento altamente riconoscibile (Figura 2A). Clicca su Aggiungi marcatore nel navigatore. Clicca su Vai al Marker per spostarti nella posizione del marker.
6. Passa alla modalità Vista (2600×) e individua lo stesso punto di riferimento. Clicca sul punto di riferimento. Vai su Navigatore, clicca su Shift to Marker per allineare i campi (Figura 2B). Seguendo i prompt nella finestra di dialogo, gli spostamenti del fascio di entrambe le ingrandizioni vengono assegnati a tutti i marcatori nella mappa di ricerca e i valori di spostamento vengono salvati (Figura 2C).
   NOTA: L'ingrandimento della visuale è generalmente impostato al minimo ingrandimento dell'Area Selezionata (SA) per garantire che sia la visuale che la registrazione siano nella stessa modalità, rendendo più semplice il processo di centratura durante la commutazione dell'ingrandimento.
7. Per calibrare i campi di visualizzazione e registrazione (Figura 3). Nella modalità Visualizzazione, individua un punto di riferimento molto riconoscibile. Passa alla modalità Record (120k×). Usa il mouse per centrare il punto di riferimento in modalità Registro.
   NOTA: L'impostazione dell'ingrandimento Record dipende dalla risoluzione stimata del bersaglio (dove la risoluzione del bersaglio è il doppio del pixel) e dalla dimensione del campione.
8. Torna alla modalità Visualizzazione e scatta una foto. Trascina l'oggetto bersaglio sotto l'ingrandimento di visuale fino al mirino che rappresenta il centro del campo visivo usando il tasto destro del mouse.
9. Clicca su Imposta accanto a Shift nella sezione Defocus per allineare i campi.
10. Per selezionare il quadrato bersaglio e catturare una mappa a ingrandimento medio, 5.1 nel montaggio completo, clicca su Aggiungi poligono per delineare l'area da catturare. Dopo aver delineato un'area, clicca su Smetti di aggiungere per finalizzare la selezione.
11. Ripeti il passo 3.10 per tutte le aree desiderate. Per ogni poligono nel Navigatore, seleziona le opzioni Acquisisci (A) e Nuovo File in Item.
12. Nella finestra di dialogo che appare dopo aver selezionato Nuovo File su Item, seleziona le seguenti: Immagini montate; Adatta il montaggio al poligono; Chiudi il file quando si apre il prossimo nuovo file. Clicca OK.
13. Nella nuova finestra di dialogo, seleziona la seguente: Sposta la fase invece di spostare immagine; Usa i parametri di visualizzazione in modalità Low Dose. Salva l'immagine nella posizione specificata.
14. Per catturare la mappa a ingrandimento medio, nel menu Navigatore, clicca su Acquisisci a Oggetti. Controlla le seguenti opzioni: acquisisci e salva immagine o montaggio; Crea una mappa Navigator.
15. Nella sezione Azione Primaria Correlata, seleziona la modalità Usa Vista per catturare immagini. Nella sezione Compiti prima o dopo la Primaria, controlla Eucentricità approssimativa. Clicca su VAI per iniziare a catturare la mappa a ingrandimento medio.
16. Per selezionare i punti sulla mappa a ingrandimento medio. Apri la mappa a ingrandimento medio nell'interfaccia Navigator. Clicca su Aggiungi Punto e clicca con il tasto sinistro sugli oggetti target nella mappa.
17. Ripeti per tutti i punti desiderati. Dopo aver selezionato tutti i punti, clicca su Ferma Aggiungi per finalizzare la selezione.
18. Per l'allineamento dell'apertura, usa allineamenti diretti nell'interfaccia del microscopio per regolare l'inclinazione del fascio nP ppX/ppY e il punto di perno senza coma X/Y, minimizzando il balbettamento del punto del fascio nel campo visivo.
19. Esegui l'ambito di sintonizzazione utilizzando uno script dalla libreria di script SerialEM (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).
20. Per avviare la raccolta dei dati tomografici, nell'interfaccia Navigator, localizza il ROI e verifica la Tilt Series. Nella finestra di dialogo, seleziona Immagini Frame; Scegli la posizione di archiviazione dei dati.
21. Nella finestra di dialogo impostazioni, imposta un intervallo di gradi da -50° a 50°. Imposta l'incremento base a 2,5°, l'angolo iniziale a 0° e abilita lo schema dose-simmetrico.
    NOTA: Le impostazioni per la dose per inclinazione, l'intervallo di inclinazione e il passo di inclinazione seguono generalmente i principi descritti di seguito: La dose totale è mantenuta a circa 100 e⁻/Ų. L'intervallo di inclinazione viene selezionato per garantire che, anche all'angolo di inclinazione più alto, il campione rimanga in gran parte libero e consenta una trasmissione e imaging elettronici sufficienti. Se l'intervallo di inclinazione è relativamente ampio (ad esempio, oltre ±60°), il passo di inclinazione può essere impostato a 3°. Per un intervallo di inclinazione più ridotto (ad esempio, intorno a ±50°), il passo di inclinazione può essere ridotto a 2,5° o 2° per garantire che la dose totale rimanga intorno a 100 e⁻/Ų. Questo è particolarmente importante per i microscopi da 200 kV, dove i danni da radiazioni sono più evidenti rispetto a quelli a 300 kV, rendendo essenziale evitare dosi totali eccessive.
22. Nella sezione Intensità del fascio o Controllo dell'esposizione, controlla Mantenere l'intensità del fascio. Imposta il target di Defocus a -3 μm e imposta la frequenza dell'Autofocus una volta per ogni inclinazione.
23. Seleziona Stop se l'Autoalign sposta più del 60% della dimensione dell'immagine, imposta Traccia Prima e Dopo.
24. Per iniziare la raccolta dati, in Navigator, clicca su Acquisisci agli Oggetti. Nell'azione primaria, controlla Ciclo di defocus bersaglio in autofocus, drift wait e TS.
25. Imposta l'intervallo di defocatura da -3,5 a -4,5 μm, in 4 passaggi. Sotto Generale, attiva Chiudere le valvole della colonna all'estremità. Nella sezione Compiti prima o dopo la Primaria, abilita Riallineare all'oggetto e Definire Eucentricità prima della Primaria.

