Method Article

Saggio di splicing massivamente parallelo per esaminare gli errori di splicing causati da varianti introniche correlate alla malattia

DOI:

10.3791/68984

⸱

September 9th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 2Genome and Systems Biology Degree Program, Academia Sinica and National Taiwan University, 3Institute of Statistical Science, Academia Sinica

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'esecuzione di saggi di splicing massivamente parallelo (MaPSy), che impiegano costrutti minigenici per valutare sistematicamente varianti introniche in massa. Questo approccio consente l'analisi ad alto rendimento dei cambiamenti di splicing indotti da varianti nelle cellule attraverso il sequenziamento dell'amplicona, fornendo valutazioni funzionali del loro impatto sullo splicing pre-mRNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli errori di splicing rappresentano il 10-30% delle mutazioni patogene responsabili di malattie genetiche rare. Lo splicing dell'RNA garantisce una corretta espressione genica unendo selettivamente gli esoni e rimuovendo gli introni, con le sequenze regolatorie chiave che si trovano all'interno degli introni. Il sito di splicing 5' e il sito di branca interagiscono con piccoli RNA nucleari per formare il complesso di riconoscimento dello spliceosoma, mentre elementi come il tratto polipirimidinico e gli enhancer/silenziatori di splicing reclutano proteine per regolare l'assemblaggio dello spliceosoma. Prevedere le interruzioni dello splicing da varianti introniche è difficile a causa della complessità di queste interazioni.

Le varianti introniche, che comprendono il 90% delle variazioni genetiche umane naturali, possono interrompere lo splicing canonico e dare origine a malattie. Per studiare questa possibilità, abbiamo sviluppato un saggio di splicing massivamente parallelo (MaPSy) per valutare le varianti introniche identificate dal paziente. Gli oligonucleotidi sintetizzati con sequenze di riferimento o varianti sono stati legati in minigeni di splicing contenenti segnali di promotore e poliadenilazione. Ogni costrutto includeva due esoni costanti che fiancheggiavano un esone medio che ospitava la sequenza di giunzione introne-esone variabile di interesse. L'efficienza di splicing cellulare delle sequenze di varianti è stata confrontata con le controparti di riferimento, permettendoci di identificare interruzioni significative come varianti di splicing.

I risultati del MaPSy possono essere convalidati attraverso approcci aggiuntivi, come saggi minigenici o editing genomico mediato da CRISPR in vivo. Inoltre, l'analisi aggregata delle giunzioni interrotte può fornire informazioni più approfondite sui meccanismi di splicing e sulle basi molecolari delle malattie associate agli errori di splicing.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo splicing dell'RNA è un processo cruciale che unisce gli esoni per la traduzione e rimuove gli introni, facilitando l'esportazione dell'RNA e mantenendo l'omeostasi degli acidi nucleici. Questo meccanismo, strettamente regolato, opera in modo temporale e spaziale, contribuendo alla diversità e alla complessità del trascrittoma1. Lo splicing è guidato da segnali chiave, tra cui il sito di splicing 5' (5'ss), il sito di branca e il sito di splicing 3' (3'ss), insieme a ulteriori elementi regolatori come il tratto polipirimidinico a valle del sito di branca e la zona di esclusione del dinucleotide AG, che aiutano nel riconoscimento 2'sdi 3's. Meccanicisticamente, il piccolo RNA nucleare U1 (snRNA) si accoppia con i 5, mentre il sito di branca interagisce con l'U2 snRNA3. L'attività coordinata del sito di branca, del tratto polipirimidinico e dei 3 facilita il legame delle piccole nucleoproteine U2 (snRNP) e dei fattori ausiliari U2, stabilizzando lo spliceosoma e posizionando il punto di ramificazione per l'attacco nucleofilo sui 5, avviando così lo splicing.

