Una procedura flessibile per l'esecuzione della FISH dei telomeri e dell'immunofluorescenza nelle cellule che esprimono proteine fluorescenti

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per combinare la FISH dei telomeri (nativa o denaturante) con l'immunofluorescenza e/o la visualizzazione di una proteina fluorescente.

Abstract

La visualizzazione dei telomeri utilizzando l'ibridazione in situ a fluorescenza (TelFISH) è stata a lungo uno strumento essenziale negli esperimenti di biologia dei telomeri. La combinazione di TelFISH con l'immunofluorescenza (IF) è anche un metodo consolidato (IF-TelFISH), ad esempio, nell'identificazione dei focolai indotti dalla disfunzione dei telomeri, in cui i telomeri co-localizzano con 53BP1. Più recentemente, il telomero nativo FISH (nTelFISH) è diventato uno strumento importante per il dosaggio dell'allungamento alternativo dei telomeri, un meccanismo di mantenimento dei telomeri utilizzato in alcune cellule tumorali. L'espressione di proteine fluorescenti è anche uno strumento essenziale nella biologia cellulare, consentendo la visualizzazione di proteine e strutture che potrebbero rimanere non rilevabili con altri metodi. Poiché i tamponi FISH denaturano le proteine, l'esecuzione del test in cellule con una proteina fluorescente espressa (FP) provoca la perdita del segnale FP. Qui viene descritto un metodo per integrare IF e FISH dei telomeri in cellule con una proteina fluorescente espressa che preserva il segnale FP anche dopo FISH. Vengono fornite alternative per la FISH denaturante e dei telomeri nativi in combinazione con diversi scenari IF e FP. Nel complesso, questo protocollo offre un quadro flessibile per esplorare la biologia dei telomeri sia nelle cellule normali che in quelle tumorali.

Introduzione

Gli organismi con cromosomi lineari devono fare i conti con due problemi. In primo luogo, a causa del problema della replicazione finale, le estremità dei cromosomi si erodono leggermente ogni volta che il DNA viene replicato. In secondo luogo, le cellule devono essere in grado di distinguere le estremità naturali del DNA dalle rotture del DNA. I telomeri si sono evoluti come soluzione a questi problemi. Attraverso l'azione della ribonucleoproteina telomerasi, i cromosomi vengono allungati mediante l'aggiunta di brevi ripetizioni tandem-TTAGGG nell'uomo. Queste ripetizioni sono legate dal complesso shelterin, che nasconde l'estremità del cromosoma dal meccanismo di riparazione dei danni al DNA cellulare¹. I telomeri corti o disfunzionali portano alla senescenza cellulare e all'invecchiamento dei fenotipi², mentre la fuga dalla crisi dei telomeri è una pietra miliare nella tumorigenesi³. Per questi motivi, la biologia dei telomeri è di particolare interesse per comprendere la salute e la malattia umana.

L'ibridazione fluorescente in situ dei telomeri (FISH) è stata a lungo un metodo importante per visualizzare i telomeri nelle cellule interfase o nelle diffuse di metafase⁴. Per decenni, la FISH dei telomeri è stata accoppiata con la colorazione in immunofluorescenza (IF) 53BP1 per identificare i focolai indotti dalla disfunzione dei telomeri (TIF), un marcatore di telomeri disfunzionali e non tappati ^5,6. Allo stesso modo, un segno distintivo dei tumori che utilizzano l'allungamento alternativo dei telomeri (ALT) per il mantenimento dei telomeri è l'associazione dei telomeri con i corpi PML nucleari per formare corpi PML associati ad ALT o APB⁷. Gli APB possono essere analizzati accoppiando i telomeri FISH con la colorazione PML IF. Pertanto, IF-FISH è uno strumento ben consolidato nella biologia dei telomeri.

In questo caso, l'uso di IF-FISH è stato esteso in due modi. In primo luogo, l'IF-FISH viene eseguito su cellule con proteine fluorescenti (FP) espresse. L'espressione di proteine marcate in fluorescenza è diventata uno strumento onnipresente nella biologia cellulare. L'espressione di una proteina marcata può essere l'unica opzione per visualizzare una proteina per la quale non esistono buoni anticorpi. Ad esempio, il cromocorpo dell'actina nucleare marcato con GFP espresso (nAC-GFP) rivela la dinamica dell'actina nucleare⁸. Questo reagente ha aperto nuove opportunità nell'esplorazione della f-actina nucleare, che un tempo era considerata un argomento controverso. Mentre gli FP come GFP e mCherry mantengono tipicamente l'attività di fluorescenza dopo la fissazione, la formammide nei tamponi di ibridazione FISH li renderà scuri⁹. Per aggirare questo problema, questo protocollo offre l'innovazione di un "booster" anti-FP marcato con fluoroforo nella fase secondaria della colorazione IF. La luminosità del fluoroforo non è influenzata dalla formammide, consentendo IF-FP-FISH.

In secondo luogo, l'IF viene eseguita in combinazione con il FISH dei telomeri nativi (nTelFISH), un importante diagnostico per lo stato di ALT. Nella denaturazione della FISH, è necessario utilizzare un metodo per fondere i filamenti di DNA¹⁰ (ad esempio, calore o alcali), consentendo l'accesso della sonda al DNA che normalmente è a doppio filamento. Al contrario, la FISH nativa non include una fase di denaturazione, quindi la sonda può accedere solo al DNA che è già a filamento singolo. Il telomero nativo FISH rileva specificamente le ripetizioni dei telomeri del filamento C a filamento singolo, un altro segno distintivo dell'ALT nelle cellule tumorali^11,12. L'accoppiamento di questo test con la colorazione IF-FP ci consente di affrontare nuove domande nella comprensione del meccanismo dell'ALT, che è ora considerato un forte candidato per terapie tumorali mirate.

