Articolo metodologico

Preparazione del campione per la spettrometria di massa a singola cellula Studi di metabolomica: lavaggio, tempra, essiccazione e conservazione combinati delle cellule

DOI:

10.3791/68995

⸱

16 settembre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, 2Department of Biochemistry and Physiology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo mira a preservare i metaboliti cellulari per la spettrometria di massa a singola cellula (SCMS) combinando il lavaggio con soluzione salina volatile, l'estinzione rapida dell'azoto liquido, la liofilizzazione e lo stoccaggio a -8 °C. Dimostra che l'estinzione dell'azoto liquido è essenziale per mantenere i profili dei metaboliti, mentre la conservazione prolungata del freddo dovrebbe essere ridotta al minimo per prevenire alterazioni metaboliche.

Abstract

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La spettrometria di massa a cellula singola (SCMS) è diventata uno strumento indispensabile per studiare il metabolismo cellulare. A causa dei progressi nelle moderne tecniche di spettrometria di massa (MS) e della domanda negli studi sull'eterogeneità cellulare nelle scienze biologiche fondamentali e nelle malattie umane, una varietà di diverse tecniche SCMS sono state sviluppate e applicate nella ricerca di laboratorio. Poiché i metaboliti possono riflettere accuratamente lo stato cellulare, l'analisi metabolomica SCMS di cellule vive è considerata un potente strumento per fornire informazioni molecolari sulle cellule. Tuttavia, una delle principali sfide nell'analisi SCMS di cellule vive è la conservazione dei profili dei metaboliti endogeni durante la preparazione, il trasporto e la misurazione del campione. I metaboliti cellulari subiscono un rapido ricambio e sono altamente sensibili ai cambiamenti ambientali, rendendoli suscettibili di degradazione o trasformazione prima dell'analisi. Per affrontare questa limitazione, presentiamo un protocollo di preparazione cellulare robusto e riproducibile, progettato per preservare l'integrità dei metaboliti cellulari per la SCMS. Il protocollo integra il lavaggio cellulare con una soluzione volatile di formiato di ammonio (AF), la tempra rapida con azoto liquido (LN2), la liofilizzazione sotto vuoto e lo stoccaggio a -80 °C. Questo approccio riduce al minimo i danni alla membrana cellulare e interrompe efficacemente l'attività metabolica. I risultati indicano che l'estinzione rapida delle cellule è vitale; tuttavia, è necessario limitare il tempo di conservazione a -80 °C per preservare i metaboliti cellulari. Il protocollo proposto può potenzialmente essere utilizzato per altre tecniche SCMS esistenti per ampie applicazioni.

Introduzione

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L'eterogeneità cellula-cellula è emersa come un principio fondamentale dei sistemi biologici, specialmente nei contesti della progressione della malattia, della resistenza ai farmaci e della differenziazione cellulare 1,2. Negli organismi pluricellulari, anche cellule geneticamente identiche nello stesso microambiente possono mostrare fenotipi distinti, derivanti da differenze a livello trascrittomico3, proteomico4 e, soprattutto, metabolomico5. Mentre la genomica e la trascrittomica a singola cellula hanno guadagnato una notevole trazione nell'ultimo decennio, la metabolomica a singola cellula rimane relativamente sottosviluppata a causa della complessità intrinseca e della rapida dinamica dei metaboliti6. I metaboliti sono altamente sensibili ai segnali ambientali, hanno strutture chimiche e polarità diverse7 ed esistono a basse concentrazioni in piccoli volumi cellulari8. Queste proprietà rendono la loro misurazione affidabile da singole celle una sfida analitica. Poiché la metabolomica offre l'istantanea più vicina dello stato funzionale di una cellula in tempo reale, l'avanzamento di metodi per studiare in modo robusto il metaboloma alla risoluzione di una singola cellula è essenziale per una comprensione più profonda della fisiologia e della patologia cellulare7.

