Valutazione della Sicurezza Microbica dei Caseifici mediante Profilazione Proteomica Batterica tramite Approccio MALDI

Sommario

Questo protocollo consente una valutazione rapida ed economica della composizione microbica nei prodotti lattiero-caseari combinando la culturromica con MALDI-TOF MS. Fornisce risultati di tassonomia paragonabili al sequenziamento dell'rRNA 16S con un tempo di risposta più breve rispetto ai metodi di coltura tradizionali.

Abstract

Presentiamo un protocollo che utilizza il metodo di identificazione della spettrometria di massa a tempo di volo a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF MS, di seguito denominato "MS") per monitorare la presenza di microrganismi in diversi prodotti lattiero-caseari (burro, mozzarella, latte, panna) utilizzando un approccio proteomico, una moderna cultura e varie procedure di preparazione dei campioni che potrebbero essere incorporate nei laboratori di controllo della qualità della sicurezza alimentare come un metodo rapido, Strumento affidabile e robusto per il monitoraggio della sicurezza microbica. Include una fase di isolamento microbico, la raccolta delle colonie cresciute, le procedure di preparazione dei campioni (cellule intatte, estrazione in loco e in provetta), l'impostazione dei parametri di analisi MS, la generazione e la raccolta di spettri MS (impronte digitali delle proteine) e infine l'ottenimento della tassonomia utilizzando la piattaforma MS, seguita dall'interpretazione e visualizzazione dei dati. Questo metodo, convalidato da numerosi studi, offre un'identificazione più affidabile ed economica dei microrganismi del latte rispetto ai sistemi di test biochimici commerciali. Si distingue come un promettente progresso nella microbiologia alimentare, in grado di soddisfare le diverse esigenze dei laboratori grazie ai suoi semplici protocolli e ai tempi di analisi significativamente ridotti. Il protocollo presentato risponde alle esigenze dell'industria alimentare fornendo un'identificazione microbica affidabile in un tempo di consegna adeguato (TAT) che ben si adatta ai processi di produzione.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire una metodologia completa per il monitoraggio della sicurezza microbica di vari prodotti lattiero-caseari, tra cui burro, formaggio, latte e panna, impiegando la MS per la profilazione proteomica batterica. Questo approccio, che combina la moderna culturromica con procedure di preparazione dei campioni ottimizzate, è destinato a essere uno strumento veloce, affidabile e robusto per i laboratori di sicurezza alimentare e controllo qualità. La logica alla base della creazione e dell'applicazione di questa metodologia deriva dai limiti dei metodi standard di identificazione microbica. Per molti anni, i laboratori veterinari e di diagnostica alimentare si sono affidati a test biochimici convenzionali che esaminano la crescita e il metabolismo batterico su terreni di coltura differenziali, seguiti da vari saggi enzimatici¹. Sebbene questi metodi, spesso basati su linee guida standard come quelle del Manuale di batteriologia determinativa di Bergey, siano relativamente economici e possano produrre dati sia quantitativi che qualitativi, sono laboriosi e richiedono molto tempo, richiedendo un'ampia preparazione dei terreni, la diluizione del campione, la placcatura, l'incubazione, il conteggio delle colonie, l'isolamento e le fasi di caratterizzazione dettagliata ^2,3.