Il protocollo qui descritto può essere utilizzato in uno stile "scegli la tua avventura" per colorare qualsiasi combinazione di IF, FP e telomeri nativi o denaturanti FISH. Poiché il protocollo è altamente configurabile, la temporizzazione può variare in modo sostanziale. In generale, il tempo pratico è richiesto per quattro giorni, ma questi giorni potrebbero non essere sequenziali. Le stime del tempo necessario per completare un tipico flusso di lavoro FISH di denaturazione sono riportate nella Figura 1. I FISH nativi non devono essere ibridati da un giorno all'altro, quindi si può potenzialmente eliminare un passaggio notturno (combinando il Giorno 2 e il Giorno 3) se è possibile una lunga giornata al banco.

Un tipico microscopio confocale è in grado di eseguire l'imaging di quattro canali di colore: in parole povere, blu, verde, rosso e rosso lontano. Vengono dimostrati quattro esempi di potenziali combinazioni di quattro colori, ma le potenziali permutazioni sono infinite. È possibile utilizzare due anticorpi IF o due FP espressi con uguale successo. Il protocollo è semplice e robusto. Qualsiasi anticorpo che produca buoni risultati di digiuno intermittente da solo è adatto. Mentre qui sono incluse solo le sonde dei telomeri per la FISH, anche la denaturazione della FISH con una sonda del centromero produce buoni risultati. Pertanto, questo protocollo offre un ampio grado di flessibilità per rispondere a domande importanti in biologia nucleare.

Protocollo

Prima di iniziare, considera il microscopio, la linea cellulare che esprime FP e le sonde e gli anticorpi disponibili. Il blu è tipicamente usato per una colorazione del DNA come il DAPI, poiché i fluorofori blu generalmente non sono brillanti. Se necessario, possono essere utilizzati anticorpi secondari blu. Se le cellule esprimono GFP, può essere utilizzata una sonda FISH marcata con un fluoroforo rosso insieme a un anticorpo secondario per IF marcato con AF-647. In alternativa, per l'imaging delle cellule che esprimono mCherry, può essere selezionato un anticorpo secondario IF marcato con AF-488 e una sonda FISH marcata con AF-647. Esempi di quattro possibili combinazioni IF-FP-FISH sono mostrati nella Figura 2 e sono intesi come guida per incoraggiare la flessibilità della progettazione sperimentale. È importante scegliere FISH autoctono o denaturante, poiché questi metodi non possono essere combinati. Qui è incluso un metodo affidabile per i vetrini coprioggetti con lavaggio acido per consentire l'aderenza cellulare. Questo può essere completato in qualsiasi momento prima dell'uso e i vetrini coprioggetti sterili possono essere conservati a tempo indeterminato. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Lavaggio acido dei vetrini coprioggetti

NOTA: I vetrini coprioggetti devono essere puliti e lavati con acido per consentire l'adesione delle cellule in coltura. Per la crescita in piastre a 12 pozzetti, i vetrini coprioggetti rotondi da 18 mm sono l'ideale. Consultare la struttura centrale di microscopia per determinare se sono preferiti i vetrini coprioggetti #1 o #1.5. I tempi indicati per la pulizia dei vetrini coprioggetti non sono critici, ma non lesinare sul lavaggio acido.

