Induzione di precisione e distinzione dei riflessi di tosse e starnuti nei topi

Sommario

Questo studio ha stabilito modelli di tosse e starnuti nei topi applicando stimoli specifici alla trachea e alla cavità nasale e ha sviluppato un metodo basato sull'audio per distinguere tra tosse e starnuti di topo analizzando le differenze nei loro segnali acustici.

Abstract

La tosse e gli starnuti, come riflessi difensivi respiratori vitali, hanno visto la ricerca sui loro meccanismi limitata dalla stimolazione aspecifica inerente ai modelli tradizionali. I metodi esistenti, come la capsaicina o la nebulizzazione dell'acido citrico, possono attivare contemporaneamente la tosse (mediata dalle fibre C tracheali) e gli starnuti (mediati dai nervi trigemino nasali), portando a osservazioni comportamentali confuse. Sebbene studi precedenti abbiano tentato di distinguere tosse e starnuti analizzando i modelli respiratori o le firme acustiche, questi studi mancano di modelli in grado di stimolare specificamente la trachea e la cavità nasale. Qui, abbiamo sviluppato un modello murino che impiega la stimolazione sito-specifica della trachea (per indurre la tosse) e della cavità nasale (per innescare lo starnuto). Utilizzando registrazioni multimodali sincronizzate, pletismografia di tutto il corpo (WBP), microfoni ultrasonici a banda larga (0-250 kHz) e videografia ad alta velocità (160 fps), abbiamo quantificato distinte firme fisiologiche di tosse e starnuti. I nostri risultati hanno rivelato che sia la tosse che gli starnuti mostrano modelli respiratori a picco singolo e doppio, con differenze significative nella composizione degli spettri di frequenza audio. Costruendo un sistema di coordinate basato sulle caratteristiche audio, siamo stati in grado di distinguere efficacemente tosse e starnuti, mappandoli su diversi quadranti dell'asse delle coordinate. Questo studio, attraverso la stimolazione anatomicamente specifica e l'analisi delle caratteristiche acustiche, ha stabilito un modello murino in grado di distinguere quantitativamente tra tosse e starnuti, fornendo un metodo sperimentale ad alta precisione per lo studio dei riflessi di difesa delle vie aeree e lo sviluppo terapeutico mirato.

Introduzione

La tosse e gli starnuti sono riflessi difensivi cruciali per il corpo per eliminare le sostanze estranee dalle vie respiratorie e le anomalie nei percorsi neurali correlati spesso innescano malattie croniche, come la tosse cronica e la rinite. Entrambi i riflessi coinvolgono una fase inspiratoria, una fase compressiva e una fase espiratoria ^1,2. Il riflesso della tosse è mediato principalmente dai neuroni sensoriali delle vie aeree innervati dal nervo vago ^3,4,5. I neuroni del vago ricevono stimoli meccanici, chimici o elettrici dalle vie aeree e trasmettono i segnali al nucleo del tratto solitario (NTS) nel midollo allungato⁶. L'NTS integra queste informazioni e successivamente le proietta ai centri respiratori nel midollo e nel ponte⁷. Questi centri coordinano infine i gruppi muscolari respiratori rilevanti (come il diaframma, i muscoli intercostali e i muscoli laringei) per eseguire l'azione della tosse, espellendo sostanze irritanti e muco potenzialmente dannosi dal tratto respiratorio attraverso la cavità orale ^8,9,10. Il riflesso dello starnuto è mediato principalmente dai neuroni sensoriali nasali all'interno del ganglio trigemino^11,12. I loro stimoli meccanici o chimici vengono trasmessi al nucleo trigemino spinale (SP5), che poi trasmette le informazioni ai centri respiratori 13,14,15,16. Questi centri regolano i muscoli rilevanti (come i muscoli respiratori, i muscoli palatali e i muscoli facciali) per avviare uno starnuto¹⁷. Il potente scoppio espiratorio dello starnuto spinge la maggior parte dell'aria fuori dal naso per espellere le sostanze irritanti ^9,18. La ricerca su tosse e starnuti non solo aiuta a chiarire i meccanismi neurali della difesa respiratoria, ma fornisce anche bersagli terapeutici per la tosse cronica e la rinite. A tal fine, è di fondamentale importanza stabilire un modello animale robusto e affidabile.