Con il rapido progresso delle tecnologie di sequenziamento, il costo del sequenziamento dell'intero genoma continua a diminuire, portando a un catalogo in continua espansione di varianti genetiche umane. Si stima che il 10-30% delle mutazioni associate alla malattia nelle malattie genetiche rare influenzino lo splicing dell'RNA 4,5,6, producendo spesso prodotti genici aberranti che possono fungere da bersagli terapeutici. Tuttavia, la valutazione dell'impatto funzionale delle varianti introniche rimane impegnativa a causa della complessità dei segnali di splicing, che sono spesso ridondanti e degenerati. Mentre i siti di splicing 5' e 3' sono relativamente ben caratterizzati, i siti di ramificazione, i tratti polipirimidici e altri elementi regolatori di splicing mostrano una notevole variabilità di sequenza e posizione negli eucarioti superiori. Studi di mappatura su larga scala hanno ulteriormente dimostrato che possono esistere più siti di branca all'interno di un singolo introne 7,8,9,10, complicando l'interpretazione delle variazioni del confine introne-esone.

Il deep learning è stato impiegato per valutare come le sequenze primarie contribuiscano al riconoscimento del sito di splicing 4,11,12, rivelando che le varianti di splicing si raggruppano nei siti di splicing canonici mentre si estendono scarsamente nell'esone e nella regione 3' degli introni. Questo modello si allinea con la comprensione consolidata che la selezione del sito di splicing 5' è principalmente dettata da sequenze consenso, mentre il riconoscimento del sito di splicing 3' dipende da elementi intronici aggiuntivi, come i siti di branca e i tratti polipirimidinici. Tuttavia, i modelli esistenti sono stati addestrati per distinguere i siti di splicing costitutivi da quelli alternativi o artificiali piuttosto che concentrarsi specificamente sulle varianti introniche. Di conseguenza, questi strumenti computazionali mostrano solo una moderata accuratezza predittiva, identificando principalmente i siti di splicing e le varianti di splicing esonico 13,14,15,16. Oltre ai modelli predittivi, un sistema sperimentale in grado di convalidare le varianti di splicing in blocco migliorerebbe significativamente l'identificazione e la caratterizzazione dei difetti di splicing.

I dati completi di sequenziamento dell'RNA che collegano le varianti introniche associate alla malattia ai fenotipi di splicing rimangono scarsi a causa della loro bassa frequenza e della difficoltà di prevedere gli esiti dello splicing dai set di dati esistenti. Per colmare questa lacuna, sono stati sviluppati saggi di splicing ad alto rendimento e modelli computazionali per analizzare sistematicamente le varianti di splicing. I saggi reporter di splicing massivamente parallelo (MaPSy) sono stati progettati per valutare l'impatto delle sequenze variabili sulla selezione del sito di splicing. Incorporando variazioni di sequenza vicino ai siti di splicing 5' e 3' o estendendo intere regioni introne-esone all'interno di dorsali minigeniche fisse, MaPSy consente una valutazione funzionale delle alterazioni di splicing. Tuttavia, a causa delle limitazioni della sintesi di oligonucleotidi di massa, le varianti introniche profonde e l'attivazione dello pseudo-esone non vengono catturate in questo approccio.

La robustezza di MaPSy è stata convalidata utilizzando 70 minigeni di splicing indipendenti, ottenendo una correlazione di Pearson di 0,8917. In particolare, circa il 90% delle varianti di splicing donatore (+1 e +2) presentava difetti di splicing, evidenziando l'accuratezza del test. Inoltre, MaPSy con sequenze randomizzate di siti di branca ha scoperto la natura degenere del riconoscimento dei siti di branca e la sua dipendenza dalle proteine del nucleo U218. Inoltre, un design MaPSy split-GFP accoppiato con la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) è stato utilizzato per studiare gli eventi di salto dell'esone causati da variazioni genetiche. Questo approccio ha rivelato che il 54% delle varianti di splicing-disrupting risiede nelle regioni introniche, inclusi i siti di splicing canonici13, sottolineando il ruolo significativo degli elementi intronici nella regolazione dello splicing. Nel complesso, questi risultati rafforzano l'importanza delle sequenze introniche nel controllo dello splicing e dimostrano l'utilità di MaPSy nell'identificare i difetti di splicing associati alla malattia (Figura 1).