4. Media subtomogrammatica dell'apoferritina

1. Esegui correzione del movimento e stima CTF usando Warp¹⁹. Esegui l'allineamento in serie tonografica usando AreTomo3²⁰.
2. Esegui la ricostruzione tomografica e la deconvoluzione usando il Warp. Esegui la selezione delle particelle basata su template usando PyTom²¹.
3. Effettua il perfezionamento iniziale usando RELION^{5 22}. Esegui un raffinamento ad alta risoluzione usando M²³.
4. Determinare la struttura finale elaborando otto serie di inclinazione, seguita dalla selezione di 5.939 particelle e da un raffinamento iterativo, raggiungendo una risoluzione finale di 2,8 Å (Figura 4).

Results

Dopo un preciso allineamento parallelo del fascio, abbiamo condotto la raccolta dei dati tomografici per l'apoferritina utilizzando la funzione di interfaccia grafica di SerialEM. L'elaborazione successiva con Warp, AreTomo, PyTom, RELION e altri software rilevanti ha prodotto una struttura finale a una risoluzione di 2,8 Å. Questa risoluzione dimostra sufficientemente l'elevata qualità dei nostri dati, raggiungendo un livello attualmente raggiungibile tramite la media subtomografica a risoluzione relativamente alta. Come mostrato nella Figura 4, i risultati allineati e ricostruiti (Figura 4A) dimostrano chiaramente l'architettura complessiva e la distribuzione spaziale dell'apoferritina. La media subtomogrammatica è stata eseguita su particelle estratte da otto serie di inclinazione allineate e ricostruite, ottenendo una struttura a una risoluzione di 2,8 Å (Figura 4B). La corrispondente curva di correlazione del guscio di Fourier (FSC) è presentata nella Figura 4C.