Negli ultimi anni, i topi sono emersi come un organismo modello fondamentale per lo studio dei percorsi neurali della tosse e dello starnuto 19,20,21. La metodologia attuale predominante prevede ancora l'induzione di questi comportamenti riflessi attraverso l'inalazione di composti stimolanti aerosolizzati ^8,20,22. Una limitazione significativa di questo approccio inalatorio è che gli stimoli agiscono simultaneamente sia sulla cavità nasale che sulla trachea, attivando in modo non specifico i distinti sistemi afferenti sensoriali che mediano lo starnuto (attraverso la via del trigemino) e la tosse (attraverso la via vagale). Ciò pone una sfida sostanziale per la differenziazione precisa del tipo di comportamento suscitato negli esperimenti. Questa discrepanza è evidente in letteratura: alcuni studi definiscono i riflessi respiratori indotti dalla capsaicina nei topi come starnuti²¹, mentre altri riportano che questi riflessi comprendono sia i componenti della tosse che quelli dello starnuto ^8,22.

Per affrontare questa sfida, sono state sviluppate metodologie avanzate, tra cui l'analisi dei modelli e delle traiettorie respiratorie per classificare comportamenti riflessi distinti⁸. Un altro studio dimostra che tosse e starnuti presentano marcate differenze nelle caratteristiche temporali e spettrali, come la durata, la modulazione di frequenza²². Il loro lavoro ha evidenziato che la tosse mostra una concentrazione di energia in intervalli di frequenza di picco più bassi (20-80 kHz), mentre gli starnuti mostrano componenti che si estendono oltre i 90 kHz²². Queste divergenze acustiche offrono un quadro innovativo e non invasivo per la discriminazione comportamentale, integrando le tradizionali analisi delle forme d'onda respiratorie. Nonostante queste innovazioni, persiste una lacuna critica: i modelli esistenti mancano di specificità anatomica nell'erogazione dello stimolo, spesso confondendo le vie dei riflessi tracheali e nasali. Questa limitazione dimostra che abbiamo bisogno di modi migliori per indirizzare e studiare i riflessi respiratori.

La ricerca sui meccanismi alla base della tosse e degli starnuti indotti dalla stimolazione meccanica e chimica delle vie aeree è stata ampiamente condotta in modelli animali di grandi dimensioni (ad esempio, gatti)¹⁷. Tuttavia, nei modelli di piccoli animali (ad esempio, porcellini d'India, ratti e topi), le limitazioni tecniche hanno tipicamente richiesto l'affidamento su composti aerosolizzati (come la capsaicina o l'acido citrico) per ottenere la stimolazione chimica.

Questo protocollo propone un nuovo metodo per indurre comportamenti simili alla tosse e allo starnuto nei topi e stabilisce una nuova serie di metodi per quantificare e caratterizzare questi riflessi respiratori. Questo approccio stabilisce una strategia per differenziare i comportamenti simili alla tosse e agli starnuti nei topi, identificando le vocalizzazioni caratteristiche e analizzando le loro caratteristiche spettrali e l'intensità acustica. Questa nuova metodologia ha il potenziale per standardizzare la quantificazione dei riflessi respiratori murini, migliorare la riproducibilità sperimentale e approfondire la comprensione meccanicistica della neurofisiologia della tosse e degli starnuti.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Protocollo per l'uso e la cura degli animali del Guangzhou Lab (GZLAB-AUCP- 2024-04-A10). In questo studio sono stati utilizzati topi femmina e maschi C57BL/6 privi di patogeni specifici, di età compresa tra 8 e 10 settimane.

1. Preparazione sperimentale

1. Preparazione di animali da esperimento
   1. I topi domestici in gabbie con libero accesso a cibo e acqua e li mantengono a 22 ± 1 °C con un ciclo standard di luce/buio di 12 ore.
2. Preparazione della soluzione di capsaicina
   1. Sciogliere 30,5 mg di polvere di capsaicina in PBS contenente il 10% di etanolo e il 10% di Tween-80 per preparare una soluzione madre da 10 mM.
   2. Diluire la soluzione madre 1:100 in soluzione fisiologica per preparare la soluzione di lavoro da 100 μM.
3. Preparazione del tribromoetanolo (Avertin)
   1. Pesare 0,5 g di tribromoetanolo in una provetta Eppendorf da 1,5 mL. Aggiungere 1 mL di 2-metil-2-butanolo.
   2. Incubare a 55 °C con agitazione (400-600 giri/min) al buio fino a completa dissoluzione (~20 min).
   3. Mettere 40 mL di soluzione fisiologica in un becher. Mescolando, aggiungere goccia a goccia la soluzione di tribromoetanolo disciolta. Continuare a mescolare fino a quando i cristalli disciolti non si dissipano completamente (~40 min).
   4. Regolare il pH a 7,0-7,3 utilizzando NaOH.