Le tecniche tradizionali di metabolomica di massa mediano i segnali in grandi popolazioni cellulari, mascherando l'eterogeneità cellulare e potenzialmente oscurando firme metaboliche rare ma significative. Al contrario, la metabolomica a singola cellula rivela profili biochimici unici a livello di singola cellula, rendendola preziosa per lo studio di processi come la differenziazione delle cellule staminali, le risposte ai farmaci e i meccanismi della malattia 6,9,10,11,12,13. I metodi basati sulla spettrometria di massa (MS), come la MS di desorbimento-ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI) e la MS di ioni secondari (SI), hanno fatto progredire il campo, ma devono affrontare sfide come la preparazione complessa, i requisiti di vuoto e la ionizzazione distruttiva che limitano l'analisi delle cellule vive 9,14. In particolare, i recenti sviluppi nella strumentazione hanno portato a tecniche all'avanguardia, tra cui il MALDI in modalità di trasmissione accoppiato con postionizzazione indotta da laser (t-MALDI-215) e la spettrometria di massa di ioni secondari Orbitrap (OrbiSIMS)16,17, che hanno consentito l'imaging metabolico 3D ad alta risoluzione e senza marcatura a livello di singola cellula e subcellulare, offrendo un'eccezionale precisione di massa e risoluzione spaziale.

La MS a ionizzazione ambientale risolve questi problemi. Le tecniche SCMS ambientali rappresentative includono la spettrometria di massa video a singola cellula dal vivo (Video-MS)18, DESI19 e nano-DESI20. Tra queste, l'SCMS a sonda singola è una delle tecniche che si distingue per la sua capacità di campionare e ionizzare direttamente cellule vive in tempo reale utilizzando un sistema a doppio capillare 21,22,23,24. Questa tecnica riduce al minimo il disturbo del campione consentendo al contempo un profilo metabolico in situ ad alta risoluzione ed è stata applicata con successo a studi sull'assorbimento e l'influenza dei farmaci sul metabolismo cellulare 22,25,26,27,28,29,30, sulle risposte ambientali 31,32 e sull'eterogeneità metabolica33, 34,35,36 tra le singole cellule.

Sebbene molti metodi SCMS ambientali consentano l'analisi di cellule vive, in genere soffrono di una bassa produttività a causa della manipolazione manuale richiesta per la selezione delle singole cellule 23,37,38. Poiché il metabolismo cellulare è altamente dinamico, la preparazione prolungata del campione può alterare i profili dei metaboliti. Per risolvere questo problema, i ricercatori applicano tecniche di quenching subito dopo aver isolato le cellule39,40. La tempra arresta l'attività metabolica mediante un rapido raffreddamento 41,42,43,44 o la denaturazione enzimatica 43,45,46,47, preservando lo stato biochimico delle cellule in un momento specifico. Questo passaggio è fondamentale per garantire dati metabolomici accurati e temporalmente rilevanti. Un protocollo di quenching efficace deve arrestare rapidamente e completamente l'attività metabolica intracellulare. Sono stati valutati vari metodi, tra cui soluzione salina isotonica fredda48, acetonitrile46 refrigerato, metanolo freddo 44,47,48,49, soluzione tampone fosfato ghiacciato (PBS)43,50, LN2 43,44,51 e persino trattamenti con aria calda 52. Mentre molti di questi sono stati originariamente sviluppati per la metabolomica cellulare di massa, alcuni, come il metanolo freddo e l'acetonitrile, sono stati adattati per tecniche a singola cellula come Pico-ESI-MS39 e MALDI-MS46. Nonostante la loro efficacia, ogni metodo presenta degli svantaggi: i solventi organici possono causare perdite di metaboliti e danni alle membrane cellulari48,53 e le soluzioni saline non volatili possono interferire con la MS causando soppressione ionica54, riducendo la sensibilità e compromettendo l'accuratezza dei dati47,55.

