Articolo metodologico

Una procedura di agopuntura sensibilizzata visualizzata per l'osteoartrite del ginocchio: valutazioni comportamentali, termiche e molecolari

DOI:

10.3791/68967

⸱

29 agosto 2025

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1School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Traditional Chinese Medicine, Air Force Medical Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio descrive in dettaglio un metodo di fissazione del ratto adatto per fotografare l'agopuntura e la termografia a infrarossi. Inoltre, dimostra che l'elettroagopuntura nei punti di agopuntura sensibilizzati inibisce il dolore infiammatorio locale.

Abstract

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L'osteoartrite del ginocchio (KOA), una delle principali cause di dolore muscoloscheletrico e disabilità funzionale in tutto il mondo, rimane difficile da gestire a causa della limitata efficacia degli attuali interventi farmacologici e chirurgici nel ottenere un sollievo prolungato dal dolore. Sebbene l'agopuntura si sia dimostrata promettente dal punto di vista clinico nell'alleviare il dolore correlato alla KOA, i suoi meccanismi sottostanti richiedono ulteriori chiarimenti. L'applicazione dell'agopuntura ai punti di agopuntura sensibilizzati può migliorare notevolmente l'efficacia della terapia. Questo protocollo stabilisce un modello di ratto di KOA attraverso l'iniezione intra-articolare di monoiodoacetato di sodio (MIA) e descrive sistematicamente un protocollo di agopuntura mirato ai punti di agopuntura sensibilizzati, inclusi i metodi di contenzione, la localizzazione dei punti di agopuntura e i parametri di agopuntura. L'efficacia terapeutica è stata valutata in modo completo attraverso valutazioni comportamentali del dolore, analisi termografica a infrarossi dell'articolazione del ginocchio, rilevamento di citochine infiammatorie nel siero ed esame istopatologico del tessuto cartilagineo. I risultati indicano che l'agopuntura nei punti di agopuntura sensibilizzati allevia significativamente i fenotipi del dolore nei ratti modello indotti da MIA inibendo il rilascio di mediatori pro-infiammatori, bloccando la trasmissione del segnale nocicettivo, migliorando la microcircolazione sanguigna, regolando la temperatura articolare locale e ritardando la degenerazione articolare.

Introduzione

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L'artrosi del ginocchio (KOA), una malattia degenerativa delle articolazioni prevalente, è caratterizzata da infiammazione cronica e patologia dell'intera articolazione, tra cui erosione della cartilagine, rimodellamento osseo subcondrale, sviluppo di osteofiti e infiammazione sinoviale 1,2. Clinicamente, i pazienti presentano tipicamente dolore, debolezza muscolare, instabilità articolare, rigidità mattutina transitoria e limitazioni funzionali progressive. La KOA impone un notevole carico globale di malattia, colpendo circa 365 milioni di individui con disabilità funzionale, con modelli epidemiologici che prevedono un'escalation del 74,9% del numero di casi rispetto ai valori di riferimento del 2020 entro la metà del secolo 20503. In particolare, mentre il dolore funge da principale motivatore del trattamento4, allo stesso tempo esacerba la disabilità funzionale, compromettendo profondamente diversi domini della qualità della vita attraverso una mobilità compromessa e una ridotta capacità di attività quotidiana. Di conseguenza, le strategie terapeutiche mirano ad alleviare il dolore, ripristinare la funzione e ritardare la progressione della malattia5. L'attuale farmacoterapia di prima linea comprende analgesici, farmaci antinfiammatori non steroidei, condroitina e glucosamina solfato e corticosteroidi intra-articolari per ridurre il dolore e l'infiammazione6. Tuttavia, l'uso prolungato di questi agenti è limitato da significativi rischi iatrogeni, in particolare complicanze gastrointestinali ed eventi avversi cardiovascolari7, sottolineando così la necessità critica di alternative terapeutiche più sicure e sostenibili.

