Articolo metodologico

Produzione basata sulla ricombinazione di vettori virali ingegnerizzati per la ricerca e la terapia

DOI:

10.3791/68988

⸱

26 settembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEINGE Biotecnologie Avanzate Franco Salvatore S.C.aR.L., 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 3ImGen-T Srl

In questo articolo

Sommario

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La ricombinazione, un metodo di ingegneria genetica mediata dalla ricombinazione, consente di modificare con precisione il genoma virale senza fare affidamento sulla digestione enzimatica. Questo approccio è fondamentale per la ricerca di base, come le delezioni mirate, e per lo sviluppo di virus ingegnerizzati utilizzati nelle terapie oncolitiche, nella terapia genica e nei vaccini genetici, ampliando le possibilità sia nella ricerca che nelle applicazioni cliniche.

Abstract

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La crescente domanda di vettori virali ingegnerizzati sia nella ricerca di base che in quella traslazionale ha sottolineato la necessità di metodi flessibili, rapidi e scalabili per generare virus a DNA ricombinante. Le strategie che si basano sulla digestione e la legatura degli enzimi di restrizione sono limitate da limitazioni dipendenti dalla sequenza e da lunghe fasi di clonazione. Qui, descriviamo il metodo di ingegneria genetica mediata dalla ricombinazione (ricombinazione) che elude queste limitazioni consentendo modifiche precise e senza soluzione di continuità dei genomi virali nei cromosomi artificiali batterici (BAC). Questo approccio consente la delezione, l'inserimento o la sostituzione efficienti di elementi genetici codificanti o non codificanti, fornendo una potente piattaforma per lo sviluppo di vettori virali ad alto rendimento. La ricombinazione è particolarmente utile nelle applicazioni della ricerca di base, come la delezione o la mutazione di geni virali per studiarne la funzione. Ancora più importante, questa metodologia consente la generazione di decine di virus ricombinanti che codificano in parallelo carichi utili immunostimolatori o terapeutici distinti, rendendola eccezionalmente adatta per la rapida valutazione preclinica di nuovi costrutti. Sebbene questa tecnologia possa essere potenzialmente implementata per qualsiasi scopo scientifico, questo articolo si concentra sull'applicazione della ricombinazione in due aree specifiche: la generazione di virus oncolitici basati sul virus dell'herpes simplex e lo sviluppo di vettori adenovirali non replicativi per il trasferimento genico. In conclusione, la ricombinazione offre un approccio versatile all'ingegneria del genoma virale, accelerando significativamente la pipeline dalla progettazione ai test funzionali. La sua rilevanza spazia dalla virologia di base alla medicina traslazionale per soddisfare le esigenze cliniche e di ricerca in continua evoluzione.

Introduzione

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I vettori virali sono emersi come potenti strumenti nella terapia genica, nella viroterapia oncolitica e nello sviluppo di vaccini genetici grazie alla loro naturale capacità di fornire materiale genetico nelle cellule ospiti. Sfruttano il trofismo naturale e i meccanismi di trasduzione dei virus, facilitando l'espressione genica sia transitoria che a lungo termine. Sono in grado di sopravvivere nell'ambiente extracellulare, di legarsi a uno specifico recettore cellulare (che definisce il tropismo virale) e promuovere la loro internalizzazione, di dirottare il meccanismo di espressione genica della cellula ospite e guidare l'espressione dei propri geni, e di eludere i sensori intracellulari e legati alla membrana del braccio immunitario innato 1,2. In questo modo, dopo un'infezione virale produttiva, i virus trasformano le cellule in fabbriche di progenie virale che diffondono nuovi virus nell'organismo, causando infine una malattia.

I virus wild-type possono essere trasformati in uno strumento biotecnologico mediante l'ingegneria genetica: il loro genoma può essere facilmente manipolato per mantenere la capacità di trasduzione e ottenere un risultato clinico. Sulla base della loro applicazione clinica, i vettori virali possono essere ingegnerizzati per mantenere (almeno in parte) o essere ablati nella loro competenza di replicazione per generare vettori competenti o incompetenti per la replicazione 3,4.