Lo snap-freezing LN2 è comunemente usato nella ricerca biologica56 perché arresta rapidamente il metabolismo cellulare senza lasciare sali non volatili, rendendolo adatto per l'SCMS. Tuttavia, può danneggiare le membrane cellulari, il che è problematico per SCMS 57,58. Per ridurre questo danno, alcuni studi hanno utilizzato un metodo che prevede la filtrazione rapida, il lavaggio a freddo con NaCl e il congelamento di LN2, che aiuta a trattenere i metaboliti a rapido turnover53,59. Tuttavia, questo metodo non è l'ideale per l'SCMS a causa delle difficoltà nell'isolare le singole cellule e dei potenziali effetti della matrice dai residui di sale. La conservazione a -80 °C è un altro metodo di conservazione comune, ma i suoi effetti sui profili dei metaboliti di singole cellule rimangono poco chiari. In precedenza abbiamo riportato studi per affrontare queste limitazioni combinando più passaggi chiave: le cellule vengono prima lavate con una soluzione AF volatile compatibile con MS, quindi temprate con LN2, liofilizzate sotto vuoto e conservate a bassa temperatura (-80 °C)60. L'approccio attuale riduce al minimo il danno cellulare e la degradazione dei metaboliti, consentendo misurazioni SCMS più accurate. Questo lavoro è focalizzato sui dettagli sperimentali, con l'obiettivo di promuovere l'adozione di questo metodo di preparazione cellulare per tecniche SCMS robuste.

Protocollo

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Esegui ogni passaggio all'interno di un laboratorio di biosicurezza certificato di Classe II e in condizioni sterili. In questo studio, la linea cellulare HCT-116 è stata utilizzata come sistema modello e le cellule sono state coltivate in terreno di coltura completo. I reggenti e l'equipaggiamento utilizzato sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Coltura cellulare

  1. Preparare un terreno completo. Integrare il terreno 5A di McCoy con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina. Scaldare a 37 °C.
  2. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con CO2 al 5%. Monitora la confluenza quotidianamente e il passaggio quando le colture raggiungono una confluenza del ~80%.
  3. Passaggio delle celle (ogni ~2 giorni).
    1. Aspirare il terreno e risciacquare una volta con 5 ml di 1x PBS.
    2. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% alla piastra di coltura e incubare a 37 °C per 3 minuti per facilitare il distacco delle cellule.
    3. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 8 mL di terreno completo preriscaldato e pipettando delicatamente per disperdere le cellule.
    4. Trasferire 1 mL di sospensione in 9 mL di terreno completo fresco.
    5. Conta le celle.
      NOTA: Le celle sono state contate utilizzando un contatore di celle automatizzato TC20 secondo le istruzioni del produttore. Non sono stati utilizzati blu di tripano o altri agenti coloranti.
  4. Cellule seme sui vetrini.
    1. Diluire le cellule a una concentrazione finale di ~1 × 106 cellule/mL.
    2. Posizionare i singoli vetrini coprioggetti in vetro da 18 mm nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti.
      NOTA: I vetrini coprioggetti devono essere sterilizzati in autoclave prima di essere utilizzati per la coltura cellulare.
    3. Aggiungere 2 mL del terreno completo e 200 μL della sospensione cellulare (~2 × 105 cellule/pozzetto).
    4. Incubare le cellule durante la notte per consentire l'adesione delle cellule.
      NOTA: Per assicurarsi che le cellule siano in normale stato di crescita, controllare regolarmente la morfologia delle cellule e il loro stato di crescita (utilizzando un microscopio) ed esaminare la potenziale contaminazione da micoplasma (utilizzando un kit di rilevamento del micoplasma).

2. Lavaggio delle cellule con soluzione di formiato di ammonio (AF)

NOTA: Preparare ogni volta una soluzione AF fresca.

  1. Preparare il tampone di lavaggio AF. Pesare 0,45 g di formiato di ammonio e sciogliere in 50 mL di acqua di grado LC/MS. La concentrazione finale di formiato di ammonio è 0,14 M (0,9% p/p).
    NOTA: Conservare la soluzione ghiacciata (0-4 °C) fino al momento dell'uso.
  2. Aggiungere 2 mL di soluzione AF fredda a ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti.
  3. Sciacquare i vetrini. Utilizzando un paio di pinze sterili per sollevare delicatamente ogni vetrino coprioggetto contenente cellule aderenti dal suo pozzetto, quindi posizionarlo brevemente (per 2-3 s) in un pozzetto separato pre-riempito con 2 mL di soluzione fredda di formiato di ammonio (FA) allo 0,9%. Ripetere il processo di risciacquo.
    NOTA: Per evitare di disturbare le celle durante la fase di lavaggio, eseguire il risciacquo delle celle molto delicatamente.