2. Definizione e registrazione del modello di comportamento simile alla tosse

1. Preparazione della cannula per impianto
   1. Tagliare un ago da 28 G (ID: 0,19 mm, OD: 0,35 mm) in una cannula da ~5 mm. Lisciare entrambe le estremità con carta abrasiva usando una pinza. Fissare un'estremità al tubo in silicone (ID: 0,3 mm, OD: 0,8 mm). Collegare a una siringa da 1 ml e sciacquare la cannula con acqua per verificare la pervietà.
   2. Piegare la cannula a 90° con rapporto del braccio 2:3. Inserire il braccio più lungo nel tubo di silicone (ID: 0,3 mm, OD: 0,8 mm, lunghezza 5 cm; Figura 1A). Designare l'estremità piegata per l'impianto tracheale. Estendere il tubo di silicone dalla trachea al cranio per il fissaggio (Figura 1B).
2. Preparazione per l'installazione dell'apparecchiatura di registrazione
   1. Preparare il sistema di pletismografia di tutto il corpo (WBP), registratore a ultrasuoni, telecamera ad alta velocità, pompa per microiniezione.
3. Assegnazione del gruppo di topi
   1. Assegna casualmente i topi a tre gruppi (n = 6/gruppo): i) Gruppo di controllo: mantiene lo stato normale non trattato. ii) Gruppo fittizio: impiantare la cannula tracheale senza stimolazione. iii) Gruppo di stimolazione: impiantare la cannula tracheale e somministrare capsaicina per indurre la tosse.
4. Procedura chirurgica
   1. Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo (125-250 mg/kg) e confermare l'anestesia completa in assenza di risposta a un pizzico di dita.
   2. Fissare il topo anestetizzato supino. Radere i peli cranici e cervicali. Disinfettare con iodoforo. Usando le forbici chirurgiche, taglia una sezione circolare del cuoio capelluto di circa 5 mm di diametro per esporre il cranio.
   3. Al microscopio: incidere la pelle cervicale per circa 1 cm. Sezionare senza mezzi termini i tessuti e i muscoli per esporre la trachea. Pungere i tessuti molli tra la cartilagine cricoidea e tracheale utilizzando un ago da 32 G. Crea un'apertura tracheale minima con le forbici oftalmiche.
      NOTA: Mantenere la dimensione dell'apertura abbastanza grande per il diametro della cannula per evitare danni ai tessuti.
   4. Inserire la cannula metallica (con guaina in silicone) ~1 mm nel lume tracheale. Giunzione cannula-trachea sicura con sutura 7-0.
      NOTA: Limitare la profondità di inserimento a 1 mm per evitare compromissioni respiratorie.
   5. Scavalare senza mezzi termini per via sottocutanea dal collo al cranio. Instradare il tubo di silicone verso il cranio e fissarlo con cemento dentale.
   6. Sutura dell'incisione cervicale. Posiziona il mouse su un termoforo finché non è cosciente. Casa in gabbia per 5 giorni.
   7. Sciacquare quotidianamente la cannula/tubo tracheale con una siringa ad aria da 1 ml.
      NOTA: Omettere il lavaggio entro 24 ore prima dell'induzione della tosse.
5. Registrazione della tosse
   1. Montare la sonda a ultrasuoni con un anello di tenuta compatibile con le porte. Inserire la sonda nella porta della camera WBP per garantire un contatto ermetico.
   2. Collegare la camera WBP, il sensore di flusso e il flusso di polarizzazione. Calibrazione tramite software.
   3. Collegare un tubo di silicone fissato al teschio a un tubo di prolunga da 30 cm. Posizionare il mouse nella camera WBP. Estendere il tubo attraverso la porta superiore. Sigillare il porto con argilla da modellare. Verificare l'ermeticità della camera confermando che i picchi della forma d'onda respiratoria siano compresi tra 4 ± 2.
   4. Caricare 1 mL di siringa con 5 mL di soluzione di capsaicina. Elimina le bolle d'aria. Collegare al tubo di prolunga. Montare la siringa sulla pompa di microiniezione e impostare il flusso a 10 μl ^min-1.
      NOTA: Un flusso eccessivo può trasportare la capsaicina nella cavità nasale.
   5. Posizionare una telecamera ad alta velocità di fronte alla camera. Regola la distanza e la messa a fuoco. Impostare la frequenza di campionamento su 160 fps (massimo).
   6. Avviare contemporaneamente il WBP, l'ecografia e il software della fotocamera; Attivare la pompa per infondere la capsaicina. Registra il conteggio della tosse per 10 minuti.