I virus competenti per la replicazione sono destinati principalmente ai virus oncolitici. Le cellule tumorali, spesso carenti di difese antivirali1, consentono la replicazione di virus ricombinanti attenuati ingegnerizzati attraverso la delezione di geni di virulenza. Questi virus si replicano selettivamente nei tumori risparmiando il tessuto normale. Con l'avanzare della comprensione della virologia, i virus attenuati sono stati sostituiti da modifiche più precise del genoma progettate per migliorare sia la sicurezza che l'efficacia terapeutica.

Tra i campi di interesse che richiedono l'ingegneria molecolare chirurgica dei genomi virali vi sono: i) Virus oncolitici replication-condition, in cui i promotori virali sono sostituiti da promotori associati al tumore (promotori cellulari sovra-trascritti nelle cellule tumorali), limitando così l'espressione genica virale alle cellule malate5. ii) Virus con tropismo alterato 6,7, dove le glicoproteine dell'involucro che determinano l'infezione possono essere modificate o sostituite con frammenti di anticorpi o ligandi che hanno come bersaglio proteine sovraespresse sulle cellule tumorali 8,9. iii) Virus oncolitici armati. La morte delle cellule tumorali indotta dai virus oncolitici innesca la morte cellulare immunogenica (ICD), caratterizzata dal rilascio di mediatori infiammatori 1,10 e antigeni tumorali11. Questi segnali promuovono un riconoscimento efficiente degli antigeni tumorali da parte del sistema immunitario, ripristinando la sorveglianza12e consentendo la combinazione con inibitori del checkpoint immunitario 13,14,15 e altre terapie immunitarie come terapie e vaccini basati sull'RNA16.

A sostegno di questo effetto immunoterapeutico, i transgeni di interesse possono essere codificati all'interno del genoma virale, sfruttando così il virus non solo per la sua attività oncolitica, ma anche per migliorare il suo potenziale immunoterapico attraverso la produzione in situ di carichi utili rilevanti 3,7,17,18,19. Questi carichi utili possono comprendere citochine, chemochine, anticorpi, geni suicidi e antigeni 3,20. L'inserimento richiede precisione, con le regioni intergeniche del genoma virale preferite per ridurre al minimo l'interruzione dei geni virali e preservare la replicazione e la potenza7. Pertanto, sono essenziali tecniche che consentano lo screening sia dei siti di inserzione ottimali che dei transgeni di interesse.

D'altra parte, nel contesto dei virus non replicativi, utilizzati per la terapia genica o come veicoli per vaccini genetici, è importante che il vettore virale trasmetta il transgene (transitoriamente o di lunga durata) senza replicarsi nella cellula ospite per evitare la tossicità21. I vettori adenovirali sono caratterizzati da un'elevata efficienza di trasduzione, da una robusta espressione dei transgeni e dalla capacità di infettare sia le cellule in divisione che quelle non in divisione3. Queste proprietà li hanno resi i primi della categoria per lo sviluppo di vaccini genetici, compresi quelli per le malattie infettive emergenti, come il COVID-19, e per le terapie di sostituzione genica22. L'esempio più famoso di vettore adenovirale che ha raggiunto il mercato è il vaccino Oxford-AstraZeneca COVID-19, noto con il nome commerciale di Covishield o Vaxzevria, basato su un adenovirus di scimpanzé modificato, ChAdOx1, che codifica per la proteina Spike di SARS-CoV-2. Quando iniettato per via intramuscolare, Covishield è in grado di penetrare all'interno delle cellule e indurre l'espressione della proteina Spike, innescando il sistema immunitario a montare una risposta immunitaria contro di essa3.