L'introduzione di sistemi semi-automatizzati e automatizzati commerciali come l'Analytical Profile Index (API), BBL Crystal, Vitek e Biolog MicroPlates ha semplificato l'identificazione microbica utilizzando saggi biochimici, riducendo così i costi e i tempi di consegna. Tuttavia, questi sistemi presentano alcuni inconvenienti, come la scarsa riproducibilità, la mancanza di voci nei rispettivi database e le difficoltà nel determinare le variazioni fenotipiche tra i ceppi, in particolare per i batteri non fermentativi o i ceppi all'interno di una specie con differenze biochimiche minori, che potrebbero portare a risultati errati in vitro ⁴. Detto questo, la SM si è evoluta come una potente alternativa, attualmente comune nella microbiologia clinica e sta guadagnando attenzione nei laboratori diagnostici veterinari e di qualità del latte. Questo approccio è stato completato dalla sua velocità, accuratezza ed economicità nel rilevare diversi microrganismi¹. Numerosi studi hanno dimostrato che la SM offre un'identificazione più affidabile dei microrganismi dal latte, fornendo risultati più rapidi ed economici rispetto ai sistemi di test biochimici commerciali ^5,6,7. Mentre i test biochimici possono essere sufficienti per l'identificazione a livello di genere o di gruppo, la diagnosi a livello di specie richiede spesso metodi più avanzati come la MS o il sequenziamento dell'rRNA 16S⁸. In effetti, la MS è considerata una piattaforma promettente per l'identificazione flessibile e affidabile di isolati microbici alimentari, soddisfacendo le diverse esigenze dei laboratori di microbiologia alimentare grazie ai suoi protocolli semplici e ai tempi di analisi significativamente ridotti, migliorando così la sicurezza alimentare ^4,5. I costi operativi sono minimi grazie al basso consumo di reagenti e la gestione dei campioni consente una maggiore automazione e un'elevata produttività⁸. Tuttavia, va notato che l'utilità di questo metodo dipende intrinsecamente dalle condizioni di crescita microbica selezionate (incluso il tipo di terreno di coltura) e dalla copertura di un database di riferimento per le specie, che sono riconosciuti come i fattori chiave che ne limitano l'utilità.

La SM svolge un ruolo significativo nella microbiologia degli alimenti identificando e differenziando i batteri patogeni di origine alimentare, i batteri lattici (LAB) e altri batteri fermentativi⁹. La sua utilità si estende alla moderna cultura genetica, consentendo l'identificazione di tutte le colonie microbiche coltivate su terreni di coltura e facilitando l'acquisizione di informazioni sulle unità formanti colonie (CFU)⁷. Questo approccio è già stato applicato con successo per scoprire comunità microbiche complesse come quelle presentate nell'intestino umano, coinvolte nelle infezioni del piede diabetico o connesse con il tratto urinario, rivitalizzando i metodi coltura-dipendenti nelle pratiche microbiologiche^10,11.

Questo protocollo è presentato per guidare i laboratori nell'implementazione efficace della MS per la valutazione di routine della sicurezza microbica nei prodotti lattiero-caseari, rispondendo all'esigenza dell'industria di un'identificazione microbica affidabile entro un tempo di consegna pratico (TAT) adatto ai processi di produzione. Il protocollo descrive in dettaglio le fasi cruciali, tra cui (1) l'isolamento microbico da prodotti lattiero-caseari liquidi (latte, panna, siero di latte) e solidi (burro, formaggio) utilizzando una selezione di terreni di coltura appropriati (de Man, Rogosa e Sharpe agar - MRS agar, M-17 agar, All-Purpose Tween 80 agar - APT agar, China Blue Lactose agar - CBL agar, Milk Plate Count Agar - MPCA, Tryptic Soy Agar - TSA) e condizioni di incubazione personalizzate; (2) procedure standardizzate di preparazione dei campioni per l'analisi MS, che offrono opzioni come il trasferimento diretto delle colonie, l'estrazione dell'acido formico sul bersaglio e l'estrazione di proteine etanolo/acido formico in provetta per adattarsi a diversi tipi di batteri e flussi di lavoro di laboratorio; e (3) analisi sistematica della MS, compresa la calibrazione dello strumento, la definizione dei parametri ottimali di acquisizione degli spettri e le linee guida per l'interpretazione dei dati, compresa la valutazione del valore del punteggio e i controlli di coerenza per un'assegnazione tassonomica sicura. Fornendo un approccio strutturato e convalidato, questo protocollo mira a migliorare l'accuratezza e l'efficienza del monitoraggio microbico nell'industria lattiero-casearia, contribuendo in ultima analisi a migliorare la qualità degli alimenti e la salute pubblica.