3. Tempra cellulare con azoto liquido (LN2)

  1. Posizionare ogni vetrino coprioggetti risciacquato con AF (le cellule rivolte verso l'alto) nella capsula di Petri all'interno del contenitore di alluminio.
    NOTA: Indossare guanti criogenici, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Eseguire tutte le manipolazioni LN2 in un'area ben ventilata. Il foglio di alluminio può essere utilizzato per piegare un contenitore per la tempra LN2 .
  2. Versare lentamente 10-20 mL di azoto liquido sui vetrini, garantendo una copertura completa.
  3. Inclinare immediatamente la capsula di Petri con una pinzetta per travasare l'azoto liquido residuo.
    NOTA: Completare questa azione entro pochi secondi per evitare la formazione di grandi cristalli di ghiaccio a causa dell'umidità residua del lavaggio.

4. Liofilizzazione cellulare sottovuoto

  1. Liofilizzare immediatamente dopo la tempra LN2 per evitare lo scongelamento.
    NOTA: Rimuovere il rotore dello SpeedVac per creare una piattaforma piatta che possa ospitare una piastra di Petri da 100 mm.
  2. Utilizzando guanti criogenici e pinzette isolanti, posizionare la capsula di Petri contenente i vetrini coprioggetti refrigerati LN2 sulla camera del concentratore a vuoto.
  3. Lavorare utilizzando le impostazioni di vuoto standard e continuare per 5-7 minuti fino a quando l'LN2 visibile non è evaporato e i vetrini coprioggetti appaiono asciutti. I vetrini coprioggetti essiccati non devono contenere residui di LN2 e cristalli di ghiaccio.

5. Conservazione delle celle in un congelatore a -80 °C

  1. Avvolgere il contenitore con un tovagliolo di carta e trasferirlo in un congelatore a -80 °C per 48 ore.
  2. Dopo la conservazione, trasferire immediatamente i vetrini coprioggetti contenenti la piastra di Petri in un essiccatore a temperatura ambiente per ~10 minuti. Assicurarsi che la brina condensata o l'acqua sui vetrini coprioggetti scompaiano completamente prima di estrarli dall'essiccatore.
    NOTA: Il rapido trasferimento dei vetrini coprioggetti all'essiccatore riduce al minimo la condensa; Anche una piccola bagnatura superficiale può dissolvere i metaboliti essiccati.
  3. Dopo il lavaggio AF, dividere i campioni in due gruppi (Gruppo 1 e Gruppo 2). Applicare i seguenti protocolli di elaborazione.
    Gruppo 1: Quench LN2 → liofilizzazione → analisi SCMS (senza stoccaggio).
    Gruppo 2: Quench → liofilizzazione LN2 → a −80 °C Conservazione 48 ore → analisi SCMS.
  4. Procedere con l'analisi SCMS come descritto di seguito.
    NOTA: È possibile preparare più gruppi di celle utilizzando condizioni diverse. Il Gruppo 1 e il Gruppo 2 sono utilizzati per illustrare i protocolli generali.

6. Fabbricazione a sonda singola e configurazione SCMS

NOTA: La sonda singola è fabbricata in conformità con le procedure stabilite 21,24,60,61 e qui vengono forniti solo brevi protocolli.