C'è una chiara necessità di modificare i genomi virali senza essere vincolati da siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione. Tra i virus oncolitici, i vettori basati sull'Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1) offrono vantaggi unici, tra cui la capacità litica, la sicurezza e le grandi dimensioni del genoma, consentendo l'inserimento di transgeni considerevoli o di più elementi genetici23,24. Oltre all'HSV, molti altri virus mostrano promesse terapeutiche, come recentemente rivisto in Sasso et al.3. Piuttosto che un vettore universale "best-in-class", diverse piattaforme virali sono adatte a esigenze terapeutiche distinte3. Attualmente, i sistemi di ricombinazione omologa nei batteri o il clonaggio ibrido lievito-batteri rimangono le alternative più comuni agli enzimi di restrizione, ma questi sono laboriosi, a più fasi e inefficienti25.

Un'alternativa emergente è l'uso di CRISPR/Cas9, recentemente applicato per ingegnerizzare genomi di virus, tra cui il virus vaccinico (VV), il virus dell'herpes simplex e i vettori adenovirali. Cas9 è attraente per l'inattivazione genica tramite mutazioni indel, ma diventa meno pratico quando sono necessari tagli multipli per eliminare segmenti di genoma o inserire un transgene tramite il DNA del donatore. Inoltre, l'editing è limitato dalla progettazione del gRNA, dagli effetti off-target sia nel genoma virale che in quello dell'ospite e dalla dipendenza dalle sequenze PAM nelle regioni di interesse25.

Con questo in mente, e attraverso due esempi basati su HSV e adenovirus, questo articolo illustra il metodo di ricombinazione, che può essere applicato ampiamente, dai virus ai batteriofagi, ai plasmidi complessi e ai diversi sistemi sperimentali. La ricombinazione (ingegneria genetica omologa mediata da RECOMBInation) è una tecnica di ingegneria genetica in vivo , utilizzata principalmente in Escherichia coli, che sfrutta proteine di ricombinazione batteriofago dipendenti dalla temperatura per catalizzare la ricombinazione omologa tra elementi di DNA con un minimo di 30 bp di omologia26. Questo approccio consente l'inserimento, la delezione o la modifica precisi delle sequenze senza dipendere dai siti di restrizione o dalle dimensioni del DNA. In questo manoscritto, descriviamo una versione basata sul ceppo di E. coli inducibile dal calore SW102, sebbene siano disponibili anche ceppi alternativi con specifici sistemi inducibili27.

La ricombinazione inizia con la preparazione di cellule batteriche elettrocompetenti attraverso uno shock a temperatura controllata per attivare il meccanismo di ricombinazione dei fagi. Le molecole di DNA che trasportano i bracci di omologia appropriati vengono quindi elettroporizzate. Questi possono essere DNA a doppio filamento (dsDNA) generati dalla digestione di restrizione o PCR o DNA a singolo filamento (ssDNA) come gli oligonucleotidi. La presenza di sequenze omologhe insieme a proteine attive di ricombinazione consente la creazione di nuove molecole di DNA con la modifica desiderata.

La tecnologia di clonazione molecolare ricombinante consente un'ingegneria genetica precisa e viene applicata in diversi contesti, tra cui l'inserimento di marcatori selezionabili o non selezionabili in plasmidi, DNA cromosomico batterico e cromosomi artificiali batterici (BAC). I BAC sono particolarmente preziosi per la clonazione di grandi frammenti genomici, tra cui il DNA adenovirale e l'HSV, consentendo la rapida produzione di vettori virali. Oltre alle applicazioni traslazionali, la ricombinazione supporta anche la ricerca di base consentendo la delezione, la modifica o la sostituzione mirata di geni virali o domini proteici. La ricombinazione ha alcune limitazioni: i bracci corti di omologia ostacolano la ricombinazione nelle regioni ripetitive; I substrati amplificati con PCR possono occasionalmente introdurre mutazioni; e la sequenza della regione target deve essere nota.