L'agopuntura e l'elettroagopuntura sono state ampiamente utilizzate nella gestione dell'osteoartrite, dimostrando efficacia nell'alleviare il dolore al ginocchio e migliorare la funzionalità articolare 8,9, con l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) che riconosce l'artrite come condizione prioritaria per la terapia di agopuntura. Come bersagli ed effettori sia della stimolazione, gli agopunti rimangono centrali nella ricerca sull'agopuntura, dove il loro aspetto morfologico, le dimensioni spaziali e la reattività funzionale subiscono cambiamenti dinamici durante gli stati patologici, un fenomeno chiamato "sensibilizzazione degli agopunti"10,11. In modo critico, questo processo di sensibilizzazione modula l'area del campo recettivo e la reattività terapeutica degli agopunti, determinando così l'efficacia del trattamento. Precedenti studi preclinici12,13 hanno dimostrato sensibilizzazione a Yanglingquan (GB34, localizzato nella depressione anteriore e inferiore alla testa del perone, vicino al lato laterale dell'arto posteriore) e Zusanli (ST36, localizzato sul lato anteriore della gamba, il bordo laterale del legamento rotuleo è depresso al punto medio anteriore, 3/16 dell'articolazione della caviglia) in modelli animali KOA. L'imaging laser speckle ha rivelato un'elevata perfusione sanguigna locale in questi punti di agopuntura, mentre l'imaging fotoacustico paradossalmente non ha mostrato alterazioni strutturali significative nella microcircolazione, suggerendo che i cambiamenti microcircolatori durante la sensibilizzazione dei punti di agopuntura nella KOA sono principalmente funzionali piuttosto che strutturali. Le indagini sui meccanismi sottostanti richiedono l'uso di modelli di ratto; Tuttavia, una scarsa conformità alle procedure negli animali comporta un notevole investimento di tempo. Per affrontare questi vincoli, è stato sviluppato un apparecchio di immobilizzazione per ratti, specificamente progettato per facilitare l'accesso ai punti di agopuntura degli arti inferiori e migliorare l'efficienza delle procedure di elettroagopuntura.

La termografia a infrarossi, come modalità di imaging funzionale, utilizza sensori a infrarossi senza contatto per rilevare la radiazione termica da regioni di interesse predefinite, con dati elaborati al computer che generano termogrammi a pseudocolori per l'analisi quantitativa14,15. Questa tecnica consente il monitoraggio non invasivo delle alterazioni emodinamiche cutanee misurando le variazioni di temperatura associate alle fluttuazioni del flusso sanguigno nei tessuti cutanei, vascolari e muscolari16, facilitando così la valutazione visiva delle alterazioni funzionali del microcircolo nei punti di agopuntura. In questo studio, la sensibilizzazione al dolore ai punti di agopuntura GB34 e ST36 è stata convalidata per la prima volta utilizzando un algometro elettronico, seguita dall'applicazione combinata di colorazione verde veloce con safranina O, analisi IL-1β e TNF-α, imaging termografico a infrarossi e valutazioni comportamentali correlate al dolore per studiare gli effetti analgesici della stimolazione dell'elettroagopuntura ai punti di agopuntura GB34 e ST36 nei ratti osteoartritici del ginocchio indotti da iodoacetato monosodico (MIA).

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Protocollo

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Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati e rigorosamente supervisionati dal Comitato Etico Animale dell'Università di Medicina Cinese di Pechino (ID: bucm-2024091102-3197) e tutte le procedure sono state rigorosamente rispettate dalla Guida del National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. In questo studio sono stati utilizzati trenta ratti maschi di Sprague-Dawley (intervallo di peso: 210-250 g). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Animali da esperimento e gruppi

  1. Ospita gli animali nell'apposita struttura per animali.
  2. Mantenere la temperatura ambiente a 22 °C ± 2 °C, l'umidità relativa al 50%-60% e un ciclo luce/buio di 12 ore. Fornire accesso ad libitum a cibo e acqua durante lo studio.
  3. Dopo un periodo di acclimatazione di 7 giorni, dividere casualmente i ratti in cinque gruppi sperimentali (n = 6 per gruppo): gruppo di controllo normale (Con), gruppo di operazione fittizia (Sham), gruppo modello (MIA), gruppo non fisso (NF) e gruppo di elettroagopuntura (EA).

2. Definizione di un modello di KOA indotto da monoiodoacetato

  1. Metti i ratti in una camera di induzione. Anestetizzare utilizzando isoflurano al 4% nell'ossigeno per l'induzione, quindi mantenere al di sotto dell'1,5%-2,0% di isoflurano somministrato tramite una maschera facciale (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente).
  2. Fissare i ratti in decubito laterale sinistro. Rimuovere i peli con una crema depilatoria delicata sull'articolazione del ginocchio destro e sulle aree circostanti.
  3. Disinfettare l'articolazione del ginocchio destro tre volte con iodio povidone dall'interno verso l'esterno, seguita dalla ripetizione degli stessi passaggi con etanolo al 75%.
  4. Mantenere il ginocchio destro a 90° di flessione. Identificare il bordo rotuleo inferiore e la tuberosità tibiale. Far avanzare un ago da 22 G (0,7 mm × 30 mm) di 3-5 mm nello spazio articolare attraverso il bordo laterale o mediale del legamento rotuleo con un angolo di approccio cutaneo di 30°-45°. Confermare il posizionamento intra-articolare e infondere lentamente 50 μL di soluzione di MIA (1 mg/50 μL). Per i controlli fittizi, iniettare un volume equivalente di soluzione fisiologica sterile.
  5. Eseguire cinque manipolazioni passive del range di movimento per garantire una dispersione uniforme del farmaco intra-articolare. Riporta l'animale nella sua gabbia di casa per il recupero postoperatorio.