Protocollo

I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Isolamento di batteri correlati ai latticini

1. Ottenimento di colture batteriche da prodotti lattiero-caseari liquidi o solidi
   1. Selezione dei terreni di coltura
      1. Per l'isolamento batterico da campioni lattiero-caseari, selezionare i terreni di coltura in base ai gruppi microbici previsti, inclusi i terreni di crescita generale, i terreni per batteri Gram-negativi, i batteri lattici (LAB), i batteri che formano spore e i microrganismi a crescita lenta o fastidiosi.
         NOTA: Per massimizzare il recupero sia delle specie dominanti che di quelle rare, è necessario inoculare più terreni in parallelo. Nella Tabella 1 viene presentata una serie di terreni di esempio per l'analisi del microbioma da campioni di prodotti lattiero-caseari.
   2. Inoculazione e placcatura
      1. Ottenere un campione rappresentativo del prodotto lattiero-caseario e mescolare accuratamente.
      2. Trasferire asetticamente 1 mL (campioni liquidi: latte, panna, latticello) o 1 g (campioni solidi: formaggio, burro) del campione in una provetta da centrifuga conica da 15 mL contenente 9 mL di terreno liquido sterile (acqua peptonica / soluzione di NaCl allo 0,85%). Per i campioni solidi, riscaldare il mezzo liquido a 40-42 °C prima di aggiungere il campione.
      3. Omogeneizzare il campione agitando energicamente per 30-60 s. Per campioni grassi o duri, continuare l'omogeneizzazione fino ad ottenere una sospensione uniforme.
      4. Preparare una serie di diluizioni dieci volte prendendo 1 mL di sospensione e trasferendola in provette successive contenenti 9 mL di soluzione sterile. Mescolare bene ogni diluizione.
         NOTA: A seconda del tipo di campione e del livello previsto di contaminazione microbica, preparare diluizioni che vanno da ^10-1 a ^10-6. Per la maggior parte dei campioni, saranno sufficienti diluizioni fino a ^10-3 ; Tuttavia, quando si analizza il latte fresco o il formaggio erborinato, sarà necessario preparare ulteriori diluizioni. Per garantire un isolamento accurato e una facile selezione delle colonie, la diluizione ottimale dell'inoculazione dovrebbe fornire da 30 a 300 colonie per piastra. Questo intervallo consente una netta differenziazione delle singole colonie e riduce al minimo il rischio di crescita sovrapposta, facilitando l'ottenimento di colture batteriche non contaminate e omogenee per analisi successive. Per alcuni prodotti lattiero-caseari trasformati (ad esempio, latticello), per l'impiattamento diretto potrebbe essere utilizzato un campione fresco non diluito (ad esempio, 0,1 ml).
      5. Prelevare 0,1 mL del campione o della sua diluizione e trasferirlo sulla superficie di piastre di Petri precedentemente preparate contenenti il terreno di agar appropriato.
      6. Distribuire uniformemente l'inoculo sulla superficie dell'agar utilizzando uno spalmatore sterile. Lasciare assorbire l'inoculo nel terreno per 15 minuti, quindi capovolgere le piastre.
   3. Incubazione
      1. Incubazione aerobica: per tutti i campioni esaminati, inoculare piastre di agar APT, M-17, CBL, MPCA e TSA, incubare in condizioni aerobiche a 37 °C e 30 °C per 24 ore. Le temperature di incubazione sono state determinate in base ai requisiti di crescita ottimale di diversi gruppi microbici, cruciali per valutare sia la qualità igienica (30 °C per i mesofili generici) che la sicurezza per la salute pubblica (37 °C per i patogeni associati all'uomo e gli organismi indicatori) dei prodotti lattiero-caseari.
         NOTA: Se si prevede una crescita intensiva di batteri sporigeni, nel caso della TSA, è preferibile un tempo di incubazione più breve (~12 ore).
      2. Incubazione anaerobica: per tutti i campioni esaminati, inoculare le piastre di Agar MRS, incubare in condizioni anaerobiche a 37 °C e 30 °C per 24-72 ore, controllando la crescita microbica ogni giorno. Le temperature di incubazione sono state determinate come indicato al punto 3.1.
         NOTA: Le condizioni di incubazione anaerobica possono essere ottenute posizionando le piastre in contenitori ermetici con bustine che generano atmosfera anaerobica, che eliminano l'ossigeno e forniscono un'atmosfera adatta per la crescita di batteri anaerobici.
   4. Ottenere colture pure
      1. Dopo l'incubazione, ispezionare le piastre e selezionare le singole colonie cresciute in base alle loro caratteristiche morfologiche (ad esempio, dimensioni, forma, colore, consistenza).
      2. Purificare le colonie selezionate mediante subcoltura (striatura) sullo stesso terreno di agar utilizzando 1 μL di ansa microbica e le stesse condizioni di incubazione.