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Figura 1: Disegno sperimentale di un saggio di splicing massivamente parallelo (MaPSy) di mutazioni introniche vicino all'esone. Le varianti documentate nei database di malattie umane sono state raccolte e sintetizzate come 5.307 coppie di oligo. Ogni coppia di oligo contiene un allele di riferimento e una variante nelle regioni introniche a 78 nucleotidi (nt) e a 35 nt. Gli oligo sono affiancati da siti di priming comuni per l'amplificazione e la legatura in minigeni di splicing a 3 esoni. Di conseguenza, la regione sintetizzata comprende i 3 del secondo esone del minigene. Dopo l'assemblaggio dei minigeni, i minigeni raggruppati sono stati uniti in cellule renali embrionali umane (HEK293T). Le isoforme spliced risultanti sono state raccolte e risolte mediante sequenziamento di ampliconi. Questa figura è stata adattata con il permesso di Chiang et al.17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

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1. Sintesi della libreria di oligonucleotidi (oligo) MaPSy

  1. Struttura oligo di base: progettare ogni oligo nel pool di 155 nuncleotide (nt) in modo da includere una sequenza esonica di 35 nt e una sequenza intronica di 80 nt, formando una regione specifica del gene di 115 nt affiancata da sequenze di priming comuni di 20 nt a ciascuna estremità (Figura 2A).
  2. Raccolta delle varianti: per mantenere l'integrità del motivo e concentrarsi sulle regioni regolatorie che influenzano lo splicing, raccogliere le varianti introniche che sono:
    Da -78 a +10 NT dai 3
    Da -3 a +30 nt dai 5
    NOTA: Le varianti cliniche possono essere reperite da ClinVar19, voci a bassa frequenza in dbSNP20, pubblicazioni pertinenti e database clinici aggiuntivi. Le coordinate del genoma possono essere utilizzate per intersecare varianti con le regioni genomiche desiderate (ad esempio, utilizzando BEDTools21). Solo i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) e le piccole inserzioni/delezioni (indel) inferiori a 15 nt dovrebbero essere selezionati per minimizzare la variabilità delle dimensioni all'interno del pool di oligo per la sintesi di massa.
  3. Struttura di base del minigene: Per preservare la struttura della giunzione di splicing, ogni spina dorsale del minigene contiene tre esoni: due esoni esterni costanti che codificano frammenti di EGFP (da pGint, Addgene Plasmid #24217) e un esone medio derivato dall'esone 15 di CAMTA2 umano (Figura 2B). Digerire sia il frammento CAMTA2 che pGint con gli enzimi di restrizione BamHI e SalI e legare il frammento CAMTA2 in pGint tra gli esoni EGFP, creando minigeni a tre esoni pGint-CAMTA2 (File supplementare 1).
    NOTA: L'esone medio, cioè l'esone 15 di CAMTA2 , dovrebbe mostrare un'efficienza di splicing intermedia quando espresso in cellule bersaglio. Questa caratteristica è essenziale in quanto fornisce una linea di base bilanciata, consentendo di rilevare sia gli aumenti che le diminuzioni dell'efficienza di giunzione dovuti agli effetti delle varianti.
  4. Progettazione del sito di priming: aggiungere la sequenza del sito di inserzione a entrambe le estremità della libreria in modo che ogni oligo contenga sequenze di fiancheggiamento di ~20 nt che si sovrappongono al sito di inserzione previsto all'interno dell'esone/introne medio (Figura 2A).
    NOTA: Se il pool di oligo è progettato per più costrutti minigenici, possono essere incorporati più siti di priming.
  5. Progettazione di codici a barre: per le varianti introniche, i codici a barre esonici sono essenziali per distinguere i genotipi dai prodotti giuntati, poiché le sequenze introniche vengono perse dopo lo splicing. Per evitare qualsiasi alterazione dello splicing dovuta alle sequenze di codici a barre (ad esempio, l'effetto del codice a barre), posizionare i codici a barre distalmente all'interno degli esoni, lontano dai siti di splicing (ad esempio, proprio accanto al sito di priming esonico).
    NOTA: Si consiglia di utilizzare più codici a barre per variante, ove possibile. La lunghezza del codice a barre richiesta dipende dalla complessità della libreria. Per esempio:
    Un codice a barre da 1 nt è sufficiente se un allele di riferimento si accoppia con una sola variante.
    Un codice a barre da 2 NT è preferibile se un allele di riferimento si accoppia con sei diverse varianti.
    Librerie con più varianti strettamente correlate a un singolo allele di riferimento (ad esempio, che differiscono per un solo nucleotide) possono aumentare la complessità dell'analisi.
  6. Ordinamento degli oligo: ordina gli oligo in formato file FASTA, con ogni giunzione variante abbinata al suo allele di riferimento.
    NOTA: Per le giunzioni con più varianti, è necessario un solo allele di riferimento per giunzione. I servizi di sintesi di sequenze in pool sono disponibili da aziende come GeneScript (https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html), Twist Bioscience (https://www.twistbioscience.com/products/oligopools), IDT (https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools) e Agilent (https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis). La lunghezza della sintesi, la capacità della libreria e i costi possono variare a seconda del provider e della regione.