3. Procedura per la fissazione dei ratti

  1. Fissare il ratto in una guaina di ritenuta nera. Creare un'apertura circolare di 1,5 cm di diametro nel quadrante inferiore destro attraverso la quale viene esteriorizzato l'arto posteriore destro, come mostrato nella Figura 1A.
  2. Fissare le fascette in nylon accoppiate (5 mm × 300 mm), distanziate di 6,8 cm l'una dall'altra, attraverso un telaio in rete di plastica. Posizionare il sistema di ritenuta superiore nella regione ascellare e ancorare il sistema di ritenuta inferiore al cingolo pelvico, come illustrato nella Figura 1B, C, E.
    NOTA: Il gruppo NF non viene sottoposto alle procedure descritte al punto 3.2.

4. Trattamento di elettroagopuntura

  1. Iniziare l'intervento di elettroagopuntura il quarto giorno dopo un processo di fissazione consecutivo di tre giorni.
  2. Eseguire la preparazione asettica nelle regioni di agopunti GB34 e ST36. Fare riferimento alla Figura 1D per la mappatura anatomica standardizzata della superficie di questi loci.
  3. Inserire gli aghi per agopuntura sterili monouso (diametro: 0,25 mm; lunghezza: 13 mm) nei punti di agopuntura. Collegare GB34 all'anodo e ST36 al catodo secondo il protocollo di elettrostimolazione (Figura 1G).
  4. Dopo una sessione di elettroagopuntura di 20 minuti, disattivare il dispositivo. Staccare gli elettrodi dalle impugnature degli aghi e rimuovere con cura gli aghi per agopuntura per completare la procedura terapeutica. Somministrare interventi giornalieri per due settimane consecutive.
    NOTA: Ad eccezione del gruppo NF, i restanti tre gruppi non hanno ricevuto alcun trattamento, ma sono stati immobilizzati per 20 minuti al giorno allo stesso modo del gruppo EA.

5. Test della soglia di prelievo meccanico (MWT)

  1. In un ambiente silenzioso a una temperatura ambiente di 24 °C ± °C, posizionare i ratti su una piattaforma di prova del piede con un fondo in rete di acciaio inossidabile e un corpo della gabbia in plastica organica.
  2. Stimolare verticalmente l'area centrale della zampa posteriore destra o i punti di agopuntura designati utilizzando la sonda di diametro 0. mm del rilevatore di dolore elettronico Electric Von Frey. Aumentare gradualmente e uniformemente l'intensità della stimolazione fino a quando non si osserva una risposta di evitamento del ritiro della zampa. Registrare il valore visualizzato in questo momento come soglia di prelievo meccanico.
    NOTA: Ogni ratto viene misurato una volta a intervalli di 10 minuti, con la media di tre prove consecutive designata come risultato finale.

6. Test della latenza di prelievo della zampa (PWL)

  1. Acclimatare i ratti sulla piattaforma termica per 5 minuti prima della valutazione formale.
  2. Mantenere la temperatura della superficie della piattaforma a 55,0 °C ± 0,C durante il test. Iniziare il cronometraggio quando la zampa posteriore destra tocca la superficie riscaldata e interrompere il cronometraggio dopo aver osservato la prima reazione positiva (leccarsi le zampe, saltare o ritirarsi rapidamente). Definisci la durata registrata come PWL.
    NOTA: Eseguire misurazioni in triplicato per ratto con intervalli di prova intermedi di 5 minuti. Calcola il valore medio come PWL rappresentativo.

7. Imaging termico a infrarossi

NOTA: Depilare gli arti posteriori il giorno prima della termografia per eliminare l'influenza dei peli sulla misurazione della temperatura.

  1. Mantenere le condizioni sperimentali a una temperatura ambiente di 2 °C con un'umidità relativa del 60% in condizioni di illuminazione diffusa e attenuata dal suono.
  2. Trattieni il ratto in un manicotto di ritenuta nero con l'arto posteriore destro esteso attraverso un foro circolare. Posizionare sul tavolo operatorio per 10 min.
    NOTA: Se il ratto non si calma dopo 10 minuti, prolungare il tempo di attesa fino a quando non diventa tranquillo prima di procedere al passaggio successivo.
  3. Acquisizione di immagini termiche dell'articolazione del ginocchio laterale e ventrale utilizzando la termocamera a una distanza di 5 cm, configurata a emissività di 0,97, frame rate di 9 Hz e risoluzione IR di 160 × 120 pixel.
  4. Elaborare i dati termografici a infrarossi acquisiti utilizzando un software analitico dedicato per consentire una quantificazione precisa dei parametri termici attraverso l'analisi spettrale computerizzata.

8. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)

  1. Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione di uretano al 20% (1,2 g/kg). Aprire la cavità addominale e inserire l'ago per il prelievo di sangue nell'aorta addominale. Inserire l'estremità dell'ago in un recipiente di raccolta del sangue sottovuoto senza anticoagulante.
  2. Lasciare coagulare i campioni di sangue per 30 minuti. Centrifugare a 1006. x g per 15 min a °C. Quantificare i livelli sierici di proteine utilizzando il test BCA.
  3. Misurare le concentrazioni di IL-1β e TNF-α utilizzando kit ELISA commerciali secondo i protocolli del produttore.

9. Colorazione verde rapida con safranina

NOTA: Dopo il prelievo di sangue dell'aorta addominale, asportare l'articolazione del ginocchio destro utilizzando le forbici chirurgiche, preservando segmenti osteoarticolari di 1 mm sia del femore prossimale che della tibia distale. Sbrigliare con cura i tessuti molli periarticolari.

  1. Immergere le articolazioni del ginocchio in paraformaldeide al 4% (PFA) per 72 ore. Risciacquare abbondantemente con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) agitando delicatamente per garantire la completa rimozione del PFA.
  2. Immergere i campioni nella soluzione di decalcificazione dell'acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) a °C per 4 settimane. Sostituire la soluzione EDTA ogni 2 giorni. Bucherellare leggermente il tessuto con un ago; L'assenza di resistenza indica il completamento della decalcificazione. Sciacquare i campioni decalcificati con PBS per 4-6 ore per rimuovere l'EDTA residuo.
  3. Disidratare i campioni utilizzando un disidratatore automatico. Incorporare in paraffina e lasciare solidificare in blocchi rigidi. Sezionare i blocchi inclusi in paraffina utilizzando un microtomo per ottenere fette di 4 μm di spessore. Trasferire le fette a bagnomaria. Una volta espanso, recupera le sezioni e posizionale su vetrini. Asciugare in camera a temperatura controllata per 12 h.
  4. Posizionare i vetrini nello xilene (I) per 10 minuti e nello xilene (II) per altri 10 minuti. Immergere in sequenza in etanolo anidro (I), etanolo anidro (II), etanolo al 90% ed etanolo al 75% per 5 minuti ciascuno. Risciacquare con acqua ultrapura.
  5. Colorare i vetrini con la soluzione Fast Green per 2 min. Sciacquare sotto l'acqua del rubinetto fino a quando la cartilagine appare vetrosa e trasparente con lacune chiaramente visibili all'osservazione microscopica. Differenziare in soluzione di acido acetico all'1% per 10 s, monitorando fino alla completa rimozione della tinta blu residua. Risciacquare immediatamente con acqua ultrapura.
  6. La colorazione scivola con la soluzione di Safranina O per 15 minuti fino a quando la matrice cartilaginea mostra una colorazione rosso rubino uniforme e intensa, mentre il tessuto osseo appare rosa pallido.
  7. Immergere i vetrini in sequenza in etanolo anidro (I), (II), III e (IV) per 10 s ciascuno. Immergere nello xilene (I) e nello xilene (II) appena preparati per 10 minuti ciascuno.
  8. Rimuovere i vetrini e applicare la resina neutra sulla superficie del vetrino, evitando accuratamente il contatto con i tessuti. Posizionare il bordo del vetrino coprioggetti sul vetrino e abbassarlo lentamente per evitare la formazione di bolle. Elimina lo xilene e la resina in eccesso. Scivoli asciutti all'aria per una notte a temperatura ambiente. Posizionare le sezioni essiccate sotto un microscopio ottico per l'imaging.

10. Analisi statistica

  1. Utilizza il software SPSS per l'analisi statistica. Esprimere i dati come media ± deviazione standard.
  2. Analizza i dati MWT e PWL utilizzando ANOVA a misure ripetute. Confrontare altri set di dati tra gruppi utilizzando l'ANOVA unidirezionale.
  3. Esprimi i risultati come media ± deviazione standard (SD). Definisci la significatività statistica come p < 0,05.