Terreno di coltura	Applicazione	Condizione di coltura
Agar di soia trittico (TSA)	terreno generico per la coltivazione di un'ampia gamma di batteri	30–37 °C, 24–48 h, aerobico
Blood agar (BLA; con il 5% di sangue di pecora)	arricchito, differenziazione dell'emolisi, utile per Streptococcus, Listeria, Bacillus	30–37 °C, 24–48 h, aerobico
MRS agar (de Man, Rogosa e Sharpe agar)	selettivo per Lactobacillus e altri LAB Aggiungere l'1% di Tween-80 per supportare la crescita di L. casei, L. delbrueckii, L. helveticus o L. acidophilus.	30 °C, 48–72 h, anaerobico o microaerofilo
Agar M17	selettivo per Lactococcus, Streptococcus thermophilus	30 °C, 48–72 h, anaerobico o microaerofilo
APT agar (Tween multiuso 80 agar)	selettivo per LAB e alcuni Bifidobatteri	30 °C, 48–72 h, anaerobico o microaerofilo
Scheadler agar	selettivo e arricchente, isolamento di anaerobi, tra cui Bifidobacterium, Clostridium	30–37 °C, 48–72 h, anaerobico
CBL agar (agar lattosio blu della Cina)	terreno differenziale, per batteri coliformi e altri batteri che fermentano il lattosio	37 °C, 24–48 h, aerobico
Conta su piastra del latte Agar (MPCA)	universale, per il numero totale di batteri mesofili aerobi	30–37 °C, 24–48 h, aerobico

Tabella 1: Elenco dei terreni suggeriti per l'analisi del microbioma di campioni lattiero-caseari con condizioni di coltura specificate.