3. Definizione e registrazione del modello di comportamento simile allo starnuto

1. Preparazione dell'attrezzatura sperimentale
   1. Preparare un tubo sterile in PE (ID: 0,5 mm, OD: 1 mm) per il fissaggio come cannula di stimolazione sull'osso nasale murino.
   2. Preparare un filamento di nylon sterilizzato di 0,25 mm di diametro per la stimolazione nasale trans-cannula. Attingendo al metodo di calibrazione di Vonfrey, quando il filamento lungo 5 cm viene premuto verticalmente su una bilancia fino a piegarsi a circa 45°, la forza misurata è di 0,6 g.
2. Configurazione dell'apparecchiatura di controllo
   1. Pronto un sistema di pletismografia per tutto il corpo (WBP), un registratore a ultrasuoni e una telecamera ad alta velocità.
3. Assegnazione del gruppo di topi
   1. Assegnare casualmente i topi a tre gruppi (n = 6/gruppo): i) Gruppo di controllo: mantenere lo stato basale non trattato. ii) Gruppo fittizio: fissare la cannula nasale senza stimolazione. iii) Gruppo di stimolazione: fissare la cannula nasale + evocare lo starnuto tramite la stimolazione del filamento.
4. Procedura chirurgica
   1. Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo (125-250 mg/kg) e confermare l'anestesia completa in assenza di risposta a un pizzico di dita.
   2. Radere i peli sul cranio e sul ponte nasale.
   3. Fissare il mouse in una cornice stereotassica. Disinfettare con iodoforo. Incidere la pelle sopra il cranio e l'osso nasale. Esporre l'osso nasale.
   4. Creare un foro di 0,5 mm nella giunzione tra l'osso nasale e il processo laterale della cartilagine del setto nasale utilizzando un microtrapano. Esporre la mucosa nasale.
      NOTA: Limitare la dimensione del foro a 0,5 mm per evitare danni ai tessuti.
   5. Sollevare delicatamente la mucosa nasale con un ago da 32 G. Esporre la cavità nasale.
   6. Montare il tubo PE nel braccio stereotassico. Posizionare la punta del tubo a filo con il foro della fresa. Fissare il tubo all'osso nasale con cemento dentale.
   7. Posiziona il mouse su un termoforo fino a quando non riprende conoscenza.
5. Registrazione degli starnuti
   1. Collegare la camera WBP, il sensore di flusso e il flusso di polarizzazione secondo il manuale. Calibrare utilizzando il software.
   2. Montare la sonda a ultrasuoni con una guarnizione adattata alla porta. Inserire la sonda nella camera. Verificare la chiusura ermetica.
   3. Trasferire il mouse nella camera WBP. Estendere il tubo in PE attraverso la porta superiore. Sigillare la porta con argilla da modellare attorno al tubo. Verificare l'ermeticità della camera confermando che i picchi della forma d'onda respiratoria siano compresi tra 4 ± 2.
   4. Posizionare una telecamera ad alta velocità di fronte alla camera. Regola la distanza e la messa a fuoco. Impostare la frequenza di campionamento su 160 fps (massimo).
   5. Far avanzare un filamento di nylon di 0,25 mm di diametro attraverso un tubo morbido nella cavità nasale fino a una profondità di 0-3 mm. La parte del filamento che sporge dal tubo portatile è lunga 5 cm. Durante la stimolazione, premere questa estremità libera fino a quando non si piega a 45°, erogando ~0,6 g di forza alla mucosa nasale per 1 s, ripetere una volta ogni 30 s. Registra le risposte agli starnuti per 10 minuti.