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Figura 2: Progettazione di minigeni oligo e splicing per MaPSy. (A) Progetto per la sintesi di oligo aggregati dell'estremità 3' o 5' degli introni. I diagrammi illustrano la struttura di base degli oligo da 155 nt. L'effettiva capacità di oligosintesi dipende dall'azienda selezionata per la produzione. (B) Progettazione dei minigeni MaPSy. Un minigene a tre esoni (ii) è stato modificato dal plasmide pGint (i) e i siti di splicing sono stati sostituiti dagli oligo raggruppati per introdurre variazioni del segnale di splicing (iii). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Costruzione di modelli di DNA della libreria MaPSy

  1. Amplificazione iniziale dopo aver ricevuto il pool oligo
    1. Dopo aver ricevuto il pool di oligo, amplificare 10-50 ng della libreria di oligo con i siti di priming laterali progettati mediante una reazione a catena della polimerasi (PCR) da 100 μL utilizzando la DNA polimerasi ad alta fedeltà per convertire gli oligo in doppi filamenti (primer LibF e LibR nella Tabella 1, impostazioni del termociclatore nella Tabella 2).
    2. Pulire i prodotti PCR utilizzando colonne di purificazione. In dettaglio, legare il prodotto PCR alla membrana della colonna, quindi lavare con tamponi contenenti etanolo al 70% per rimuovere i residui di primer, sali e polimerasi. Infine, eluire il prodotto PCR purificato utilizzando un tampone a basso contenuto di sale o acqua priva di nucleasi.
    3. Verificare la dimensione dell'oligo amplificato mediante elettroforesi su gel. Caricare 5 μl del prodotto PCR purificato su un gel di agarosio all'1,5% preparato in tampone TAE all'1× (40 mM di base Tris, 20 mM di acido acetico, 1 mM di EDTA, pH 8,0).
      NOTA: Limitare i cicli di amplificazione PCR a 15 per evitare la sovraamplificazione e la distorsione PCR. Una banda fuzzy secondaria, tipicamente più grande del prodotto target, può indicare una sovraamplificazione e una ricottura incompleta all'interno del pool di oligo. Salvare una parte dei prodotti PCR e sequenziare il pool di oligo per valutare la qualità e i tassi di errore prima di procedere (punto di arresto).
  2. Costruzione di minigeni di splicing MaPSy - PCR iniziale.
    1. Frammenti di spina dorsale: utilizzare 0,5 ng della spina dorsale plasmidica pGint-CAMTA2 come fonte per i due frammenti principali della PCR
      1. PCR Prodotto 1: Amplificare il promotore del CMV, il primo esone (EGFP N-terminale) e parte del primo introne (Tabella 1 e Tabella 2).
      2. Prodotto 3 della PCR: amplificare parte dell'esone medio (esone 15 CAMTA2), il secondo introne, il terzo esone (EGFP C-terminale) e il segnale di poliadenilazione SV40 (Figura 3, Tabella 1 e Tabella 2).
    2. Amplicone di libreria: PCR Prodotto 2: Per la libreria di 3, amplificare gli ampliconi di libreria con sequenze sovrapposte a ciascuna estremità in modo che corrispondano alle estremità interne del prodotto PCR 1 e del prodotto PCR 3, consentendo un'integrazione efficiente ai 3 dell'esone 15 di CAMTA2 (Figura 3, Tabella 1 e Tabella 2).
      NOTA: Per la libreria 5'ss, sostituire l'estremità 5' della giunzione dell'esone centrale con la sequenza della libreria.
  3. Dopo la PCR, pulire tutti i prodotti utilizzando le colonne di purificazione come al punto 2.1.2. Per evitare la contaminazione dal vettore stampo, purificare i prodotti desiderati da PCR1 e PCR3 mediante estrazione con gel di agarosio. In particolare, dopo l'elettroforesi, asportare ~ 100 mg di gel di agarosio contenente il prodotto PCR target e scioglierlo nel tampone legante. Legare la soluzione di gel disciolto alla membrana della colonna, quindi procedere con il protocollo di purificazione PCR standard.
  4. Costruzione di minigeni di splicing MaPSy - PCR di estensione sovrapposta: eseguire uno o più cicli sequenziali di PCR sovrapposta per legare i tre frammenti principali (PCR Product 1, la libreria amplicon e PCR Product 3; utilizzare ~ 20 ng ciascuno come modello) in un minigene di splicing a lunghezza intera (utilizzare la maggior parte dei primer esterni CAMGFPF e CMVGFPR nella Tabella 1 e le impostazioni del termociclatore nella Tabella 2).
    NOTA: Il prodotto finale contiene il promotore del CMV e tre esoni con i primi 3 derivati dalla libreria di oligonucleotidi, ed è pronto per la trasfezione per esperimenti basati su cellule.
  5. Dopo l'assemblaggio, pulire i modelli di DNA a lunghezza intera utilizzando colonne di purificazione PCR. Se si osservano bande non specifiche nel gel, eseguire l'estrazione del gel per isolare con precisione il prodotto a lunghezza intera desiderato come passaggio 2.3.
    NOTA: sequenze molto simili nella libreria possono portare a un assemblaggio incompleto. Se l'assemblaggio completo in una singola reazione PCR è difficile, si può tentare di eseguire PCR sovrapposte sequenziali (iniziando con due frammenti, quindi aggiungendone un terzo). Per migliorare la specificità della PCR, prendere in considerazione la regolazione della temperatura di ricottura o l'implementazione della PCR touch-down per migliorare la specificità di legame per modelli complessi. Preparare un numero sufficiente di costrutti MaPSy per eseguire almeno quattro esperimenti indipendenti. Salvare una piccola aliquota di ciascun costrutto per il sequenziamento di nuova generazione per verificare l'integrità della sequenza, poiché alcuni oligonucleotidi potrebbero non amplificarsi in modo efficiente e provocare assemblaggi incompleti (punto di arresto).