2. Preparazione di campioni batterici per l'analisi MS

1. Prima di iniziare, preparare la soluzione a matrice MALDI
   NOTA: Il composto della matrice più comunemente usato è l'HCCA, acido α-ciano-4-idrossicinnamico. Questo composto è fotosensibile, quindi prepara e conserva la matrice in contenitori scuri o al riparo dalla luce.
   1. Preparare la miscela di solventi utilizzando le seguenti proporzioni: 50% acetonitrile (grado HPLC), 47,5% acqua (grado HPLC) e 2,5% acido trifluoroacetico (TFA).
   2. Sciogliere la matrice nella miscela di solventi fino a una concentrazione finale di circa 10 mg/mL (o fino alla saturazione - fino a quando i cristalli non disciolti rimangono visibili).
   3. Se la soluzione non è limpida (rimangono cristalli), centrifugare o filtrare la soluzione (ad esempio, attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm) per ottenere un liquido limpido.
      NOTA: La conservazione in frigorifero è consentita per brevi periodi, a condizione che il numero di cicli di sbrinamento sia basso.
2. Per identificare i batteri utilizzando la MS, utilizzare una delle 3 procedure di preparazione del campione:
   1. Trasferimento diretto di colonie - Utilizzare questo metodo più semplice e veloce quando si ha a che fare con batteri ben cresciuti e non resistenti alla lisi, come la maggior parte dei batteri Gram-negativi.
      1. Utilizzando un ansa sterile o uno stuzzicadenti, trasferire una piccola quantità (~1 μL) della colonia cresciuta in un punto della piastra MALDI.
      2. Spalmare il materiale batterico direttamente su un punto designato sulla piastra di destinazione MALDI per creare uno strato sottile e uniforme.
      3. Una volta essiccato, sovrapporre la macchia con 1 μL di soluzione di matrice HCCA e lasciare asciugare all'aria a temperatura ambiente.
   2. Estrazione dell'acido formico su bersaglio - Utilizzare per batteri difficili da identificare (ad esempio, Gram-positivi, lieviti) le cui pareti cellulari rendono difficile il rilascio di proteine senza ulteriori elaborazioni.
      1. Raccogli una piccola quantità di biomassa batterica da una singola colonia batterica utilizzando un'ansa microbica monouso o uno stuzzicadenti sterile.
      2. Spalmare il materiale batterico direttamente su un punto designato sulla piastra di destinazione MALDI per creare uno strato sottile e uniforme.
      3. Sovrapporre il materiale batterico spalmato con 1 μL di soluzione di acido formico al 70% e asciugare all'aria a temperatura ambiente.
      4. Una volta essiccato, sovrapporre la macchia con 1 μL di soluzione di matrice HCCA e lasciare asciugare all'aria a temperatura ambiente.
   3. Estrazione di proteine in provetta (metodo etanolo/acido formico) - Utilizzare questo metodo per microrganismi difficili da identificare, inclusi alcuni batteri Gram-positivi, lieviti e micobatteri.
      1. Utilizzando un ansa sterile o un tampone, trasferire 1-3 colonie complete da una piastra di coltura di agar a una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml contenente 300 μl di acqua sterile.
      2. Aggiungere 900 μl di etanolo assoluto per regolare la concentrazione finale di etanolo a circa il 75%. Mescolare o agitare per alcuni secondi.
      3. Centrifugare il campione per 2 minuti a 15.000 x g (temperatura ambiente).
      4. Scartare con cura il surnatante senza disturbare il pellet della cella.
         NOTA: In caso di tensioni mucose, si consiglia un'ulteriore centrifugazione a 4 °C.
      5. Lasciare aperto il tubo del pellet fino a quando tutto l'etanolo residuo non è evaporato (5-10 min, temperatura ambiente).
      6. Aggiungere 20-50 μl di acido formico (FA) al 70% di pellet di cellule essiccate. Miscelare mediante pipettaggio o vortice fino a quando il pellet non è completamente risospeso.
         NOTA: Il volume deve essere proporzionale alla quantità di materiale biologico.
      7. Aggiungere un volume uguale di acetonitrile (ACN) alla sospensione di acido formico. Mescolare accuratamente.
      8. Centrifugare a 15.000 x g per 2 min (temperatura ambiente).
      9. Trasferire 1 μl di surnatante in un punto designato su una piastra target MALDI.
      10. Lasciare asciugare completamente la macchia all'aria a temperatura ambiente.
      11. Sovrapporre il punto del campione essiccato con 1 μl di soluzione di matrice di acido α-ciano-4-idrossicinnamico (HCCA).
      12. Lasciare asciugare completamente la matrice all'aria a temperatura ambiente prima dell'analisi MS (Figura 1).
          NOTA: 70% Acido formico: corrosivo; provoca ustioni. Maniglia in una cappa aspirante. Acetonitrile: infiammabile e tossico. Tenere lontano dalle fiamme ed evitare inalazioni/contatti. Acido trifluoroacetico (TFA): forte, corrosivo e volatile; Evitare il contatto pelle/occhi e l'inalazione. Indossare sempre un camice da laboratorio, guanti resistenti agli agenti chimici e occhiali di sicurezza. Maneggiare tutti i reagenti in una cappa aspirante per evitare l'inalazione. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi; Lavorare lontano da fiamme libere. Raccogliere i rifiuti di solventi acidi e organici in contenitori compatibili e chiaramente etichettati per un corretto smaltimento.