1. Utilizzare una pinza per vetrini coprioggetti (Figura 3A) per posizionare i vetrini coprioggetti nelle rastrelliere in modo che le loro superfici non si tocchino. Posizionare i vetrini coprioggetti aggiuntivi in diagonale per aumentare la capacità, se necessario (Figura 3B). Inserire comodamente più griglie nella vaschetta di colorazione (Figura 3C).
2. Riempi la vaschetta per la colorazione con acqua e una piccola quantità di detersivo. Abbassare delicatamente le griglie con i vetrini coprioggetti nella pirofila.
3. Agitare i vetrini coprioggetti nell'acqua saponata per 30 minuti utilizzando un bilanciere o un nutator.
4. Sollevare i rack dei vetrini coprioggetti dalla vaschetta di colorazione. Smaltire l'acqua saponata.
5. Sciacquare la vaschetta per la colorazione e riempirla con acqua deionizzata. Rimetti le rastrelliere di vetrini coprioggetti nell'acqua pulita e posizionale su un bilanciere per agitare delicatamente per 5 minuti.
6. Ripetere il risciacquo con altri due cambi di acqua deionizzata pulita, per un totale di tre risciacqui.
7. Sollevare i rack dei vetrini coprioggetti dalla vaschetta di colorazione. Aggiungere 1 N di HCl al piatto.
   ATTENZIONE: L'HCl è caustico. Maneggiare in una cappa aspirante e utilizzare dispositivi di protezione individuale. Abbassare con cautela i vetrini coprioggetti travasati nella soluzione acida. Assicurarsi che l'HCl 1 N copra completamente i vetrini. Metti il coperchio sulla vaschetta per colorare.
8. Posizionare la vaschetta di colorazione contenente i vetrini coprioggetti e la soluzione acida nel serbatoio di un sonicatore da bagno. Sonicare per 15 minuti a 55 °C.
9. Lasciare i vetrini coprioggetti nel bagno acido per una notte.
10. Rimuovere con cautela i vetrini coprioggetti dalla vaschetta per la colorazione il giorno successivo. Smaltire l'HCl 1 N secondo i protocolli di sicurezza istituzionali.
11. Sciacquare la vaschetta per la colorazione e riempirla con acqua deionizzata. Rimetti le rastrelliere di vetrini coprioggetti nell'acqua pulita e posizionale su un bilanciere per agitare delicatamente per 5 minuti.
12. Ripetere il risciacquo con altri due cambi di acqua deionizzata pulita, per un totale di tre risciacqui.
13. Sollevare i rack dei vetrini coprioggetti dalla vaschetta di colorazione. Svuotare il piatto e riempirlo con etanolo al 70%. Rimettere i vetrini coprioggetti nel piatto e agitare delicatamente per 5 minuti.
14. Sollevare i rack dei vetrini coprioggetti dalla vaschetta di colorazione. Svuotare il piatto e riempirlo con etanolo al 100%. Rimettere i vetrini coprioggetti nel piatto e agitare delicatamente per 5 minuti.
15. Portare la piastra con etanolo al 100% e i vetrini coprioggetti in una cappa di coltura tissutale. Nella cappa, rimuovere le griglie dei vetrini coprioggetti dal piatto e lasciarli asciugare all'aria.
16. Svuotare il piatto e rimettervi i vetrini coprioggetti. Conservare con il coperchio per mantenere la sterilità. La vaschetta per la colorazione non è ermetica; Se i vetrini coprioggetti vengono lasciati nell'etanolo, alla fine evaporerà. I vetrini coprioggetti rimarranno utilizzabili.

2. Celle di placcatura su vetrini coprioggetti

NOTA: La manipolazione dei vetrini coprioggetti richiede pratica. È più facile iniziare con una piastra a 6 pozzetti fino a quando non si è sicuri. Quando si utilizza una piastra a 6 pozzetti, raddoppiare i volumi di lavaggio indicati per le piastre a 12 pozzetti.

1. Colture di cellule sane e in crescita che esprimono la proteina di interesse marcate con GFP o mCherry (sono adatti diversi FP rossi o verdi; vedere le note nella Tabella dei materiali). Negli esempi mostrati vengono utilizzate le cellule di osteosarcoma U2OS, che utilizzano ALT per il mantenimento dei telomeri.
   1. Utilizzare cellule o linee cellulari trasfettate transitoriamente con espressione stabile di FP. Se l'esperimento richiede un trattamento farmacologico o una trasfezione, considerare la confluenza desiderata alla fissazione (in genere 70%-80%), la durata del trattamento e il tasso di crescita cellulare per calcolare il numero appropriato di cellule da placcare per vetrino coprioggetti.
2. Preparare i vetrini coprioggetti nel cappuccio di coltura tissutale per mantenere la sterilità. A ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti, aggiungere 1 mL di PBS sterile. Usando una pinza per vetrini, posizionare un vetrino coprioggetti pulito e lavato con acido in ogni pozzetto. Agitare delicatamente a mano per qualche secondo.
3. Aspirare PBS. Aggiungere 1 mL di PBS sterile fresco per pozzetto. Mettere da parte il piatto.
4. (Facoltativo) Rivestire i vetrini coprioggetti con fibronectina per migliorare l'adesione cellulare. Molte linee cellulari aderenti aderiscono bene ai vetrini coprioggetti lavati con acido se piastrate per almeno 18 ore prima della fissazione. Se le cellule non aderiscono bene o richiedono il fissaggio subito dopo la placcatura, rivestire i vetrini coprioggetti per favorire l'adesione.
   1. Preparare una soluzione da 5 μg/mL di fibronectina in PBS sterile.
   2. Aspirare il PBS dai vetrini. Applicare delicatamente circa 300 μl di soluzione di fibronectina su ciascun vetrino coprioggetti, formando una gocciolina trattenuta dalla tensione superficiale.
   3. Incubare per diverse ore a 37 °C o per una notte a 4 °C.
   4. Sciacquare più volte con PBS, trattenendo i vetrini coprioggetti in un ultimo cambio di PBS. Mettere da parte il piatto mentre si preparano le celle.
   5. Se la fibronectina non è adatta, considera la poli-L-lisina, il collagene o la gelatina come alternative.
5. Tripsinizzare le cellule e diluirne un numero appropriato in 12 mL di terreno di coltura in base al disegno sperimentale e alla densità cellulare desiderata al momento della fissazione.
6. Aspirare il PBS dai vetrini coprioggetti e aggiungere 1 mL di sospensione cellulare per pozzetto.
7. Posizionare le cellule nell'incubatore.
8. Trattare le cellule secondo necessità con farmaci, siRNA o altri reagenti secondo il disegno sperimentale. Cresci fino alla confluenza desiderata.