4. Tosse e starnuti indotti dalla capsaicina nei topi

1. Assegnazione di gruppo
   1. Dividi i topi in chirurgia fittizia e gruppi di chirurgia (n = 5/gruppo). Gruppo fittizio: esporre i nervi etmoidali anteriori bilaterali e infraorbitali. Gruppo chirurgico: Nervature etmoidali anteriori e infraorbitali transette bilaterali.
2. Nebulizzazione ad ultrasuoni
   1. Preparare la camera comportamentale (20 cm × 14 cm × 17 cm).
   2. Posizionare il registratore a ultrasuoni e la telecamera per un monitoraggio ottimale.
   3. Caricare il nebulizzatore con 100 μM di soluzione di capsaicina. Eroga 30 impulsi di aerosol ogni 2 minuti per 10 minuti.
   4. Registra i comportamenti in modo continuo utilizzando il registratore a ultrasuoni e la telecamera.

5. Processo di analisi dei dati

1. Analisi del tracciato respiratorio per pletismografia di tutto il corpo (WBP)
   1. Importa i file di testo registrati WBP nel software Spike2 e sincronizzali con i segnali audio.
   2. Analizza i segnali audio corrispondenti ai modelli di respirazione a picco singolo e doppio e registra la durata della fase di compressione per ciascun modello.
   3. Selezionare il punto più basso della fase espiratoria come punto medio e prendere i dati da mezzo secondo prima e dopo per calcolare il valore medio.
2. Analisi della forma d'onda audio
   1. Importa i file audio nel software Spike2, seleziona l'audio di tosse o starnuti ed esportali in formato TXT (con una frequenza di campionamento impostata su 100 kHz e una durata di 0,1 s).
   2. Importa i file TXT in Excel e convertili nei valori assoluti dei segnali audio.
   3. Usa il software GraphPad Prism per smussare i valori assoluti delle forme d'onda audio utilizzando una spline di smussatura con 50 punti.
      NOTA: Per garantire che la curva si avvicini strettamente ai dati originali evitando punti di flesso eccessivi, è ottimale selezionare una spline di smussatura di 50 punti; Le curve generate con valori superiori a 50 punti mostrano una deviazione trascurabile dalla curva a 50 parametri.
   4. In base alle forme d'onda audio levigate, calcolare la pendenza k dal punto iniziale al punto più alto.
3. Analisi spettrale audio
   1. Importa i file audio nel software Spike2.
   2. Seleziona i punti temporali di inizio e fine dei singoli suoni di tosse o starnuto per l'analisi spettrale ed esporta i risultati dell'analisi spettrale.
   3. Usa GraphPad Prism per generare curve di analisi spettrale e calcolare l'area sotto le curve.
   4. Calcola il rapporto dell'area sotto la curva tra le bande di frequenza 30-60 kHz e 0-30 kHz per distinguere tra tosse e starnuti.
4. Calcolo dell'indice composito
   1. Eseguire una trasformazione logaritmica naturale (ln) sul pendio k e sul rapporto dell'area sotto la curva di analisi spettrale per migliorare la discriminabilità dei dati.

6. Analisi statistica

1. I dati sono presentati come media ± SEM. I confronti statistici tra due gruppi sono stati eseguiti utilizzando il t-test e l'ANOVA a due vie, con un P < 0,05 considerato statisticamente significativo. Tutte le analisi sono state condotte con il software GraphPad Prism.