Figura 1: Un albero decisionale che visualizza il processo di selezione di una procedura di preparazione del campione appropriata per l'identificazione degli isolati batterici tramite la tecnica MS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Acquisizione di spettri e identificazione microbica mediante la tecnica MS

1. Taratura
   NOTA: Per una determinazione accurata della massa in MS, prima di analizzare campioni sconosciuti, calibrare lo strumento utilizzando standard appropriati. Una corretta taratura dello strumento è fondamentale per un'identificazione affidabile.
   1. Preparare i punti di calibrazione sulla piastra target MALDI contenente 1 μL di: (a) Bacterial Test Standard (BTS), contenente un estratto di Escherichia coli DH5 alfa, che copre un intervallo di massa di 3,6-17 kDa (per MBT Biotyper); (b) Calibratore microbiologico contenente estratto proteico ATCC 25922 di E. coli , ribonucleasi e mioglobina, che copre un intervallo di massa compreso tra 3,6 e 17 kDa (per EXS2600 sistema). Lasciare asciugare all'aria e ricoprire i punti di calibrazione essiccati con 1 μL di soluzione di matrice HCCA, simile alla preparazione del campione.
   2. Caricare nello strumento la piastra target MALDI contenente i campioni preparati e i punti di calibrazione. Eseguire l'analisi dei punti di calibrazione utilizzando la modalità di calibrazione (automatica).
   3. Verificare la calibrazione per assicurarsi che l'accuratezza della massa rientri nei limiti accettabili (100 ppm) nell'intervallo di massa specificato (2-20 kDa).
2. Acquisizione spettri
   NOTA: Quando lo strumento viene calibrato, vengono acquisiti gli spettri di massa da ciascun punto del campione preparato.
   1. Parametri generali di acquisizione
      1. Utilizzare lo spettrometro di massa in modalità ionica positiva lineare.
      2. Impostare l'intervallo di rilevamento della massa da 2.000 a 20.000 m/z (2-20 kDa).
   2. Utilizzare le seguenti impostazioni specifiche dello strumento
      1. Tensioni della sorgente ionica: sorgente ionica 1 (IS1) a 20 kV, sorgente ionica 2 (IS2) a 18 kV, tensione dell'obiettivo a 9 kV. La tensione di accelerazione può arrivare fino a 25 kV.
      2. Tensione del rivelatore: impostata a circa 2,65 kV.
      3. Impostazioni di estrazione con ioni pulsati: 100 ns, tempo di estrazione ritardato fissato a 230 ns.
      4. Impostazioni della potenza del laser: regolare manualmente per ottenere la migliore qualità dello spettro (in base al numero di segnali e all'intensità del segnale), in genere compresa tra il 40% e il 65% della potenza minima richiesta.
      5. Numero di scatti per spettro: acquisire un numero sufficiente di scatti laser da diverse regioni di ciascun punto per generare uno spettro di somma con un buon rapporto segnale/rumore (S/N)→ (a) una media di 200 scatti, effettuati in incrementi di 50 scatti da 4 diverse regioni di ciascun punto o (b) l'acquisizione in incrementi di 500 scatti - 50 scatti da dieci diverse posizioni del punto bersaglio utilizzando la modalità AutoXecute.
   3. Strategia di misurazione del campione
      1. Misurare più punti per isolato (almeno 2 punti per isolato).
      2. Acquisire spettri in replica per ogni punto per garantire la coerenza e l'accuratezza dei risultati → misurare in duplicato, puntando a un certo numero di spettri totali per campione (4 spettri per campione almeno → repliche tecniche).
         NOTA: Sottoporre campioni biologici (almeno 3) per ottenere repliche biologiche.

4. Identificazione di microrganismi e analisi dei dati

NOTA: L'identificazione dell'organismo avviene confrontando il profilo proteico ottenuto (specifica "impronta digitale" proteica del microrganismo) con un database di riferimento e la correlazione risultante sia della posizione che dell'intensità del segnale viene utilizzata per generare un valore di corrispondenza, che descrive il livello di confidenza con cui l'organismo studiato è stato abbinato al suo corrispondente microrganismo di riferimento. Identifica i microrganismi confrontando gli spettri elaborati con i database di riferimento.