Figura 1: Determinazione della condizione di illuminazione parallela utilizzando il secondo sistema di lenti a condensatore. (A) Pattern di diffrazione in modalità diffrazione senza apertura. (B) Schema di diffrazione dopo l'inserimento di un'apertura oggettiva di 100 μm. (C) Apertura spostata rispetto al centro di diffrazione per visualizzare meglio la nitidezza dei bordi. (D) Bordo del diaframma focalizzato e anelli di diffrazione ottimizzati regolando le correnti dell'obiettivo e dell'obiettivo C2. (E) Punto di diffrazione centrale ellittico che richiede correzione tramite il pannello Stigmator. (F) Punto di diffrazione centrale circolare e minimizzato che indica un'illuminazione parallela ottimizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Processo di allineamento da alto a basso ingrandimento dalla Ricerca (115×) alla Visualizzazione (2600×). (A) Immagine in modalità ricerca con il marcatore (freccia rossa) posizionato sul bordo del foro. (B) Immagine in modalità visualizzazione con il marcatore (freccia rossa) posizionato nella stessa posizione dell'oggetto come in (A). L'opzione Shift to Marker si clicca nel navigatore. (C) Nella finestra pop-up, gli spostamenti del fascio di entrambe le ingrandizioni vengono assegnati a tutti i marcatori nella mappa di ricerca e i valori di spostamento vengono salvati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Processo di allineamento da ingrandimento alto a basso dalla Vista (2600×) al Record (120k×). (A) In modalità Registro, l'oggetto bersaglio è posizionato al centro del campo visivo (il cerchio tratteggiato rosso evidenzia l'oggetto bersaglio). (B) Immagine catturata in modalità Visualizzazione, dove l'oggetto bersaglio non è allineato con il mirino rosso (il cerchio tratteggiato rosso evidenzia l'oggetto bersaglio e il mirino rosso). (C) L'oggetto target viene trascinato al centro del mirino rosso cliccando con il tasto destro e spostandolo, seguito dalla pressione del pulsante Set situato accanto al pulsante Shift (la casella tratteggiata rossa evidenzia il pulsante). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Determinazione della struttura dell'apoferritina. (A) Imaging strutturale. Mappa di risoluzione locale della media finale del subtomogramma. La texture appare uniforme, con caratteristiche nanoscale ravvicinate e ripetute su tutto il campo visivo. (B) Mappatura quantitativa risolta spazialmente. Una mappa circolare a falso colore della stessa o di una regione nanostrutturata correlata. I colori variano da blu/verde a giallo/rosso, corrispondenti ai valori numerici mostrati sulla scala dei colori qui sotto (circa 2,5-3,5 in unità arbitrarie). La distribuzione cromatica eterogenea indica una variazione spaziale in una proprietà misurata (ad esempio, altezza, spessore, indice di rifrazione o risposta meccanica/ottica) all'interno del campione. (C) Caratterizzazione globale spettrale o funzionale. Curva di correlazione del guscio di Fourier (FSC) utilizzata per la stima della risoluzione. La risoluzione finale di 2,8 Å è indicata dalla linea tratteggiata in FSC = 0,143. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Le procedure per la preparazione del criocampione e la raccolta dei dati tramite tomografia elettronica devono essere adattate al tipo specifico di campione. La strategia sperimentale descritta qui è ben adatta a macromolecole biologiche, complessi proteici e piccoli organelli. Questi campioni possono essere vitrificati direttamente su griglie elettromagnetiche e il loro spessore relativamente piccolo garantisce una trasmissione efficiente degli elettroni e l'acquisizione di immagini ad alto contrasto. Idealmente, lo spessore del campione non dovrebbe superare i 200 nm.

Per i campioni congelati in immersione, si preferisce generalmente una dimensione laterale inferiore a 10 μm per minimizzare la formazione di ghiaccio cristallino, che può compromettere l'integrità strutturale. Per campioni più grandi, il congelamento ad alta pressione o l'inclusione di crioprotettori, come il glicerolo, nel tampone possono ritardare la nucleazione del^{ghiaccio 23}. Tuttavia, per soddisfare i requisiti di spessore per il TEM, spesso è necessario un ulteriore diradamento. Tra gli approcci di assottigliamento disponibili, la fresatura a fascio ionico focalizzato^{(FIB) 24}è la più adottata per la sua precisione e il minimo danno, che produce lamelle adatte per crio-ET ad alta risoluzione.

Durante la raccolta dei dati delle lamelle, è fondamentale massimizzare l'utilizzo delle lamelle. L'implementazione dell'acquisizione a spostamento di immagine fascio può ridurre la necessità di passaggi ripetitivi di messa a fuoco e tracciamento, aumentando così la capacità di raccolta dati. Sebbene non descritta in dettaglio qui, questa tecnica è stata ampiamente descritta nella metodologia PACEtomo.