Risultati

In questo studio, abbiamo condotto un'analisi dettagliata dei modelli respiratori dei comportamenti di tosse e starnuto dei topi utilizzando la pletismografia di tutto il corpo (WBP) e le tecniche di registrazione ad ultrasuoni. I risultati hanno mostrato che i topi sottoposti a chirurgia tracheale o nasale dimostrano una reattività alla tosse e agli starnuti paragonabile a quella dei controlli naïve. Tuttavia, la capsaicina (chimica) e la stimolazione meccanica evocano efficacemente i riflessi della tosse e dello starnuto in questi animali preparati chirurgicamente (Figura 2A, B). I risultati della WBP hanno rivelato che entrambi i comportamenti mostravano pattern a picco singolo e doppio, con i loro segnali sonori che apparivano durante la fase espulsiva del pattern respiratorio (Figura 3A, C, E, G). Ulteriori analisi ecografiche hanno rivelato profili acustici distinti: i suoni della tosse hanno mostrato un esordio improvviso con picchi di intensità che si sono verificati istantaneamente, prevalentemente nell'intervallo di frequenza 0-30 kHz, e una durata più breve (Figura 3B, D; Video di supporto S1). I suoni degli starnuti hanno dimostrato un progressivo accumulo di intensità fino alla massima ampiezza, distribuzione della frequenza a banda larga (0-80 kHz) e durata prolungata (Figura 3F,H; Video di supporto S2). L'analisi statistica ha rivelato che la fase di compressione media del comportamento di tosse a picco singolo era di 32,39 ± 0,73 ms, significativamente più breve di quella del comportamento di tosse a doppio picco a 53,17 ± 2,29 ms (Figura 4A, B, C). La fase di compressione media del comportamento di starnuto a picco singolo è stata di 44,03 ± 1,84 ms, inferiore al valore medio del comportamento di tosse a doppio picco, mentre la fase di compressione media del comportamento di starnuto a doppio picco è stata di 74,24 ± 1,29 ms, significativamente più lunga di quella dello starnuto a picco singolo (Figura 4E, F, G). Inoltre, il rapporto di occorrenza del pattern a picco singolo nel comportamento della tosse era del 77,55 ± del 2,10% (Figura 4D), mentre nel comportamento degli starnuti, il pattern a picco singolo rappresentava solo il 32,42 ± il 5,88%, con il pattern a doppio picco che rappresentava il 67,58 ± il 5,88% (Figura 4H). L'analisi statistica della durata dell'audio ha indicato differenze significative tra i tempi audio di tosse e starnuti, ma c'era una notevole sovrapposizione tra i due (Figura 5A). Attraverso l'analisi spettrale dell'audio ecografico di tosse e starnuti, abbiamo scoperto che lo spettro di frequenza dell'audio della tosse era principalmente concentrato nell'intervallo 0-30 kHz, mentre l'audio degli starnuti aveva una proporzione maggiore nell'intervallo 0-60 kHz (Figura 5B). Sebbene l'audio della tosse avesse anche frequenze nell'intervallo 30-120 kHz, la proporzione delle basse frequenze era sempre superiore a quella delle alte frequenze. Pertanto, abbiamo utilizzato la pendenza dell'intensità del suono dal punto di partenza al valore massimo (Figura 5C) come coordinata verticale e il rapporto di energia da 30-60 kHz a 0-30 kHz (Figura 5D) come coordinata orizzontale per stabilire un sistema di coordinate, in grado di distinguere efficacemente l'audio di tosse e starnuti. Inoltre, non c'erano differenze significative tra la tosse a picco singolo e doppio e gli starnuti a picco singolo e doppio in questo sistema di coordinate (Figura 5E).

Successivamente, abbiamo impiegato i suddetti metodi di classificazione per classificare i comportamenti di tosse e starnuti indotti dalla nebulizzazione della capsaicina nei topi. Abbiamo scoperto che i comportamenti di tosse e starnuti indotti dalla nebulizzazione della capsaicina si sovrappongono a quelli evocati dalla stimolazione specifica sulle stesse posizioni coordinate (Figura 5F, G). A seguito della transezione dei nervi afferenti sensoriali nasali (nervi etmoidali anteriori e infraorbitali), la nebulizzazione della capsaicina ha ridotto significativamente i segnali acustici associati allo starnuto, mentre i profili audio correlati alla tosse sono rimasti inalterati (Figura 5H, I).