1. Elaborazione degli spettri
   1. Utilizzare un software appropriato per l'elaborazione degli spettri: (a) flexAnalysis per i sistemi MALDI Biotyper o (b) EX-Accuspec per i sistemi EXS2600.
   2. Applicare un metodo Savitzky-Golay come algoritmo di levigatura (larghezza 2 m/z, 10 cicli).
   3. Esegui la correzione della linea di base per rimuovere il rumore di fondo utilizzando l'algoritmo TopHat (soglia S/N = 2, larghezza filtro TopHat 0,2 Da ).
   4. Utilizzare una modalità centroide come algoritmo di rilevamento dei picchi (soglia S/N = 2 ).
2. Confronto tra database e interpretazione dei punteggi
   1. Caricare gli spettri di massa elaborati di isolati sconosciuti sulla piattaforma MALDI di identificazione microbica. Successivamente, eseguire l'identificazione.
      NOTA: In questi studi è stato utilizzato il seguente software: Biotyper versione 4.1.100, Ex-Accuspec versione V1. Nel caso del software MALDI Biotyper, si consiglia la creazione di spettri principali (MSP) da spettri grezzi per garantire la migliore affidabilità di corrispondenza.
   2. Valutare i risultati dell'identificazione in base alle soglie standard del produttore.
      NOTA: Per MALDI Biotyper e EXS2600, i valori del punteggio sono:
      2.300-3.000: identificazione di specie altamente probabile;
      2.000-2.299: identificazione sicura del genere, identificazione probabile della specie;
      1.700-1.999: probabile identificazione del genere;
      0,000-1,699: identificazione non affidabile.
      Durante la valutazione del risultato dell'identificazione derivato dalla piattaforma MALDI Biotyper, i risultati del supporto utilizzano le categorie di coerenza: A- Specie Coerente → migliore corrispondenza e tutte le altre corrispondenze con un valore di punteggio altrettanto alto (>1,999 ) puntano alla stessa specie; B - Genere Coerente → migliore corrispondenza e altre corrispondenze con valori di punteggio simili (1.700 - 1.999) puntano allo stesso genere, ma possono differire a livello di specie; C- Nessuna coerenza → non sono stati soddisfatti i requisiti per la coerenza a livello di specie o genere.

Risultati

Approccio culturale
L'approccio culturomico è una strategia volta a diversificare al massimo le condizioni di coltivazione dei microrganismi al fine di aumentare le possibilità di isolare, tra le altre, specie rare, difficili da coltivare o precedentemente non descritte¹². Ciò consente di ottenere un quadro molto più ampio della biodiversità della microflora presente in vari campioni, ad esempio campioni di alimenti. L'aumento della diversità d...

Discussione

Il protocollo dedicato all'identificazione microbica dei prodotti lattiero-caseari offre un importante progresso rispetto ai metodi tradizionali, garantendo un consenso ottimale su velocità, affidabilità ed economicità. Tuttavia, alcuni passaggi cruciali all'interno del protocollo richiedono un'attenzione particolare. In primo luogo, la fase di isolamento e coltura è fondamentale. I terreni di coltura e le condizioni di incubazione devono corrispondere alla diversità microbica e al caric...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
70% acido formico	Chempur	115676307
Acetonitrile	Merck KGaA	1.00014.1011
APT agar	Merck KGaA	1.10453.0500
Standard di Test Batterico	Bruker Daltonik GmbH	8255343
Agar CBL (Agar Lattosio Blu della Cina)	Merck KGaA	1.02348.0500
Agar di sangue Columbia	Ossassoide	CM0331B
Agar M17
Conteggio di Agar per Piastre di Latte (MPCA)	Ossassoide	CM0681
MRS agar (de Man, Rogosa e Sharpe Agar)	Merck KGaA	1.10660.0500
MSP 96 mira a BC in acciaio lucidato	Bruker Daltonik GmbH	8280800
Acqua a peptone	Sigma-Aldrich	70179
Agar di Scheadler	Sigma-Aldrich	91019
Sangue di pecora	Biomassimi	SL0160-100
Acido trifluoroacetico	Sigma-Aldrich	T6508
Agar di soia triptico (TSA)	Sigma-Aldrich	22091
Acqua	Merck KGaA	1.15333.2500
&alfa;-Ciano-4-acido idrossicinnamico	Bruker Daltonik GmbH	8201344