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Protocollo

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Come prerequisito per la ricombinazione, deve essere disponibile un ceppo batterico competente (ad esempio, SW102) con un genoma BAC di interesse. Sebbene la ricombinazione sia un metodo altamente efficiente per arricchire le colonie che hanno subito la modifica desiderata, qui descriviamo una strategia di ricombinazione in due fasi, denominate prima e seconda fase (Figura 1). Nella prima fase, una cassetta di espressioni contenente marcatori di selezione positivi e negativi viene inserita nel locus di interesse. Nella seconda fase, questa cassetta viene sostituita con l'effettiva modificazione genetica destinata al genoma finale. I marcatori di selezione utilizzati in questo studio includono la resistenza all'ampicillina (AmpR), l'attività della beta-galattosidasi (β-gal) e il gene sacB ; Tuttavia, può essere impiegata qualsiasi combinazione di marcatori di selezione positivi e negativi, a seconda delle esigenze specifiche del gruppo di ricerca.

1. Inserire la cassetta di selezione nella regione di destinazione

  1. Giorno 0
    1. Striare le cellule SW102 contenenti il BAC desiderato su LB Agar + antibiotico (il cui gene di resistenza è in BAC (ad esempio, cloramfenicolo 12,5 μg/mL). Coltivali per una notte nell'incubatore a 32 °C.
      NOTA: Evitare temperature > 32 °C per evitare l'induzione di geni ricombinanti durante questa fase.
  2. Giorno 1
    1. Eseguire una PCR per amplificare la cassetta di selezione AmpR/LacZ/SacB. Utilizzare primer diretti e inversi contenenti all'estremità 3' la sequenza per ricuocere e amplificare la cassetta di selezione e all'estremità 5' 30-80 bp che rappresentano bracci di omologia con la regione genomica virale da modificare (Tabella 1).
      NOTA: La cassetta di selezione, così come l'inserto, possono essere facilmente ordinati come costrutti sintetici da fornitori specializzati. Tuttavia, è necessario prestare attenzione per evitare la presenza di promotori duplicati, terminatori o altri elementi genetici all'interno del BAC (geni che controllano il BAC) o nel genoma virale per prevenire eventi di ricombinazione indesiderati.
    2. Garantire l'identità e la purezza del frammento di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio (poiché la cassetta AmpR/LacZ/SacB è di 3.400 bp, eseguire un gel di agarosio all'1%) e che i valori di 260/230 e 260/280 siano in linea con l'acido nucleico puro.
    3. Nel pomeriggio, inoculare una singola colonia di SW102 in 5 ml di LB e incubare per una notte a 32 °C.
  3. Giorno 2
    1. Inoculare 1-2 ml di coltura notturna in 100 ml freschi di LB. Far crescere i batteri fino a un OD600 di 0,55-0,7, misurando regolarmente l'OD600 per non perdere la fase esponenziale.
    2. Preparare un bagnomaria a 42 °C per l'induzione e raffreddare a 4 °C ~250 mL di ddH2O sterile per i lavaggi.
    3. Una volta che la coltura ha raggiunto l'OD desiderato, trasferire 50 mL in una provetta conica pulita e incubare a 42 °C in bagnomaria per 15 minuti. Includere un controllo negativo non indotto.
      NOTA: Questo passaggio indurrà le proteine rosse lambda.
    4. Lasciare le provette in ghiaccio per 10 minuti, quindi centrifugare per 5 minuti a 3.200 × g a 4 °C (sia a 42 °C indotte che non indotte).
