Saggio di splicing massivamente parallelo per esaminare gli errori di splicing causati da varianti introniche correlate alla malattia

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'esecuzione di saggi di splicing massivamente parallelo (MaPSy), che impiegano costrutti minigenici per valutare sistematicamente varianti introniche in massa. Questo approccio consente l'analisi ad alto rendimento dei cambiamenti di splicing indotti da varianti nelle cellule attraverso il sequenziamento dell'amplicona, fornendo valutazioni funzionali del loro impatto sullo splicing pre-mRNA.

Abstract

Gli errori di splicing rappresentano il 10-30% delle mutazioni patogene responsabili di malattie genetiche rare. Lo splicing dell'RNA garantisce una corretta espressione genica unendo selettivamente gli esoni e rimuovendo gli introni, con le sequenze regolatorie chiave che si trovano all'interno degli introni. Il sito di splicing 5' e il sito di branca interagiscono con piccoli RNA nucleari per formare il complesso di riconoscimento dello spliceosoma, mentre elementi come il tratto polipirimidinico e gli enhancer/silenziatori di splicing reclutano proteine per regolare l'assemblaggio dello spliceosoma. Prevedere le interruzioni dello splicing da varianti introniche è difficile a causa della complessità di queste interazioni.

Le varianti introniche, che comprendono il 90% delle variazioni genetiche umane naturali, possono interrompere lo splicing canonico e dare origine a malattie. Per studiare questa possibilità, abbiamo sviluppato un saggio di splicing massivamente parallelo (MaPSy) per valutare le varianti introniche identificate dal paziente. Gli oligonucleotidi sintetizzati con sequenze di riferimento o varianti sono stati legati in minigeni di splicing contenenti segnali di promotore e poliadenilazione. Ogni costrutto includeva due esoni costanti che fiancheggiavano un esone medio che ospitava la sequenza di giunzione introne-esone variabile di interesse. L'efficienza di splicing cellulare delle sequenze di varianti è stata confrontata con le controparti di riferimento, permettendoci di identificare interruzioni significative come varianti di splicing.

I risultati del MaPSy possono essere convalidati attraverso approcci aggiuntivi, come saggi minigenici o editing genomico mediato da CRISPR in vivo. Inoltre, l'analisi aggregata delle giunzioni interrotte può fornire informazioni più approfondite sui meccanismi di splicing e sulle basi molecolari delle malattie associate agli errori di splicing.

Introduzione

Lo splicing dell'RNA è un processo cruciale che unisce gli esoni per la traduzione e rimuove gli introni, facilitando l'esportazione dell'RNA e mantenendo l'omeostasi degli acidi nucleici. Questo meccanismo, strettamente regolato, opera in modo temporale e spaziale, contribuendo alla diversità e alla complessità del trascrittoma¹. Lo splicing è guidato da segnali chiave, tra cui il sito di splicing 5' (5'ss), il sito di branca e il sito di splicing 3' (3'ss), insieme a ulteriori elementi regolatori come il tratto polipirimidinico a valle del sito di branca e la zona di esclusione del dinucleotide AG, che aiutano nel riconoscimento 2's

Protocollo

1. Sintesi della libreria di oligonucleotidi (oligo) MaPSy

1. Struttura oligo di base: progettare ogni oligo nel pool di 155 nuncleotide (nt) in modo da includere una sequenza esonica di 35 nt e una sequenza intronica di 80 nt, formando una regione specifica del gene di 115 nt affiancata da sequenze di priming comuni di 20 nt a ciascuna estremità (Figura 2A).
2. Raccolta delle varianti: per mantenere l'integrità del motivo e concentrarsi sulle regioni regolatorie che influenzano lo splicing, raccogliere le varianti introniche che sono:
   Da -78 a +10 NT dai 3
   Da -3 a +30 nt dai 5
   NOTA: Le varianti c....

Risultati

Dopo lo splicing cellulare di costrutti MaPSy, sono presenti come miscela sia i prodotti spliced che quelli non spliced. A causa della diversità delle dimensioni della libreria e del potenziale di splicing non canonico, entrambi i tipi di prodotti possono apparire in qualche modo diffusi su un gel. Nei costrutti che hanno come bersaglio l'estremità 3', il secondo introne, contenente sequenze adenovirali parziali, tende a splicare in modo molto robusto (Figura 4A).

Discussione

Il segnale intrinseco EGFP nel costrutto MaPSy consente il rilevamento basato sulla fluorescenza del salto dell'esone. Se la sequenza nell'esone medio o negli introni promuove il salto dell'esone, la legatura del primo e del terzo esone produce un segnale EGFP rilevabile dal FACS, rendendolo un metodo prezioso per identificare le varianti che influenzano il salto dell'esone e facilitare la visualizzazione al microscopio delle varianti di splicing¹³. Tuttavia, l'ap.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit MiniPrep Plus a RNA a RNA diretto	Ricerca Zymo	Codice: R2072
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientifico	11965084
Siero fetale bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientifico	26140079
L-Glutammina	Thermo Fisher Scientifico	A2916801
Lipofectamina 3000	Thermo Fisher Scientifico	L3000015
Penicillina-Streptomicina	Thermo Fisher Scientifico	15140122
plasmide pGint	Addgene	24217
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	Thermo Fisher Scientifico	F530L
Kit di estrazione del gel QIAquick	Qiagen	28706
Kit di purificazione QIAquick PCR	Qiagen	28106
Kit per lo screening del DNA QIAxcel (2400)	Qiagen	929004
Trascrittasi inversa SuperScript IV	Thermo Fisher Scientifico	18090010