3. Colorazione IF-FP

NOTA: Durante tutto il protocollo, non lasciare che i vetrini coprioggetti si secchino. Si consiglia di pipettare con una mano e aspirare le soluzioni con l'altra in modo che i vetrini coprioggetti rimangano fuori dalla soluzione per il minor tempo possibile. Pipettare delicatamente le soluzioni contro la parete del pozzetto, non direttamente sul vetrino coprioggetti. Maneggiare i vetrini coprioggetti con fermezza ma delicatamente con una pinza. È facile rompere un vetrino coprioggetti afferrandolo con troppa forza. All'inizio, pianifica i vetrini coprioggetti duplicati in caso di rottura. Con l'esperienza, i vetrini coprioggetti rotti diventano un evento raro. I vetrini coprioggetti non possono essere raccolti da un pozzo asciutto. I vetrini coprioggetti devono essere coperti da tampone per essere ritirati.

1. Rimuovi i terreni e fissa le celle utilizzando il fissativo preferito. Non è necessario sciacquare le cellule prima del fissaggio. Utilizzare 1 mL per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti o 2 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti.
   1. Opzione 1: utilizzare il 4% di formaldeide nella PBS.
      ATTENZIONE: La formaldeide è tossica. Maneggiare con i guanti e smaltire correttamente. Preparare fresco utilizzando il 16% di formaldeide priva di metanolo e 10 volte il brodo PBS. Fissare per 15 min a temperatura ambiente.
   2. Opzione 2: utilizzare il 4% di formaldeide nel tampone citoscheletro con saccarosio (CBS).
      NOTA: Questo tampone è preferito per preservare la struttura del citoscheletro¹³. La CBS ha una concentrazione finale di 10 mM MES pH 6,1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 2 mM EGTA e 0,32 M di saccarosio. Per preparare il fissativo, creare un 2x CBS stock con 20 mM MES pH 6.1, 276 mM KCl, 6 mM MgCl₂, 4 mM EGTA. Preparare una scorta separata da 1,28 M di saccarosio. Conservare entrambi i brodi a 4 °C. Per il fissativo fresco di lavoro, miscelare 1 volume di formaldeide priva di metanolo al 16%, 1 volume di saccarosio e 2 volumi 2x CBS. Fissare per 15 min a temperatura ambiente.
   3. Opzione 3: Fissare con metanolo a -20 °C. Raccomandato per bersagli anticorpali degli acidi nucleici (ad es. ssDNA, G-quadruplex, ibridi RNA-DNA). Fissare per 5 min a -20 °C.
2. Aspirare il fissativo e smaltire secondo le politiche istituzionali.
3. Sciacquare più volte i vetrini coprioggetti con PBS.
   1. PUNTO DI ARRESTO: I vetrini coprioggetti fissi possono essere conservati in PBS a 4 °C per diversi giorni con una perdita di segnale minima. Per una conservazione più lunga, disidratare al 100% di etanolo (2 minuti in etanolo al 70%, 2 minuti in etanolo al 90%, conservare in etanolo al 100%), sigillare la piastra con pellicola da laboratorio e conservare a -20 °C. I vetrini coprioggetti possono essere conservati in questo modo per settimane o mesi. Quando sei pronto per la colorazione, reidrata i vetrini coprioggetti (2 minuti in etanolo al 90%, 2 minuti in etanolo al 70%, 15 minuti in PBS) e procedi con il passaggio successivo.
4. Permeabilizzare i vetrini coprioggetti in Triton X-100 allo 0,5% in PBS per 5 minuti a 4 °C. Eseguire questo passaggio nella piastra.
5. Sciacquare più volte i vetrini coprioggetti con PBS.
6. Preparare la camera umidificata (Figura 3D). Metti i tovaglioli di carta umidi sul fondo della camera. Per creare un supporto per la colorazione, etichettare la parte superiore di un coperchio da una piastra a 12 pozzetti in modo che corrisponda ai vetrini.
   1. Copri il coperchio con pellicola da laboratorio in modo che le etichette rimangano visibili. Assicurarsi che la camera sia a tenuta di luce con un coperchio aderente. Coprire con un foglio di alluminio se necessario (Figura 3E).
7. Pipettare 75 μL di gocce da 100 μg/mL di RNasi A in PBS sul supporto marcato. Raccogliere delicatamente ogni vetrino coprioggetti e tamponare il bordo del tessuto di laboratorio per rimuovere il tampone in eccesso. Capovolgere i vetrini coprioggetti sulle gocce di RNasi A (con la cellula rivolta verso il basso). Posizionare il supporto nella camera umidificata e chiudere il coperchio. Incubare per 45 minuti a 37 °C.
8. Aggiungere PBS fresco alla piastra a 12 pozzetti. Rimettere i vetrini coprioggetti sulla piastra, con la cella rivolta verso l'alto. Risciacquare più volte con PBS.
9. Bloccare per 30 minuti o più a temperatura ambiente. Pulire la soluzione di RNasi dal supporto ricoperto di pellicola. Pipettare sulla pellicola 75 μl di gocce di siero d'asina al 20% in PBS. Capovolgere i vetrini coprioggetti sul tampone di blocco (lato cella rivolto verso il basso).
10. Preparare l'anticorpo primario.
    1. Utilizzare 75 μl per vetrino coprioggetti. Preparare il 10% in più per evitare errori di pipettaggio.
    2. Diluire l'anticorpo in siero d'asina al 5%. Determinare empiricamente le diluizioni degli anticorpi. Una diluizione 1:100 è un punto di partenza ragionevole.
    3. Durante il blocco, preparare un secondo supporto etichettato per l'incubazione degli anticorpi primari. Coprire il coperchio con una pellicola e applicare 75 μL di gocce di anticorpo diluito nei punti designati.
11. Al termine della fase di blocco, trasferire i vetrini coprioggetti sulle goccioline di anticorpi (con la cellula rivolta verso il basso). Posizionare il supporto nella camera umidificata, chiudere il coperchio e incubare per almeno 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C.
12. Aggiungere PBS fresco alla piastra a 12 pozzetti. Rimettere i vetrini coprioggetti sulla piastra, con la cella rivolta verso l'alto. Lavare in PBS tre volte per 5 minuti ciascuna a temperatura ambiente con dondolo.
13. Durante il lavaggio finale, preparare gli anticorpi secondari.
    1. Utilizzare 75 μl per vetrino coprioggetti. Preparare il 10% in più per evitare errori di pipettaggio.
    2. Si raccomanda una diluizione 1:400 per gli anticorpi secondari fluorescenti e gli anticorpi booster GFP/RFP. Regola secondo necessità in base all'esperienza con l'obiettivo.
    3. Diluire gli anticorpi secondari in siero d'asino al 5%. Applicare 75 μl di gocce nei punti appropriati sul supporto etichettato.
14. Dopo il lavaggio, trasferire i vetrini coprioggetti sulle goccioline di anticorpi secondarie (con la cellula rivolta verso il basso). Incubare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente nella camera umidificata sigillata.
15. Aggiungere PBS fresco alla piastra a 12 pozzetti. Rimettere i vetrini coprioggetti sulla piastra, con la cella rivolta verso l'alto. Lavare in PBS tre volte per 5 minuti ciascuna a temperatura ambiente con dondolo.