    5. Scartare il surnatante, aggiungere 40 mL di ddH2O sterile ghiacciato e risospendere il pellet (sia indotto a 42 °C che non indotto).
    6. Centrifugare nuovamente per 8 minuti (vedere il passaggio 1.3.4) e ripetere la fase di lavaggio (passaggio 1.3.5) e la centrifugazione. Ripetere la fase di lavaggio fino a quando il surnatante non è limpido come l'acqua (senza torbidità e sospensioni) (2-4 lavaggi).
    7. Dopo l'ultima centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 200 μL di ddH2O freddo e sterile (sia indotto a 42 °C che non indotto).
    8. Trasferire un'aliquota dei pellet risospesi (50 μL di HSV-1 e 25 μL di Adeno) in provette preraffreddate da 1,5 mL (sia indotte a 42 °C che non indotte). Aggiungere 50-400 ng di prodotto PCR purificato (non superare i 5μL). Agitare le provette e incubare con ghiaccio per 5 minuti.
    9. Trasferire la miscela del passaggio precedente in una cuvetta preraffreddata ed elettroporare a 2,50 kV (2.500 V, cuvetta da 0,2 cm) (sia a 42 °C indotta che non indotta).
    10. Dopo l'elettroporazione, lasciare che i batteri si riprendano in 1 mL di LB per 1,5 h a 32 °C. Aggiungi 1 ml di LB alla cuvetta per pulirla e raccogliere tutto.
    11. Distribuire diverse quantità di batteri (10, 50, 200 μL) su LB Agar + Ampicillina (100μg/mL), X-Gal (20 μg/mL) e IPTG (0,5 mM) e lasciarli crescere durante la notte (ON) a 32 °C.
    12. Preparare le piastre con AMP/X-Gal (stessa concentrazione del passaggio 1.3.11) e le piastre con saccarosio5.
  4. Giorno 3
    NOTA: A questo punto, ci si aspetta che le colonie siano cresciute e che appaiano blu, ma solo sulle piastre dove i batteri sono stati indotti a 42 °C e sono stati galvanizzati con l'inserto contenente la cassetta di selezione. Una volta stabilito questo, è necessario verificare l'integrità della cassetta di selezione in alcune delle colonie.
    1. Identifica le piastre da ON dove le colonie sono <50 per evitare di raccogliere due o più colonie. Prelevare diverse colonie (in genere 8-10 sono sufficienti per identificare almeno una colonia adatta) e diluirle in circa 50 μL di H2O. Inoculare singole colonie blu in 50 μL di H2O e striarle su piastre selettive sia negative (LB Agar/Saccarosio/Cloramfenicolo) che positive (LB Agar/Ampicillina/Cloramfenicolo/X-Gal/IPTG) (stessa concentrazione dei passaggi 1.1.2 e 1.3.11) (Figura 2).
      NOTA: Si prevede di trovare 20-100 colonie sulla piastra, dove sono stati sparsi 50 μL. Tuttavia, se il numero di colonie è inferiore, non significa necessariamente che la ricombinazione sia compromessa.
    2. Inoculare l'acqua del passaggio 1.4.1 in 5 mL di LB e incubare le piastre e la coltura di LB per una notte a 32 °C (Figura 2).
  5. Giorno 4
    1. Selezionare solo le colonie blu che sono cresciute su piastre Amp/X-Gal e non sono cresciute su piastre di saccarosio (Figura 3). Per questi cloni positivi (Tabella 2), trasferire un'aliquota di 500 μL della coltura notturna in 50 mL di LB fresco.
  6. Giorno 5
    1. Per ogni clone positivo, preparare una pugnalata di glicerolo ed estrarre e isolare il plasmide BAC (midiprep).
    2. Dopo l'estrazione del BAC, eseguire il controllo di qualità per verificare se la ricombinazione è avvenuta correttamente. Eseguire il sequenziamento Sanger del sito di inserimento. Se tutto sembra corretto, procedi con la seconda sezione.