Figura 1: Diagramma schematico dell'operazione nel modello di trachea stimolata e cavità nasale. (A) Rappresentazione schematica del catetere impiantato nella trachea. (B) I piani frontale (sinistro) e coronale (destro) mostrano la posizione del catetere impiantato nella trachea del topo. (C) Il piano sagittale mostra la posizione dell'impianto del catetere nella cavità nasale e la posizione della stimolazione delle fibre filamentose. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Quantificazione dei comportamenti simili alla tosse e agli starnuti suscitati dalla stimolazione sito-specifica. (A) Quantificazione dello starnuto del gruppo di controllo normale, del gruppo fittizio e del gruppo di stimolazione nasale meccanica. Il gruppo fittizio ha mostrato una frequenza di starnuti paragonabile a quella dei controlli. La stimolazione nasale meccanica ha evocato un aumento significativo degli eventi di starnuto. (B) Quantificazione della tosse del gruppo di controllo normale, del gruppo fittizio e del gruppo di provocazione tracheale della capsaicina. Il gruppo fittizio non ha mostrato differenze significative nella frequenza della tosse rispetto ai controlli. La stimolazione tracheale della capsaicina ha aumentato significativamente la conta della tosse. I dati sono rappresentati come media ± SEM, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Le tracce respiratorie e l'oscillogramma sonoro di tosse e starnuti. (A) Immagini rappresentative che mostrano il singolo picco respiratorio e la registrazione audio durante una tosse indotta dalla capsaicina. (B) L'oscillogramma sonoro (in alto) e lo spettrogramma (in basso) della registrazione audio della tosse in A. (C) Immagini rappresentative che mostrano i doppi picchi, la traccia respiratoria e la registrazione audio durante una tosse indotta dalla capsaicina. (D) L'oscillogramma sonoro (in alto) e lo spettrogramma (in basso) della registrazione audio della tosse in C. (E) Immagini rappresentative che mostrino il singolo picco respiratorio e la registrazione audio durante uno starnuto indotto da stimolazione meccanica. (F) L'oscillogramma sonoro (in alto) e lo spettrogramma (in basso) della registrazione audio dello starnuto in E. (G) Immagini rappresentative che mostrano il tracciato respiratorio dei doppi picchi e la registrazione audio durante uno starnuto indotto da stimolazione meccanica. (H) L'oscillogramma sonoro (in alto) e lo spettrogramma (in basso) della registrazione audio dello starnuto in G. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: I picchi singoli e doppi delle tracce respiratorie di comportamenti simili alla tosse e allo starnuto. (A) Tracce respiratorie medie (rosso) e individuali (grigio) e medie (rosso) di comportamenti simili alla tosse con un singolo picco respiratorio (n = 52). (B) Tracce respiratorie medie (rosso) e individuali (grigio) e medie (rosso) di comportamenti simili alla tosse con doppi picchi respiratori (n = 29). (C) Durata delle fasi compressive dei picchi respiratori singoli e doppi per la tosse indotta dalla capsaicina (picco singolo n = 52, picco doppio n = 29). (D) Il rapporto medio tra tracce di picco respiratorio singolo e doppio nella tosse (n = 6 topi). (E) Tracce respiratorie medie (rosso) e individuali (grigio) e medie (rosso) di comportamenti simili a starnuti con singoli picchi respiratori (n = 40). (F) Tracce respiratorie medie (rosso) e individuali (grigio) e medie (rosso) di comportamenti simili a starnuti con doppi picchi respiratori (n = 74). (G) Durata delle fasi di compressione dei picchi respiratori singoli e doppi per gli starnuti indotti da stimolazione meccanica (picco singolo n = 40, picco doppio n = 74). (H) Il rapporto medio tra le tracce di picco respiratorio singolo e doppio negli starnuti (n = 6 topi). I dati sono rappresentati come la media ± SEM, ****P < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: La classificazione della frequenza e della forma d'onda dell'oscillogramma sonoro della tosse e degli starnuti. (A) Quantificazione della durata dell'ecografia di tosse e starnuti. (B) L'analisi dello spettrogramma medio degli starnuti indotti da stimolazione meccanica (n = 69, nero) e della tosse indotta da capsaicina (n = 140, rosso). (C) Un diagramma schematico rappresentativo per il calcolo della pendenza di un oscillogramma sonoro. L'analisi comparativa della smussatura della spline rivela che a 25 punti, un'eccessiva smussatura oscura le caratteristiche originali dei dati, mentre i valori superiori a 50 punti (ad esempio, 75 punti) mostrano una sostanziale sovrapposizione con la curva a 50 spline ma introducono ulteriori punti di flesso. (D) Un diagramma schematico rappresentativo del calcolo del rapporto di area, utilizzando i risultati dell'analisi spettrale per calcolare l'area sotto diverse curve di frequenza in GraphPad Prism. Il rapporto dell'area è uguale all'area sotto la curva 30-60 kHz e all'area sotto la curva 0-30 kHz. (E) La classificazione della frequenza e della forma d'onda degli starnuti indotti dalla stimolazione meccanica e dell'oscillogramma sonoro della tosse indotta dalla capsaicina, con l'asse y che rappresenta l'esponente della pendenza della forma d'onda sonora dalla linea di base al picco e l'asse x che rappresenta l'esponente del rapporto delle onde sonore tra 30-60 kHz e 0-30 kHz. (F) L'analisi media dello spettrogramma degli starnuti indotti dalla nebulizzazione della capsaicina (n = 36, nero) e della tosse indotta dalla nebulizzazione della capsaicina (n = 42, rosso). (G) La classificazione della frequenza e della forma d'onda degli starnuti indotti dalla nebulizzazione della capsaicina (n = 36, nero) e della tosse indotta dalla nebulizzazione della capsaicina (n = 42, rosso) oscillogramma sonoro, con l'asse y che rappresenta l'esponente della pendenza della forma d'onda sonora dalla linea di base al picco e l'asse x che rappresenta l'esponente del rapporto delle onde sonore tra 30-60 kHz e 0-30 kHz. (H) Dati statistici sul riflesso dello starnuto indotto dalla capsaicina in gruppi con nervi etmoidali anteriori e infraorbitali sezionati rispetto al gruppo di chirurgia fittizia. (I) Dati statistici sul riflesso della tosse indotto da capsaicina in gruppi con nervi etmoidali anteriori e infraorbitali sezionati rispetto al gruppo di chirurgia fittizia. I dati sono rappresentati come media ± SEM, **P < 0,01, ****P < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video supplementare 1: Video del comportamento simile alla tosse sincronizzato con il suo spettrogramma audio, visualizzato a velocità normale e 0,1x. Clicca qui per scaricare questo file.