4. Rifissaggio e disidratazione

1. Preparare il 4% di formaldeide in PBS a temperatura ambiente per la rifissazione. Utilizzare la formaldeide per questo passaggio, anche se per la fissazione iniziale è stato utilizzato metanolo. Rimuovere il lavaggio PBS finale e rifissare le celle per 15 minuti con un leggero dondolo.
2. Aspirare il fissativo e smaltirlo in conformità con le politiche istituzionali.
3. Sciacquare più volte i vetrini coprioggetti con PBS.
4. Disidratare i vetrini coprioggetti e asciugarli all'aria per prepararsi all'ibridazione:
   1. Incubare in etanolo al 70% per 2 minuti.
   2. Incubare in etanolo al 90% per 2 min.
   3. Incubare in etanolo al 100% per 2 minuti.
   4. Dopo il 100% di etanolo, posizionare i vetrini coprioggetti con la cella rivolta verso l'alto su carta da filtro etichettata per mantenere l'orientamento. Lasciarli asciugare completamente all'aria mentre si prepara la sonda FISH.

5. PESCE (OPZIONE 1): Denaturazione del PESCE

1. Preparare due supporti di alluminio (vedere la Figura 3F).
   1. Piega un pezzo di carta stagnola in quarti per creare quattro strati. Assicurarsi che il lato opaco sia rivolto verso l'esterno.
   2. Tagliare la pellicola piegata in modo che si adatti all'interno del coperchio di una piastra a 12 pozzetti. Usando un panno da laboratorio, strofina la pellicola contro l'interno del coperchio in modo che le creste del coperchio imprimano un motivo sulla pellicola. Questo creerà delle creste che impediscono ai vetrini di scivolare l'uno nell'altro durante i passaggi successivi.
   3. Prepara due di questi supporti. Possono essere cancellati e riutilizzati in esperimenti successivi.
2. Diluire la sonda da 10 μM 1:50 in tampone di ibridazione (70% di forma deionizzata, 10 mM di Tris, pH 7,4, 0,5% 10× soluzione bloccante di Roche). Utilizzare 75 μl di questa sonda diluita per vetrino coprioggetti e preparare il 10% in più per compensare la perdita di pipettaggio. La concentrazione finale della sonda deve essere di 200 nM.
3. Preriscaldare un blocco termico a 90 °C e un termociclatore a 85 °C.
4. Denaturare i vetrini: Posizionare i vetrini coprioggetti asciugati all'aria con la cella rivolta verso l'alto su uno dei supporti di alluminio preparati. Posizionare delicatamente la pellicola sul blocco termociclatore e chiudere il coperchio. Incubare per 5 minuti per denaturare.
5. Contemporaneamente, riscaldare la sonda diluita nel blocco termico a 90 °C per 5 minuti.
6. Pipettare 75 μl di gocce della sonda denaturata sul secondo supporto di lamina preparato. Assicurarsi che il lato opaco della pellicola sia rivolto verso l'alto per consentire goccioline ben formate. Se il lato lucido è rivolto verso l'alto, la sonda si diffonderà e perderà tensione superficiale.
7. Capovolgere i vetrini coprioggetti denaturati sulle gocce della sonda, posizionandoli con il lato cellulare rivolto verso il basso.
8. Trasferire il supporto di alluminio con sonda e vetrini coprioggetti nel blocco termociclatore impostato a 85 °C e incubare per 5 minuti. Usa una spatola per facilitare il trasferimento. Muoversi con cautela per evitare di urtare o spostare i vetrini.
9. Spostare la pellicola con i vetrini coprioggetti e la sonda in una camera umidificata. Coprite con il coperchio e incubate per una notte a temperatura ambiente.