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Figura 3: Flusso di lavoro della costruzione della libreria. (A) Primer utilizzati nella PCR sovrapposta (vedi anche Tabella 1). (B) La procedura per la PCR sovrapposta. In breve, i pool di oligo e le altre parti dei minigeni di splicing sono stati amplificati da 25 cicli di PCR. Il frammento contenente il promotore e il primo esone (prodotto 1 della PCR) è stato cucito al pool di oligo (prodotto 2 della PCR) mediante PCR sovrapposta utilizzando 20 cicli di amplificazione. Quindi, il prodotto cucito (prodotto PCR 1+2) è stato ulteriormente cucito al frammento contenente il 3° esone e il segnale di poliadenilazione (prodotto PCR 3) utilizzando 20 cicli di amplificazione per ottenere il costrutto finale (prodotto PCR 1+2+3). Questa figura è stata adattata con il permesso di Chiang et al.17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Costruzione del primer della libreria MaPSynota
CMVGFPFCCGCCATGCATTAGTTATTAATAGProdotto PCR 1
LibR2CAGGTCTTCAGGCCCCAGCCProdotto PCR 1
LibFGGCTGGGGCCTGAAGACCTGProdotto PCR 2
LibRAAGGCGCACATGACCCCGGGProdotto PCR 2
LibF2CCCGGGGTCATGTGCGCCTTProdotto PCR 3
CMVGFPRGGACAAACCACAACTAGAATGCProdotto PCR 3
Primer per PCR della libreria MaPSy per il sequenziamento degli ampliconi
P7-LIB0FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGAGAGAGAAGTTCAGCGTCCGGCGA
P7-LIB1FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNAAGTTCAGCGTCCGGCGA
P7-LIB2FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGAGACAGNNAAGTTCAGCGTCCGGCGA
P7-LIB3FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGACAGNNNAAGTTCAGCGTCCGGCGA
P5-LIB0RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAGCGAAGGCTCCTGTCTGTGTAGT
P5-LIB1RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAGNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-LIB2RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAGNNCGAAGGCTCCTGTCTGTAGT
P5-LIB3RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAGNNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
Primer di convalida
Lib0F (Convalida della libreria)AAGTTCAGCGTCCGGCGA
Lib0R (Convalida della libreria)CAGCTTGCCGTAGGTGGCAT

Tabella 1: Primer utilizzati in questo protocollo.