  1. Tirare l'ago al quarzo a doppio foro utilizzando un estrattore laser e generare una punta di ~10 μm. Assemblare una sonda singola inserendo il capillare di silice fusa e l'emettitore nano-ESI nell'ago di quarzo a doppio foro. Fissare tutti i componenti a un vetrino con resina epossidica a presa rapida.
  2. Montare la sonda singola sullo stadio XYZ. Fissare la sonda singola a un manipolatore XYZ motorizzato posizionato sotto un microscopio digitale.
  3. Accoppia la configurazione a uno spettrometro di massa per l'analisi SCMS.
  4. Utilizzare acetonitrile (≥99,9%) contenente lo 0,1% di acido formico come solvente da estrazione a una velocità di flusso di 150 nL/min erogato da una pompa a siringa.
  5. Impostare i parametri MS.
    Modalità ioni positivi: m/z 200-1500, +2,9 kV, risoluzione di massa 120 k (a m/z 200).
    Modalità ioni negativi: m/z 70-900, −2,1 kV, risoluzione di massa 120 k (a m/z 200).
    NOTA: Poiché gli ioni negativi vengono generalmente rilevati nell'intervallo m/z inferiore a quello degli ioni positivi, è possibile utilizzare intervalli m/z diversi per queste due modalità ioniche. Ulteriori impostazioni MS includono un tempo di iniezione massimo di 100 ms, una microscansione, controllo automatico del guadagno (AGC) standard, modalità di scansione completa (per l'analisi MS), dissociazione collisionale (HCD) ad alta energia (HCD) (per l'analisi MS/MS) con 10-35 energia di collisione normalizzata (NCE) e 320 °C per la temperatura del tubo di trasferimento ionico. Ad ogni scansione/punto temporale è stato generato un cromatogramma ionico totale (TIC) per monitorare la stabilità del segnale e il rilevamento di singole cellule.

7. Esperimenti SCMS a sonda singola

  1. Posizionare i due vetrini coprioggetti (Gruppo 1 e Gruppo 2) insieme sullo stadio XYZ motorizzato della configurazione SCMS a sonda singola 21,24,61.
  2. Per ridurre al minimo gli effetti batch, selezionare le celle in modo casuale al microscopio.
  3. Acquisisci spettri di massa in modalità ionica positiva e negativa. Analizza più celle (ad esempio, ~30) per gruppo con la stessa sonda singola, velocità di flusso del solvente e tensione di ionizzazione.
    NOTA: Utilizzare la stessa sonda singola, la stessa portata del solvente e le stesse tensioni di ionizzazione per ogni esperimento per garantire la comparabilità dei dati. Calibrare l'Orbitrap ogni giorno prima dell'acquisizione. Sia le analisi MS che quelle MS/MS possono essere eseguite a livello di singola cellula. Raccogli i dati MS per ottenere valori m/z accurati per studi sui profili dei metaboliti e sulle etichette provvisorie in analisi non mirate. Condurre analisi MS/MS di ioni selezionati per l'identificazione molecolare in analisi mirate. I dati sono stati acquisiti utilizzando un software di acquisizione e interpretazione dei dati compatibile.

8. Analisi dei dati

  1. Pre-elaborare i dati SCMS non elaborati usando uno script R personalizzato. Le fasi di pre-elaborazione includono la rimozione del fondo e del rumore e la normalizzazione dell'intensità ionica a TIC 11,12,23.
  2. Deisotope i dati SCMS utilizzando il pacchetto Python ms_deisotope.
  3. Esegui l'allineamento dei picchi utilizzando uno script Python60 interno. Utilizzare una larghezza del contenitore di 0,01 m/z per il binning. Utilizzare una tolleranza di massa di 0,01 m/z o 5 ppm per l'allineamento dei picchi.
  4. Esecuzione di analisi statistiche dei dati con MetaboAnalyst 6.062. Condurre un t-test e generare una mappa di calore (per i livelli relativi di metaboliti). Seleziona Usa i primi 100 nel T-test/ANOVA per generare i primi 100 metaboliti, classificati in base ai valori p dal basso al massimo, con una differenza significativa (p < 0,05) dal confronto. Traccia una mappa di calore utilizzando questi 100 metaboliti principali.
  5. Cerca valori m/z accurati e spettri MS/MS nel database del metaboloma umano (HMDB63). Utilizzare una tolleranza di massa di 10 ppm nella ricerca di database MS.
    NOTA: Altri database, come LipidMaps64, possono essere utilizzati per la ricerca nei database.