6. PESCE (OPZIONE 2): PESCE autoctono

1. Diluire la sonda da 10 μM 1:200 in tampone di ibridazione (70% di forma deionizzata, 10 mM di Tris, pH 7,4, 0,5% 10× soluzione bloccante di Roche). La concentrazione finale della sonda è di 50 nM. Utilizzare 75 μl per vetrino coprioggetti e preparare il 10% in più per tenere conto dell'errore di pipettaggio.
2. Applicare 75 μL di gocce di sonda diluita nei punti designati sul supporto ricoperto di pellicola.
3. Capovolgere i vetrini coprioggetti denaturati sulle gocce da 75 μL della sonda, posizionandole con la cella rivolta verso il basso.
4. Posizionare il supporto in una camera umidificata e chiudere il coperchio. Incubare per almeno 45 minuti a temperatura ambiente. L'incubazione può essere prolungata fino alla notte, se si preferisce.

7. Lavaggio e montaggio

NOTA: Il mezzo di montaggio ottimale dipende dall'apertura numerica dell'obiettivo del microscopio. Consultare la struttura centrale di microscopia locale per le raccomandazioni. Una scelta adatta può essere ProLong Glass con NucBlue, che ha un indice di rifrazione di 1,52. Tuttavia, un mezzo di montaggio alternativo può essere più appropriato a seconda del microscopio in questione.

1. Rimettere i vetrini coprioggetti nella piastra a 12 pozzetti per il lavaggio. Capovolgili in modo che siano con il lato della cella rivolto verso l'alto.
2. Lavare 3× 10 minuti in 70% formammide/10 mM Tris, pH 7,5.
   ATTENZIONE: La formammide è tossica; disporne secondo le politiche istituzionali.
3. Lavare 3× 5 minuti in TNT (0,05 M Tris/0,15 M NaCl/0,05% Tween-20, pH 7,5).
4. Risciacquare più volte in PBS. Se una macchia di DNA non è inclusa nel mezzo di montaggio, prendi in considerazione l'aggiunta di DAPI nel lavaggio finale. Per colorare con DAPI, aggiungere 300 nM di DAPI al PBS, applicare sui vetrini coprioggetti e incubare per 5 minuti. Smaltire la soluzione DAPI secondo le linee guida istituzionali.
5. Montare i vetrini coprioggetti sui vetrini utilizzando una goccia di mezzo di montaggio. Capovolgere i vetrini coprioggetti sulla goccia: con la cella rivolta verso il basso.
6. Lasciare indurire il mezzo di montaggio durante la notte prima dell'imaging.

Risultati

I risultati tipici di questo protocollo sono mostrati nella Figura 4. Se eseguito correttamente, la morfologia cellulare sarà ben mantenuta e i segnali fluorescenti saranno luminosi. La denaturazione dei telomeri FISH dovrebbe rivelare un modello di dozzine di punti in ciascun nucleo che rappresenta ciascun telomero (vedi Figura 4, Esempi 1 e 2). I focolai dei telomeri dovrebbero essere presenti quasi esclusivamente nel nucleo, anche se a volte si verifica una colorazione citoplasmatica dei telomeri, specialmente nelle linee cellulari di ALT. I segnali dei telomeri risultanti tendono ad essere estremamente luminosi, tanto che è necessario prestare attenzione per evitare che il segnale dei telomeri si riversi in altri canali di rilevamento. Nelle linee cellulari ALT, i telomeri spesso si raggruppano in corrispondenza dei corpi PML¹⁴, con conseguente riduzione dei focolai rispetto a quanto ci si aspetterebbe normalmente. Questo clustering può essere osservato nella Figura 4, Esempio 2.

Nelle linee cellulari che utilizzano ALT per il mantenimento dei telomeri, il telomero nativo FISH rileva l'ssDNA telomerico che è un segno distintivo di ALT^11,12. Non ci si aspetta che ogni nucleo abbia ssDNA telomerorico, né che più di un piccolo numero di puncta sia presente in un singolo nucleo (vedi Figura 4, Esempi 3 e 4). Il segnale FISH dei telomeri nativi non sarà così luminoso come quello dei telomeri denaturanti FISH. La linea cellulare di osteosarcoma U2OS è un buon controllo positivo per la FISH nativa. Non ci si aspetta che i telomeri ssDNA siano osservati in linee cellulari con telomeri mantenuti dalla telomerasi.

Sia per la FISH denaturante che per quella nativa, la forte fluorescenza nucleolare è artefattuale. Se si osserva un segnale nucleolare eccessivo, provare a utilizzare una soluzione fresca di RNasi A o estendere il trattamento con RNasi A¹⁵ (fase del protocollo 3.8). Per gli esperimenti FISH sui telomeri nativi che utilizzano cellule con stato ALT sconosciuto, viene utilizzata una linea cellulare ALT positiva come U2OS per calibrare le impostazioni di rilevamento.

Le osservazioni di FP in esperimenti IF-FP-FISH possono essere facilmente confrontate con esperimenti di imaging su cellule vive per la convalida. Se si osservano discrepanze, provare a variare le condizioni di fissaggio. La fissazione nel buffer CSB (Protocol Step 3.1.2) può essere utile per preservare le strutture cellulari, rivelando una localizzazione FP più accurata¹³.

La colorazione in immunofluorescenza varia ampiamente a seconda della proteina di interesse. I risultati della IF devono essere confrontati con campioni preparati senza FISH per valutare l'impatto del protocollo FISH sulla localizzazione e l'intensità della proteina di interesse. In generale, gli esperimenti IF-FP-FISH sono adatti per il conteggio dei fuochi, ma le intensità potrebbero non essere quantitative⁶.