Miscela di reazione PCR
ComponentiVolume
ddH2O13,4 μl
5x Buffer HF4 μl
10 mM dNTP0,4 μl
Primer in avanti 10 μM0,5 μl
Innesco inverso 10 μM0,5 μl
Di cDNA1 μl
DNA polimerasi ad alta fedeltà0,2 μl
Esecuzione del programma PCR (reazione da 20 μl)
TempOreCicli
Denaturazione iniziale98°C1 minuto1
Denaturazione98°C30 secondi10–20
Ricottura65°C30 secondi
Estensione72°C30 secondiTorna alla denaturazione
Estensione finale72°C5 minuti1
Tenere4°CTenereTenere

Tabella 2: Impostazioni del termociclatore.

3. Espressione e recupero di minigeni di splicing da cellule di mammifero

  1. Coltura cellulare: Mantenere HEK293T cellule nel Medium di Eagle Modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 unità/mL di penicillina e streptomicina e 2 mM di L-glutammina in CO2 al 5% a 37 °C.
  2. Trasfezione di minigeni di splicing:
    1. Piastra 5 × 105 HEK293T cellule in 2 mL di terreno in piastre a 6 pozzetti 24 ore prima della trasfezione.
    2. Cellule di trasfettazione con 1-2 μg di costrutti MaPSy, pre-incubate per 5 minuti con 3,75 μL di reagente di trasfezione, seguendo il protocollo del produttore. La trasfezione riuscita è indicata dalla presenza di segnali EGFP dalla libreria con splicing.
    3. Lisi le cellule utilizzando 250 μL di Trizol (o equivalente) 24 ore dopo la trasfezione.
  3. Estrazione dell'RNA: Estrarre l'RNA totale utilizzando un kit di minipreparazione dell'RNA, seguendo il protocollo del produttore. In particolare, legare l'RNA nel Trizol alle membrane della colonna, lavare con tamponi contenenti il 70% di etanolo per rimuovere sali, proteine e altre impurità ed eluire l'RNA purificato utilizzando un tampone a basso contenuto di sale o acqua priva di nucleasi.
    ATTENZIONE: Il trizol (o equivalente) è altamente corrosivo e tossico. L'esposizione può portare a gravi ustioni chimiche, cicatrici permanenti e insufficienza renale.
    NOTA: L'RNA può essere conservato in Trizol (o in un reagente equivalente a base di Trizol, come l'estrattore di RNA TOOLSmart di TOOLS) a -80 °C per un massimo di un anno (punto di arresto). L'RNA purificato può essere conservato a -80 °C per un massimo di due anni se i cicli di gelo-scongelamento sono ridotti al minimo (punto di arresto).
  4. Trascrizione inversa: preparare il cDNA da 2 μg di RNA totale utilizzando la trascrittasi inversa con esameri casuali, seguendo il protocollo del produttore. In particolare, incubare l'RNA con esameri casuali da 50 μM a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire la ricottura, quindi eseguire la trascrizione inversa a 55 °C per 10 minuti.
    NOTA: il cDNA può essere conservato a -20 °C per un massimo di un anno (punto di arresto).
  5. Amplificazione dei minigeni sottoposti a splicing: eseguire la PCR utilizzando le sequenze di priming specifiche per i minigeni sottoposti a splicing (Tabella 2). Utilizzare il numero minimo di cicli necessari per visualizzare il prodotto su un gel di agarosio.
    NOTA: Sul gel devono essere visibili bande miste di prodotti non giuntati e giuntati. Le bande possono apparire diffuse a causa della popolazione mista di specie di DNA (Figura 4A).
  6. Pulire il prodotto PCR utilizzando le colonne di purificazione come al passaggio 2.1.2.
  7. Collegamento degli adattatori di sequenziamento: eseguire un ciclo finale di PCR per collegare le sequenze dell'adattatore di sequenziamento alle estremità dell'amplicona. Includere 0-3 nucleotidi casuali all'estremità degli ampliconi per garantire un rilevamento bilanciato della fluorescenza sulla piattaforma NextSeq (Tabella 1).
  8. Pulire il prodotto PCR utilizzando le colonne di purificazione come al passaggio 2.1.2.