Risultati

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Questo rapporto descrive una metodologia che integra il lavaggio cellulare, la tempra rapida delle celle, l'essiccazione sotto vuoto e lo stoccaggio a -80 °C (Figura 1). In particolare, questo approccio è progettato per preservare lo stato metabolomico delle cellule prima dell'analisi SCMS. L'efficacia di questo protocollo è stata testata preparando le cellule in due diverse condizioni: cellule appena temprate ed essiccate (Gruppo 1, che funge da controllo) e cellule temprate, essiccate e conservate a -80 °C (Gruppo 2). Ogni gruppo è stato analizzato utilizzando il metodo SCMS a sonda singola sia in modalità ionica positiva che negativa. L'analisi delle componenti principali (PCA) e la visualizzazione della mappa di calore sono state utilizzate per valutare le differenze nei profili metabolomici tra i gruppi.

I risultati della PCA nella modalità ionica positiva (Figura 2A) hanno rivelato che i gruppi 1 e 2 avevano profili metaboliti complessivi simili. I profili quasi identici del Gruppo 1 e del Gruppo 2 dimostrano che la conservazione a -80 °C per 48 ore non altera significativamente il metaboloma se le cellule vengono adeguatamente estinte prima dell'essiccazione. Nella modalità ionica negativa (Figura 2B), si osserva un modello comparabile, sebbene il Gruppo 2 appaia leggermente più distinto, potenzialmente a causa delle differenze di ionizzazione tra specifiche classi di metaboliti, ad esempio, le fosfatidilcoline sono meglio rilevate in modalità positiva, mentre gli acidi grassi ionizzano in modo più efficiente in modalità negativa60. Nonostante questa variazione, il raggruppamento coerente tra i gruppi 1 e 2 in entrambe le modalità supporta la conclusione che il protocollo integrato di quenching-drying-storage mantiene l'integrità metabolica.

L'analisi della mappa di calore ha ulteriormente convalidato i risultati della PCA raffigurando le abbondanze relative dei primi 100 metaboliti in due gruppi. Come mostrato nella Figura 3, i primi 100 metaboliti mostrano modelli di abbondanza altamente coerenti tra il Gruppo 1 e il Gruppo 2 in entrambe le modalità ioniche. Non sono stati osservati cambiamenti importanti o raggruppamenti specifici del gruppo, sebbene variazioni minori in alcuni cluster di metaboliti possano riflettere differenze nell'efficienza di ionizzazione o nella stabilità dei metaboliti. Questi risultati dimostrano collettivamente che il flusso di lavoro quenching-drying-storage preserva i profili metabolomici cellulari con alta fedeltà, rendendolo adatto per le applicazioni SCMS ambientali.

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Figura 1: Flusso di lavoro generale per l'analisi della spettrometria di massa a singola cellula (SCMS) che indaga su come il quenching di LN2 e la conservazione di 48 ore a -80 °C influenzino i profili dei metaboliti nelle singole cellule. (A) Le cellule sono state seminate, incubate e risciacquate utilizzando una soluzione di formato ammonio (AF). (B) Sono stati preparati due gruppi di cellule: Gruppo 1: le cellule sono state lavate, spente e liofilizzate per esperimenti SCMS immediati senza conservazione; Gruppo 2: le celle sono state lavate, temprate, liofilizzate e conservate a -80 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Analisi delle componenti principali (PCA) dei dati SCMS da cellule HCT-116 in gruppi sperimentali in (A) modalità ioni positivi e (B) modalità ioni negativi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Mappe di calore che mostrano i livelli relativi dei primi 100 metaboliti rilevati in singole cellule HCT-116 preparate in varie condizioni, presentate per (A) modalità di ioni positivi e (B) modalità di ioni negativi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Un passaggio critico di questo protocollo è l'estinzione immediata delle cellule vive utilizzando LN2 dopo il lavaggio con AF, che riduce sostanzialmente l'attività enzimatica e arresta i processi metabolici in corso. Inoltre, il lavaggio delle celle con AF prima del quenching ha aumentato l'intensità ionica e ridotto gli effetti della matrice, supportandone l'inclusione come fase preparatoria per migliorare la sensibilità all'SCMS. Negli studi attuali, le cellule di gruppi diversi (cioè il Gruppo 1 e il Gruppo 2) sono state coltivate utilizzando lo stesso lotto iniziale per ridurre al minimo la loro varianza biologica. Il tempo di conservazione di 48 ore è stato scelto perché le cellule con un tempo di crescita aggiuntivo (Gruppo 1) possono ancora mantenere densità cellulari adeguate (ad esempio, per evitare aggregati cellulari) per l'analisi SCMS comparativa con le cellule conservate (Gruppo 2). Tuttavia, è necessaria cautela quando si fa affidamento sulla conservazione a freddo, anche per 48 ore, poiché sono stati ancora osservati cambiamenti metabolici significativi nel confronto tra campioni appena essiccati e conservati (Gruppo 1 vs. Gruppo 2). Sebbene negli studi reali, i campioni di cellule e tessuti siano comunemente conservati per periodi più lunghi (ad esempio, per settimane e mesi) in un congelatore a -80 °C, si suggerisce di ridurre il tempo di conservazione per ridurre al minimo i cambiamenti nei metaboliti.