Figura 1: Esempio di flusso di lavoro con durate stimate. Potrebbe essere necessario un giorno aggiuntivo se l'incubazione degli anticorpi primari viene eseguita durante la notte. Nel caso della FISH nativa, i giorni 2 e 3 sono talvolta combinati, anche se ciò comporta un tempo di panchina prolungato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempi di combinazioni sperimentali di successo utilizzate con l'imaging a quattro colori. Gli esempi 1 e 2 dimostrano la denaturazione dei telomeri FISH, mentre 3 e 4 utilizzano FISH nativo. Si noti che questo protocollo è utile sia per l'immunocolorazione di due proteine bersaglio (Esempio 1), sia per la combinazione di una colorazione FP e una IF (Esempi 2 e 4) o di due FP (Esempio 3). I risultati rappresentativi di questi esperimenti sono riportati nella Figura 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Apparecchiature utilizzate in questo protocollo. (A) Pinza per vetrini. Mentre le pinze dritte possono essere utilizzate per maneggiare i vetrini, le pinze angolate per vetrini coprioggetti rendono il compito molto più semplice. (B) Vetrini coprioggetti travasati per il lavaggio. Si noti che oltre a essere travasati, i vetrini coprioggetti sono anche angolati tra le scanalature adiacenti per aumentare la capacità. (C) Quattro rastrelliere di vetrini coprioggetti in una capsula per colorare. Una lastra per la colorazione del vetro contiene dozzine di vetrini coprioggetti travasati ed è impermeabile al lavaggio acido HCl. (D) Una camera umidificata preparata. L'esterno è ricoperto di pellicola per creare un ambiente scuro, preservando i fluorofori. I tovaglioli di carta umidi sul fondo forniscono umidità. (E) La camera umidificata sigillata. Un coperchio aderente è essenziale per evitare che si secchi. (F) Realizzazione del supporto in foglio di alluminio. La goffratura delle creste sulla lamina rifilata aiuta a evitare che i vetrini scivolino l'uno nell'altro durante la fase di denaturazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati rappresentativi di esperimenti di imaging a quattro canali, inclusi IF, FISH e FP espressi. I pannelli illustrano i risultati effettivi degli esperimenti descritti nella Figura 2. DAPI colora il DNA, nAC-GFP evidenzia la f-actina nucleare, TelFISH e TRF2-mCherry marcano i telomeri, l'immunocolorazione PML contrassegna i corpi PML nucleari e nTelFISH rivela l'ssDNA telomerico. Tutte le cellule sono cellule di osteosarcoma U2OS. Le immagini sono state acquisite su un microscopio confocale con capacità di super-risoluzione. Esempio 1: le immagini sono state acquisite con microscopia confocale a scansione laser; tutte le altre immagini sono state acquisite con microscopia ad illuminazione strutturata. Tutte le barre della scala rappresentano 5 μM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Gli esperimenti che utilizzano IF-FISH sono stati a lungo un pilastro nel campo dei telomeri come test per lo stress dei telomeri o per la rilevazione di ALT ^5,6,16. Qui, il protocollo viene esteso per includere una proteina fluorescente. Inoltre, l'opzione del telomero nativo FISH è offerta come saggio ALT ortogonale¹¹. Questo protocollo è semplice da eseguire e produce risultati soddisfacenti in modo affidabile.

Operando su vetrini coprioggetti con goccioline di anticorpi o sonde PNA, questo protocollo è progettato per essere parsimonioso. L'uso delle goccioline consente di conservare preziosi reagenti. Al contrario, alternative come le guide camerate sono costose e offrono meno flessibilità. Mentre la gestione dei vetrini coprioggetti richiede pratica per sviluppare competenza, i risparmi sui costi rendono l'investimento di tempo utile. Va notato che le goccioline di reagente più grandi di 75 μl non sono raccomandate. Le goccioline più grandi fanno semplicemente scivolare i vetrini coprioggetti e non migliorano i risultati.

L'espressione di nAC-GFP è uno strumento indispensabile per la visualizzazione della f-actina⁸ nucleare, come si vede in Figura 4. Esistono molti altri reagenti marcati che possono aiutare a rispondere a importanti domande biologiche. Ad esempio, il sistema plasmidico FUCCI può essere utilizzato per visualizzare il ciclo cellulare e l'utilizzo di questo protocollo potrebbe essere combinato con il telomero FISH¹⁷. Un approccio diverso all'analisi del ciclo cellulare potrebbe utilizzare il cromocorpo PCNA per ottenere informazioni sul ciclo cellulare¹⁸. A seconda della domanda posta, sono disponibili in commercio molti reagenti marcati con FP.

Qui, questo protocollo è dimostrato con i telomeri FISH, ma risultati positivi sono stati ottenuti anche con il centromero FISH, utilizzando una sonda PNA alla stessa concentrazione. Ad esempio, è possibile multiplexare una sonda centromero marcata con FAM con una sonda telomero marcata con Cy3. È importante sottolineare che è improbabile che il protocollo funzioni con la FISH DNA a locus singolo. Per sondare un singolo locus, è necessaria la digestione con proteasi del campione, e questa digestione è chiaramente incompatibile con il rilevamento di IF o FP¹⁹. Tuttavia, è stato raggiunto un successo combinando IF e mRNA FISH con un approccio simile; ovviamente, la fase di trattamento con RNasi deve essere omessa in questo scenario.