2. Sostituire la cassetta di selezione con la modifica desiderata

  1. Giorno 0
    1. Striscia il clone positivo su LB agar. Incubare per una notte a 32 °C.
  2. Giorno 1
    1. Eseguire una PCR per amplificare l'inserimento/modifica. Utilizzare primer in avanti e all'indietro contenenti all'estremità 3' la sequenza per ricuocere e amplificare la cassetta di selezione e all'estremità 5' gli stessi bracci di omologia da 30-80 bp utilizzati nella fase 1.3.1 (Tabella 1).
    2. Garantire l'identità e la purezza del frammento PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio e che i valori 260/230 e 260/280 siano in linea con l'acido nucleico puro.
    3. Inoculare una singola colonia in 5 mL di LB e incubare per una notte a 32 °C.
  3. Giorno 2
    1. Trasferire 2 mL della coltura notturna in 100 mL di LB e crescere a 32 °C fino a quando OD600 raggiunge 0,55-0,7 (in ~2,5-3 h). Preparare un bagnomaria a 42 °C per l'induzione e raffreddare a 4 °C ~250 mL di ddH2O sterile per i lavaggi.
    2. Una volta raggiunta la OD desiderata, trasferire 50 mL di coltura in una provetta conica e incubare in bagnomaria a 42 °C per 15 minuti per indurre le proteine di ricombinazione λ-fagi. Mantenere un'altra provetta da 50 mL a 32 °C come controllo non indotto.
    3. Dopo l'induzione del calore, posizionare i tubi sul ghiaccio per 10 minuti.
    4. Centrifugare per 8 minuti a 3.200 × g a 4 °C (sia a 42 °C indotta che non indotta).
      NOTA: Da questo punto in poi, lavorare sul ghiaccio per mantenere la competenza cellulare SW102.
    5. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con 40 mL di acqua preraffreddata agitando delicatamente.
    6. Centrifugare per 5 minuti a 3.200 × g a 0-4 °C.
    7. Ripetere una volta la fase di lavaggio (passaggio 2.3.5).
    8. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in 100 μL di acqua.
    9. Trasferire un'aliquota dei pellet risospesi (50 μL di HSV-1 e 25 μL di Adeno) in provette preraffreddate da 1,5 mL (sia a 42 °C indotte che non indotte). Aggiungere 50-400 ng di prodotto PCR purificato (non superare i 5 μL). Agitare le provette e incubare con ghiaccio per 5 minuti.
    10. Trasferire la miscela del passaggio precedente in una cuvetta preraffreddata ed elettroporare a 2,50 kV (sia a 42 °C indotta che non indotta).
    11. Lasciare che le cellule si riprendano in 5 mL di terreno LB per 4-5 ore a 32 °C agitandole.
      NOTA: Il tempo di recupero è più lungo rispetto alla prima fase di ricombinazione per consentire la degradazione della proteina SacB residua dopo la sostituzione della cassetta.
    12. Piastra in diverse quantità (50, 200, 500 μL) di coltura su piastre di Petri in agar LB contenenti saccarosio, X-Gal e IPTG (stessa concentrazione dei passaggi 1.1.2 e 1.3.11). Incubare per una notte a 32 °C.
  4. Giorno 3
    1. Screening di un numero considerevole di colonie (20-100) per aumentare la probabilità di identificare cloni positivi che hanno subito con successo la ricombinazione con il frammento che porta la modifica desiderata e la cassetta di selezione. Effettuare uno screening di primo livello utilizzando la PCR delle colonie. Utilizzare una piastra di Petri con una griglia; scegli le colonie da un dato quadrante ed etichettale (Figura 4).
      NOTA: Un approccio particolarmente efficace prevede l'utilizzo di una coppia di primer in cui un primer ricottura al di fuori della regione bersaglio (sul genoma virale) e l'altro all'interno del frammento ricombinato (Figura 5).
    2. Verificare la presenza e le dimensioni dell'amplicone PCR con gel di agarosio (1,5%).
    3. Prelevare dal quadrante corretto i cloni positivi e inoculare in 100 mL di LB. Incubare per una notte a 32 °C.
  5. Giorno 4:
    1. Eseguire un midiprep per estrarre il plasmide dalle colture batteriche.
    2. Digerire il plasmide con enzimi di restrizione ed eseguire un gel di agarosio per analizzare il modello di digestione.
    3. Se il modello di digestione è corretto, procedere con il sequenziamento della regione modificata del genoma virale.
    4. Dopo aver accertato l'identità molecolare dei cloni ricombinanti, procedere con la trasfezione e il salvataggio delle particelle virali.