4. Sequenziamento e analisi degli ampliconi

  1. Sequenziamento a lettura breve: sottoporre gli ampliconi PCR a 150 sequenziamento paired-end utilizzando Illumina Miseq, Novaseq o equivalente, attraverso una struttura di base o un servizio commerciale.
  2. Allineamento:
    1. Crea un genoma di riferimento: crea un "genoma di riferimento" sintetico etichettando ogni genotipo unico come un cromosoma separato. Il genoma di riferimento include gli esoni sintetici e gli introni contenuti all'interno degli ampliconi.
    2. Allineare le letture di sequenziamento: Allineare le letture dell'estremità accoppiata al genoma di riferimento utilizzando HISAT222,23, regolando i parametri per controllare gli elementi specifici dello splicing (vedere il file supplementare 2 per i dettagli della riga di comando).
    3. Selezionare letture di alta qualità: convertire SAM in formato BAM, filtrare le letture di alta qualità (qualità di mapping ≥60) e quindi ordinare e indicizzare i file BAM24 (vedere File supplementare 2 per informazioni dettagliate sulla riga di comando).
    4. Identificare le giunzioni di splicing e calcolare le letture delle giunzioni: quantificare l'utilizzo delle giunzioni di splicing estraendo gli eventi di salto dell'esone dalle stringhe CIGAR nel file BAM allineato. Identificare le letture di estensione del nodo in base a "N" operazioni e aggregare i conteggi delle letture per coordinata e trefolo del giunto per valutare i modelli di giunzione (vedere il file supplementare 2 per i dettagli della riga di comando).
    5. Classifica i siti di giunzione canonici: classifica i siti di giunzione come canonici se corrispondono alle giunzioni GT-AG annotate.
      NOTA: In rari casi, gli alleli di riferimento in MaPSy possono utilizzare siti di splicing non canonici. Le letture prive di giunzioni che attraversano la posizione designata del sito di giunzione vengono mantenute come letture non giuntate.
  3. Analisi statistica per identificare le varianti di splicing: Categorizza le letture in tre gruppi:
    (1) letture giuntate e non giuntate;
    (2) canonico contro non canonico tra tutte le letture giuntate;
    (3) Letture canoniche e non canoniche più non giuntate.
    Condurre un test esatto di Fisher su due lati, seguito da una correzione del tasso di falsa scoperta (FDR) (Tabella 3), per valutare l'impatto delle varianti sull'efficienza e l'accuratezza della giunzione.
  4. Filtra per le varianti di splicing ad alta confidenza: classifica entrambe le coppie di riferimento/variante che superano i 100 conteggi di lettura con un valore q inferiore a 0,05 su quattro ripetizioni come significative. Quindi, si considerino i candidati con una variazione dell'odds ratio di 2 volte con l'allele di riferimento o la variante con >5% di letture non giuntate e non canoniche, varianti di splicing ad alta confidenza (Figura 4B).
LeggeImpiombatoNon giuntato e/o non canonico
Riferimentounb
Variantecd

Tabella 3: Tabella due a due per il test esatto di Fisher.