La risoluzione dei problemi dovrebbe quindi concentrarsi sulla riduzione al minimo del tempo tra l'essiccazione e l'analisi SCMS, assicurando che le condizioni di scongelamento evitino la condensa o la reidratazione parziale. Il contenuto di acqua residua e la condensazione dell'acqua durante le transizioni dei campioni possono reidratare parzialmente le cellule e consentire reazioni enzimatiche e chimiche come l'idrolisi, l'ossidazione e la proteolisi che degradano i metaboliti65, portando a cambiamenti artificiali nella composizione dei metaboliti. I campioni accuratamente essiccati arrestano efficacemente questi processi e preservano l'integrità molecolare66. Garantire un ambiente di essiccazione privo di umidità e una rapida transizione all'SCMS è la chiave per evitare queste insidie.

Nonostante il successo di questo metodo nel preservare i profili dei metaboliti, permangono dei limiti. Il metodo richiede l'accesso a un sistema di essiccazione sottovuoto e a un congelatore a -80 °C e non è completamente efficace per la conservazione a lungo termine. Inoltre, mentre l'essiccazione rapida a temperatura ambiente preserva temporaneamente i metaboliti, non sostituisce l'estinzione LN2 . Possono comunque verificarsi alterazioni legate alla conservazione a causa di una rimozione incompleta dell'acqua e del rischio di reidratazione durante la manipolazione del campione. Queste limitazioni evidenziano la necessità di perfezionare il metodo se si desidera un'archiviazione più lunga o una velocità effettiva più elevata.