Infine, è evidente che il telomero nativo FISH sta rapidamente diventando un saggio essenziale per lo stato ALT ^20,21. A differenza del saggio del cerchio C per l'ALT, che è basato sulla popolazione²², il telomero nativo FISH fornisce una lettura dell'ALT a livello cellulare, consentendo il rilevamento sensibile dei cambiamenti nella dinamica dell'ALT. Unendo i telomeri nativi FISH con l'espressione di IF e FP, è possibile rivelare importanti informazioni sul meccanismo ALT. Col tempo, speriamo che queste intuizioni portino a terapie mirate per i tumori che si basano sull'ALT per il mantenimento dei telomeri.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10 % Interpolazione-20 anni	Bio-Rad	1610781	Scartare se la soluzione è torbida.
10x PBS	Gibco	70011044	Per la preparazione di fissativi e altri tamponi utilizzare la post-fissazione
Piastre per colture cellulari a 12 pozzetti	Nunc	150628
16% di formaldeide senza metanolo	Termo Scientifc	28908
5 M di cloruro di sodio	Millipore Sigma	S6546
Cellule aderenti, ad es. cellule di osteosarcoma U2OS	ATCC	HTB-96
Scatola ermetica per camera umidificata	Mepal	106415032500	Qualsiasi scatola ermetica adatta funzionerà, ma fai attenzione alle scatole con fondo irregolare.
Alconox	Millipore Sigma	Z742914
Alluminio	Fisher Scientifico	01-213-100
Terreno di coltura cellulare appropriato, ad es. 5A di McCoy	Gibco	16600082	per U2OS, aggiungere il 15% di FBS
Sonda centromero (FAM)	Biografia PNA	F3001	Sono disponibili diversi fluorofori
Plasmide nucleare di actina-cromocorpi ChromoTek (TagGFP)	Proteintech	ACG-N
Forcer vetrino coprioggetto	Strumenti per la scienza	11251-33
Rastrelliere per vetrini coprioggetti	Millipore Sigma	Z688568
DAPI	Invitrogen	D21490	Opzionale, nel caso in cui il supporto di montaggio non contenga una macchia di DNA
Siero d'asino	Jackson Immunoresearch	017-000-121
EGTA	Bio-Mondo	40520008	Soluzione 0,5 M pH 8,0
etanolo	Warner-Graham	Fondo Specchio 200
Siero fetale bovino	Gibco	A5670801
Fibronectina	Millipore Sigma	F0635	Per il rivestimento opzionale dei vetrini coprioggetti
di formammide	Millipore Sigma	47671-250ML-F
Vetrini coprioggetti tedeschi	Strumenti Warner	64-0714	CS-18R15 (spessore #1,5, conferma che è appropriato per il tuo microscopio)
GFP Booster	Proteintech	gb2AF488	riconosce GFP/mClover/YFP/Venus e altri. Per un elenco completo, consulta le informazioni sul prodotto
Piatto colorante in vetro con coperchio	Millipore Sigma	900203
Pulitore ad ultrasuoni riscaldato con timer digitale	Branson	CPX-952-218R	Questo modello di sonicatore da bagno include il calore ma non ha una potenza o un'intensità configurabili.
Acido cloridrico	Millipore Sigma	258148	L'HCl concentrato è 12 N. Aggiungere 20 mL di HCl concentrato a 220 mL di acqua deionizzata per 1 N di HCl
Soluzione di cloruro di magnesio	Millipore Sigma	63069	Soluzione 1 M
MES	Millipore Sigma	475893
metanolo	Millipore Sigma	179337
Parafilm	Stati Uniti d'America Scientific	3023-4526
Cloruro di potassio	Millipore Sigma	P9541
anticorpo primario  mouse anti-PML	Santa Cruz	SC-377390
anticorpo primario  coniglio anti-53BP1	Novus	NB100-904
anticorpo primario  coniglio anti-PML	ABclonale	A1184
Prolunga il vetro con NucBlue	Invitrogen	P36981
RFP Booster	Proteintech	rb2AF568	riconosce mRFP/mCherry/mKate2/mPlum.  Per un elenco completo, consulta le informazioni sul prodotto
RNAsi A	Millipore Sigma	RNASEA-RO
Soluzione bloccante di Roche	Millipore Sigma	11096176001
anticorpo secondario, ad es. AF488 anti-topo	Invitrogen	A-11001	O simili
anticorpo secondario, ad esempio AF594 anti-coniglio	Invitrogen	A-11012	O simili
anticorpo secondario, ad es. AF647 anti-topo	Invitrogen	Codice A-21235	O simili
spatola	Fisher Scientifico	10257402
Sterile PBS	Gibco	14190144	Per la preparazione dei vetrini coprioggetti
saccarosio	Millipore Sigma	S0389
Sonda TelC (Cy3)	Biografia PNA	F1002	Sono disponibili diversi fluorofori
Sonda TelG (AF647)	Biografia PNA	F1014	Sono disponibili diversi fluorofori
Tris Base	Millipore Sigma	648311	Preparare 1 M di soluzione in acqua, regolare il pH con HCl
tritone X-100	Millipore Sigma	X100
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo	Gibco	25200072
Microscopio Zeiss Elyra	Zeiss		O simili