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Risultati

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Generazione di un virus dell'herpes oncolitico codificante IL12
Come delineato nella sezione introduttiva di questo lavoro, una potenziale applicazione della ricombinazione è l'inserimento di transgeni immunostimolatori nel genoma di virus oncolitici, con l'obiettivo di aumentare il loro potenziale immunoterapeutico. Di seguito, presentiamo un esempio di tale applicazione utilizzando un vettore oncolitico basato su HSV-1. In particolare, questo studio indaga l'impatto dell'inserimento di un transgene ...

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Discussione

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Questo protocollo di "RICOMBINAZIONE" (ingegneria genetica omologa mediata da RECOMBInazione) utilizza una strategia in due fasi: in primo luogo, l'integrazione di una cassetta di selezione nel locus genomico di interesse e, in secondo luogo, la sostituzione di questa cassetta con la modifica desiderata (Figura 1).

I marcatori di selezione utilizzati includono la resistenza all'ampicillina (AmpR), la beta-galattosidasi (β-gal) e i...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi finanziari o non finanziari rilevanti da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da: PRIN 2022-MUR Italia, Grant 20224NCSN5 (PreMeRetHOn). POR Campania: piattaforma per lo sviluppo di nuove tecnologie vaccinali. PNRR CN3 Centro Nazionale per la Terapia Genica e i Farmaci basati sulla Tecnologia dell'RNA. PNRR PE13 One Health Azioni di ricerca di base e traslazionale per rispondere ai bisogni insoddisfatti sulle malattie infettive emergenti. Gli autori ringraziano il servizio di sintesi Geneart per aver fornito DNA personalizzati. Gli autori esprimono inoltre sincera gratitudine a Michele Veneruso, che ha contribuito al positivo completamento di questo studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ampicillinaqualunquequalunquedi grado molecolare
Per oligo per amplificare Il-12: CTGGCTAGCGTTTAA
ACGGGCCCTCTAGACTCG
AGCGGCCGCACGCCACCA
TGTGTCCTCAGAAGCTAACC		qualunquequalunquePurificato per HPLC
Per oligo ad amplofy AmpR/LacZ/SacB  cassetta: CTGGCTAGCGTTTAAA
CGGGCCCTCTAGACTCGAG
CGGCCGCACGCCACCACC
CCTATTTGTTTATTTTTC		qualunquequalunquePurificato per HPLC
IPTGqualunquequalunquedi grado molecolare
LB agar
LB medio
Phusion Hot Start II DNA polimerasi ad alta fedeltà Termo ScientificoF549S
Rev oligo per amplificare Il12: GGCAACTAGAAGGCA
CAGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTTC
AGGCGGAGCTCAGATAG 		qualunquequalunquePurificato per HPLC
Rev oligo ad amplofy AmpR/LacZ/SacB  cassetta: GGCAACTAGAAGGCAC
AGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTT
TATTTGTTAACTGTTAATTG 		qualunquequalunquePurificato per HPLC
Cassetta di selezione SacB/AmpR/LacZQuesto manoscritto--
Saccarosioqualunquequalunquedi grado molecolare
SW102 con BAC-HSV-1 o BAC-AdvQuesto manoscritto--
Triptonequalunquequalunquedi grado molecolare
Mago SV GelPromegaCodice: A9281
X-galqualunquequalunquedi grado molecolare
Estratto di lievitoqualunquequalunquedi grado molecolare

Riferimenti

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