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Risultati

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Nessun animale è morto durante l'intero esperimento. I risultati della durata della procedura operatoria e del conteggio del distacco dell'ago per ciascun ratto in entrambi i gruppi NF ed EA hanno indicato che il gruppo EA, a seguito di restrizione con fascette in nylon, ha sperimentato una riduzione del tempo operativo e un minor numero di distacchi dell'ago (P < 0,001; Figura 1H, I). L'analisi delle soglie del dolore dei punti di agopuntura non ha rivelato diff...

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Discussione

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MIA, un inibitore metabolico, interrompe selettivamente la glicolisi aerobica cellulare, inducendo così l'apoptosi dei condrociti 17,18,19. La somministrazione intra-articolare di MIA provoca la deplezione dei condrociti e la successiva degenerazione della cartilagine articolare, caratterizzata da irregolarità morfologiche e alterazioni istopatologiche che assomigliano molto alla patologia dell'...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli autori hanno dichiarato di non avere potenziali conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata supportata dal National Key R&D Program of China (sovvenzione 2023YFC3502700) e dai Fondi per la ricerca fondamentale per le università centrali (2025-JYB-XJSJJ014)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pipettatore a volume regolabile 0-10ulServicebioIC012395160823
0-200ul Pipettatore a volume regolabileServicebioIC021029160323
Provette Eppendorf da 1,5 mlServicebioEP-150-M
Puntale per micropipetta da 10 ulServicebioTP-10
Siringa da 1 mlShanghai Zhiyu Medical Equipment Co., LTDZSQ-1
Puntale per micropipetta da 200ulServicebioTP-200
Ago calibro 22 KruuseCodice: 112416c
Provette Eppendorf da 2 mlServicebioEP-150-M
Provetta per sangue rosso da 5 mlShanghai Xinle Biotechnology Co., LTDCXG-5R
75% di alcolShandong Anjie Gaoke Disinfection Technology Co., Ltd75-500 ml
Scivolo aderenteCITOTEST188105
Lavapiatti automaticaRaytoRT-3100C
Ago per prelievo di sangueJiangxi Ruibang Industrial Group Co., LtdCXZ-07
Safranina per tessuto osseo e soluzione colorante verde solidaShanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.R32730
Vetro di coperturaCitotest Labware Manufacturing Co., LtdCodice 10212432C
DisidratatoreDIAPATHDonatello
Bilancia elettronicaMettler-ToledoME203E/02
Forno elettrotermico di essiccazioneLaboteriaGEL-70
Macchina per l'inclusioneWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Liquido trasparente decerante ecologicoServicebioG1128-1L
Rivelatore di etichette enzimaticheBioTeKEpoca
EtanoloSCRC100092683
Acido etilendiammina tetraacetico Macklin60-00-4
Batuffolo di cotone senza grassiCaoxian Hualu Materiale Sanitario Co., LtdTZMQ-500
Centrifuga refrigerata ad alta velocitàDragoD3024R
Macinatore di tessuti ad alta velocitàServicebioKZ-III-F
Analgesiometro con piastra caldaBase di KewKW-CT-1
Sistema di imagingNikonNIKON DS-U3
Termocamera a infrarossiTesto AGTesto 865
IodoforoShandong Anjie Gaoke Disinfection Technology Co., LtdDF-500
IR MorbidoTesto AG
IsofluranoScienze della vita RWDR510-22-10
Guanti in latticeBeijing Ruijing Latex Products Co., LTDRJJC-S
Dispositivo meccanico per il test di infilatura della zampaBase di KewKW-RB
MIASigma206-165-7
Gomma neutraSCRC10004160
Butanolo normaleSCRC100052190
Soluzione salina normaleSHIMENSLYS-500ml
Paraffina liquidaMacklin8012-95-1
Fissativo Paraformaldeide (Neutro)ServicebioG1101
Affettatrice patologicaShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
Ratto IL-1 beta  ELISA Kit GER0002-96tServicebioAC30253754
Kit ELISA per ratto TNF-alfa GER0004-96tServicebioAC40253711
Ratti SDBeijing Sibefei Biotechnology Co., LtdSCXK (jing) 2024-0001 
Macchina per anestesia per piccoli animali  YuYAN ABM
Mascherina chirurgicavincitoreWJKZ-1
Divaricatore per tessutiZhejiang Kehua Instrument Co., Ltd KD-P
Sistema di lucidatura ad acqua ultrapuraAiken acqua ElAK-RO-C2
Microscopio ottico verticaleNikonNIKON ECLIPSE E100
UretanoMacklin2621-79-6
Miscelatore a vorticeServicebioMV-100
XileneSCRC10023418

Riferimenti

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