Attualmente, le opzioni software più popolari per la raccolta dei dati tomografici includono la Tomografia (Thermo Fisher Scientific) e SerialEM. La tomografia è una soluzione commerciale con una flessibilità limitata per la personalizzazione, mentre SerialEM, sviluppato da David Mastronarde presso l'Università del Colorado Boulder, è un software open-source che supporta l'automazione basata su script. Tuttavia, sfruttare appieno le capacità di SerialEM richiede una curva di apprendimento notevole. In questo studio, presentiamo un flusso di lavoro semplificato che sfrutta l'interfaccia grafica di SerialEM, eliminando la necessità di scripting o configurazioni basate su Python e consentendo l'acquisizione di dati notturna senza supervisione.

Una sfida frequente durante l'acquisizione dei dati tomografici con questo metodo è il tracciamento impreciso, che può portare a serie di inclinazione incomplete con angoli mancanti o complicare l'allineamento successivo. Per mitigare questi problemi, i parametri di tracciamento devono essere ottimizzati in base al contrasto del campione e alla stabilità dello stadio di inclinazione. Le strategie efficaci includono l'adattamento del tempo di esposizione nelle posizioni di tracciamento per garantire la nitidezza dell'immagine, la separazione fisica delle posizioni di tracciamento e di messa a fuoco per ridurre i danni cumulativi da radiazione, e la riduzione dell'ingrandimento di tracciamento quando la stabilità dello stadio è scarsa per facilitare un abbinamento affidabile dei pattern. Collettivamente, questi aggiustamenti sono essenziali per ottenere prestazioni di tracciamento robuste in diverse condizioni sperimentali. In questo lavoro, utilizziamo l'apoferritina come campione modello. Con il presupposto di testare e correggere la luce parallela, utilizziamo le funzioni integrate di SerialEM per raccogliere dati di alta qualità per la crio-ET ed eseguire calcoli subtomogrammatici sui campioni di ferritina, ottenendo infine la struttura finale a 2,8 Å.

Questo metodo è stato sviluppato per estendere l'applicabilità dei microscopi elettronici a 200 kV per crio-ET ad alta risoluzione. Raggiungere tale risoluzione dipende fondamentalmente dall'ottenimento di dati di imaging di alta qualità, che a loro volta richiedono condizioni di illuminazione precise. A tal fine, abbiamo eseguito un accurato allineamento parallelo dell'illuminazione come passo preparatorio critico. La procedura di allineamento descritta qui è specificamente progettata per i TEM dotati di un sistema di lenti a due condensatori, come il Thermo Fisher Scientific Talos Arctica e il Glacios. A differenza degli strumenti con una terza lente condensatrice (C3), questi sistemi limitano la condizione di illuminazione parallela a un singolo valore specifico di eccitazione dell'obiettivo C2. Questa vincolo intrinseco richiede un allineamento eccezionalmente preciso del fascio di elettroni per posizionare l'immagine sorgente sul piano focale anteriore dell'obiettivo superiore, un prerequisito per prestazioni ottimali di immagini. I nostri risultati successivi di elaborazione dei dati dimostrano che, dopo questo allineamento, la qualità dell'acquisizione dei dati ottenuta con questo microscopio a 200 kV per i campioni testati è quasi comparabile a quella tipicamente attesa da uno strumento a 300 kV.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Griglia niti ANTCryoTM	Najingdingxin	M04240922A	Utilizzato per la preparazione del criocampione
Apoferritina	Biortus	BP17854-00A	Utilizzato per la preparazione del criocampione
Griglia a reticolo trasversale	Agar Scientific	AGS106	Utilizzato per determinare le condizioni di luce parallela
Glacios2	Thermo Fisher	9959084	Utilizzato per la raccolta dati Tomo
Carta filtro numero 2, 55 mm	Whatman	10311807	Carta assorbente
PELCO eeasyLOW	TED PELLA	91000-01020	Utilizzato per la scarica da bagliore
Griglia Quantifoil Cu	quantifoil	N1-C14nCu30-01	Utilizzato per la preparazione del criocampione
Vitrobot Mark IV & nbsp;	Thermo Fisher	230101164	Utilizzato per la preparazione del criocampione