I protocolli riportati in questo lavoro offrono un approccio semplificato ed efficace per preservare il metaboloma a singola cellula per la SCMS ambientale. A differenza dei metodi che richiedono crioprotettori elaborati o il congelamento in situ, il nostro flusso di lavoro è facilmente compatibile con le tecniche di ionizzazione ambientale esistenti e consente tempistiche flessibili di campionamento e analisi. L'integrazione del lavaggio cellulare, del quenching, dell'essiccazione e della conservazione a breve termine senza una sostanziale perdita di fedeltà metabolomica offre una soluzione pratica per i laboratori che non hanno accesso on-demand agli spettrometri di massa. Questo approccio ha un forte potenziale per far progredire la ricerca nella biologia dei sistemi a singola cellula, nel metabolismo del cancro, nell'eterogeneità della risposta ai farmaci e nella fenotipizzazione metabolica di popolazioni cellulari rare. L'ampia applicabilità di questi protocolli, in particolare per le piattaforme SCMS basate sulla ionizzazione ambientale, li rende un importante contributo al campo delle tecniche analitiche a singola cellula. Negli studi futuri, questi protocolli possono essere adattati e perfezionati per adattarsi a una più ampia varietà di tipi di cellule. Con ulteriori fasi di preparazione del campione (ad esempio, l'applicazione della matrice), le cellule processate possono essere potenzialmente analizzate con altre tecniche SCMS (ad esempio, MALDI e SIMS), offrendo una risoluzione spaziale e una produttività più elevate per l'analisi di un numero maggiore di cellule (ad esempio, cellule altamente confluenti). I risultati suggeriscono anche che questi protocolli di quenching-drying-storage possono essere potenzialmente utilizzati per preparare le celle per la spedizione (ad esempio, in contenitori di ghiaccio secco), consentendo studi SCMS collaborativi in luoghi diversi.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato dalla National Science Foundation (2305182), dal National Institutes of Health (1R01AI177469) e dalla Chan Zuckerberg Initiative. La Figura 1 è stata creata in BioRender (https://BioRender.com/yqn5isk).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
-80 ° C congelatoreEppendorf Nuovo BrunswickU700Preparazione del campione
AcetontrileThermoFisher Scientifico240744Configurazione dell'esperimento SCMS
Formiato di ammonio ThermoFisher Scientifico401152500Preparazione del campione
Vetrino coprioggetti 18 mmVetro di copertura micro VMR48380046Coltura cellulare
Stereomicroscopio digitaleShenzhen D & F Co.Supereyes T004Analisi
Tubo in quarzo a doppio foro, 1,120 "x0,005" x12 "Friedrich & Dimmock, Inc.MBT-005-020-2QFabbricazione a sonda singola
Resina epossidicaDevconCodice-No 20945Fabbricazione a sonda singola
Acido formicoLa scienza di Ward 470301-120 500mLConfigurazione dell'esperimento SCMS
Capillare in silice fusa, ID: 40 µ m, OD: 100 µ mTecnologie PolymicroTSP040105Fabbricazione a sonda singola
Capillare in silice fusa, ID: 50 µ m, OD: 150 µ mTecnologie Polymicro1068150015Configurazione dell'esperimento SCMS
Vetrini coprioggetti, 18mmVWR 48380046Coltura cellulare
HyClone Siero sintetico (FBS)CloneSH3006603Coltura cellulare
Incubatrice HeraCell (Heraeus)Coltura cellulare
Estrattore laserSutter Instrument Co.Modello P-2000Fabbricazione a sonda singola
Lampada UV a LEDAttrezzatura dentale Foshan Liang YaLY-C240Fabbricazione a sonda singola
5A di McCoy Gibco 2537128Coltura cellulare
MicrounioneIDEX Salute & Scienza LLCM-539Configurazione dell'esperimento SCMS
Interfaccia FAIMS pro modificata Thermo Fisher 98100-20046Analisi
Kit di rilevamento del micoplasma MycoAlert PLUSLonzaLT07-703Coltura cellulare
Scheda ottica Thorlabs Inc., NewtonAnalisi
Acqua di grado LC/MS Optima (Fisher Chemical, USA)ThermoFisher ScientificoW6500Preparazione del campione
Spettrometro di massa Orbitrap Exploris 240 ThermoFisher ScientificoConfigurazione dell'esperimento SCMS
Penicillina/StreptomicinaGibco15140-122Coltura cellulare
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)VWR0780-50LColtura cellulare
Concentratore SpeedVac (Savant)ThermoFisher Scientifico SPD111 VPreparazione del campione
Pompa a siringa (SKE10)Chemyx Inc.80561Configurazione dell'esperimento SCMS
Siringa, 250 &; micro; LHamilton1725LTN250ULConfigurazione dell'esperimento SCMS
TC20 Contatore di celle automatizzatoLaboratori Bio-Rad Codice 1450102EDUConteggio delle celle
Piatto per coltura tissutale, 100 mmFisher scientifico FB012924Coltura cellulare
Tripsina-EDTAThermoFisher Scientifico25200-072Coltura cellulare
Microscopio digitale USB ("Scorpio" 500 Zoom)Chinavasion, Commercio all'ingrosso Ltd.Analisi
Resina a polimerizzazione UVPrime DentaleN. articolo 006.030Fabbricazione a sonda singola
Software XcaliburThermoFisher Scientifico
Stadio XYZ (CONEX- MFACC)Newport Corp.Analisi

Riferimenti

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