5. Convalida

  1. Splicing di minigeni per la validazione:
    1. Sintesi e amplificazione degli oligo: sintetizzare individualmente gli oligo di DNA di sequenze candidate MaPSy selezionate (ad esempio, mediante tecnologie integrate del DNA). Quindi, amplificare gli oligo utilizzando le sequenze di fiancheggiamento progettate in doppi filamenti mediante PCR utilizzando DNA polimerasi ad alta fedeltà (Tabella 2).
    2. Clonazione di minigeni: digerire sia i prodotti di PCR risultanti che il pGint-CAMTA2 mediante BbsI e SmaI e legare il prodotto digerito mediante DNA ligasi.
    3. Trasfezione: Trasfettare i costrutti risultanti in cellule HEK293T utilizzando un reagente di trasfezione come passaggio 3.2.2.
    4. Estrazione dell'RNA: Estrarre l'RNA dalle cellule trasfettate, come descritto nel passaggio 3.3.
    5. Trascrizione inversa: eseguire la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR) utilizzando esameri casuali.
    6. Amplificazione delle isoforme di splicing: Amplificare le isoforme di splicing con primer mirati ai primi due esoni del minigene (Lib0F e Lib0Rl, Tabella 1, impostazioni del termociclatore nella Tabella 2). Risolvi i prodotti amplificati mediante elettroforesi e visualizza utilizzando il sistema Gel Doc.
    7. Quantificazione: Quantificare l'intensità del segnale di ciascuna isoforma di splicing utilizzando ImageJ (National Institutes of Health, USA)25,26. In alternativa, utilizzare il kit di screening del DNA utilizzando l'analizzatore di acidi nucleici ad alte prestazioni eGENE HDA-GT12 per quantificare l'intensità e il peso molecolare dei prodotti PCR.
    8. Estrazione e conferma delle isoforme: Isolare ogni isoforma mediante estrazione con gel di agarosio come passaggio 2.3 e confermare il risultato dello splicing mediante sequenziamento Sanger dei prodotti PCR attraverso una struttura di base o un servizio commerciale, valutando il normale splicing, l'inclusione degli introni e il salto dell'esone.
  2. Minigeni di splicing multi-esone:
    1. Dopo aver convalidato i risultati di MaPSy, selezionare la variante di interesse e clonare da tre a cinque esoni dal DNA genomico (gDNA) per fornire un contesto più genomico per il difetto di splicing osservato.
    2. Eseguire la mutagenesi sito-specifica utilizzando primer mutagenizzanti e PCR sovrapposta per assemblare costrutti di minigeni che ospitano l'alterazione della sequenza desiderata nel sito bersaglio.
      NOTA: Se gli introni fiancheggianti sono troppo lunghi per la clonazione, conservare circa 300 nt della sequenza intronica per ciascun sito di splicing per garantire un contesto di splicing adeguato.
    3. Eseguire il saggio di splicing cellulare come descritto sopra in 5.1.
  3. Convalida cellulare: per convalidare l'effetto di splicing nelle cellule, utilizzare l'editing CRISPR basato su modelli per modificare la sequenza delle varianti selezionate in un modello cellulare appropriato.
    NOTA: Quando possibile, utilizzare campioni umani portatori della variante specifica per valutare direttamente il modello di giunzione.

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Results

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Dopo lo splicing cellulare di costrutti MaPSy, sono presenti come miscela sia i prodotti spliced che quelli non spliced. A causa della diversità delle dimensioni della libreria e del potenziale di splicing non canonico, entrambi i tipi di prodotti possono apparire in qualche modo diffusi su un gel. Nei costrutti che hanno come bersaglio l'estremità 3', il secondo introne, contenente sequenze adenovirali parziali, tende a splicare in modo molto robusto (Figura 4A).

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Discussion

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Il segnale intrinseco EGFP nel costrutto MaPSy consente il rilevamento basato sulla fluorescenza del salto dell'esone. Se la sequenza nell'esone medio o negli introni promuove il salto dell'esone, la legatura del primo e del terzo esone produce un segnale EGFP rilevabile dal FACS, rendendolo un metodo prezioso per identificare le varianti che influenzano il salto dell'esone e facilitare la visualizzazione al microscopio delle varianti di splicing13. Tuttavia, l'ap...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sostegno finanziario per questo lavoro è stato fornito dal Career Development Award, dal Multidisciplinary Health Cloud Research Program, dal Grand Challenge Seed Grant dell'Academia Sinica (AS-CDA-108-M03, AS-PH-109-01-3 e AS-GCS-113-L03), dal Career Development Award del National Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX112-10908BC) e dall'Excellent Young Scholar Research Grants e dal Ta-You Wu Memorial Award del National Science and Technology Council, Taiwan (MOST 112-2628-B-001-009-MY3 e 108-2118-M-001-013-MY5).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kit MiniPrep Plus a RNA a RNA direttoRicerca ZymoCodice: R2072
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientifico11965084
Siero fetale bovino (FBS)Thermo Fisher Scientifico26140079
L-GlutamminaThermo Fisher ScientificoA2916801 
Lipofectamina 3000 Thermo Fisher ScientificoL3000015
Penicillina-StreptomicinaThermo Fisher Scientifico15140122
plasmide pGintAddgene24217
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltàThermo Fisher ScientificoF530L
Kit di estrazione del gel QIAquickQiagen28706
Kit di purificazione QIAquick PCR Qiagen28106
Kit per lo screening del DNA QIAxcel (2400)Qiagen929004
Trascrittasi inversa SuperScript IVThermo Fisher Scientifico18090010

References

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