Video supplementare 2: Video del comportamento simile a uno starnuto sincronizzato con il suo spettrogramma audio, visualizzato a velocità normale e 0,1x. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

In questo studio, abbiamo indotto con successo comportamenti di tosse e starnuti nei topi stimolando specificamente la trachea con capsaicina e stimolando meccanicamente la cavità nasale ^8,17. Abbiamo raccolto in modo sincrono dati dalla pletismografia di tutto il corpo (WBP), registrazioni audio e video e abbiamo scoperto che i rapporti di frequenza audio e le pendenze dell'intensità sonora potrebbero distinguere efficacemente tra comportamenti di tosse e starnuti nei topi ^8,23.

Data la delicatezza delle procedure chirurgiche previste, è necessario prestare particolare attenzione ad alcune fasi critiche. Innanzitutto, durante la chirurgia tracheale, la cannula intratracheale impiantata deve essere il più sottile possibile e inserita a una profondità ridotta per evitare l'ostruzione delle vie aeree, che potrebbe portare a distress respiratorio o addirittura alla mortalità. Inoltre, poiché le secrezioni all'interno della trachea possono facilmente bloccare il catetere, la rimozione quotidiana del catetere è fondamentale. Quando si somministra la capsaicina, la velocità di iniezione deve essere attentamente controllata per evitare il flusso retrogrado nella cavità nasale, che potrebbe innescare riflessi di starnuto. In secondo luogo, durante l'intervento chirurgico di impianto osseo nasale, la dimensione del foro praticato è fondamentale per evitare danni eccessivi al topo. Il catetere deve essere posizionato a livello dell'osso nasale senza essere inserito troppo in profondità, per evitare un'eccessiva irritazione della cavità nasale o interferenze con la normale respirazione. In definitiva, l'attuazione di procedure chirurgiche precise è essenziale per l'esperimento. Riducendo al minimo le lesioni al topo, non solo è possibile accelerare il recupero, ma è anche possibile registrare risposte comportamentali sperimentali più accurate. Tali metodi chirurgici aiutano a migliorare l'affidabilità del modello e a garantire dati di alta qualità, fornendo così una solida base sperimentale per lo studio dei comportamenti riflessi respiratori come tosse e starnuti.

Tradizionalmente, la modellazione del comportamento della tosse si è basata sulla nebulizzazione di composti come la capsaicina e l'acido citrico per indurre la tosse^24,25. Tuttavia, questo approccio presenta notevoli limitazioni: non solo suscita la tosse, ma può anche innescare contemporaneamente riflessi di starnuto ^8,22. Inoltre, è stata osservata una significativa variabilità interindividuale nella sensibilità agli stimoli aerosolizzati²⁶ e un sottogruppo di topi non ha mostrato alcuna risposta alla tosse. Al contrario, il nuovo paradigma di stimolazione meccanica sviluppato in questo studio raggiunge comportamenti stabili simili alla tosse, consentendo al contempo una personalizzazione flessibile degli stimoli attraverso attuatori intercambiabili. Allo stesso modo, i modelli convenzionali di starnuto che impiegano agenti aerosolizzati soffrono di scarsa specificità comportamentale, poiché spesso evocano tosse collaterale²², complicando così la differenziazione tra questi distinti riflessi respiratori.

Studi precedenti hanno stabilito modelli di tosse e starnuti nel topo utilizzando la capsaicina e differenziato i due in base alle caratteristiche dei modelli respiratori (picchi singoli o doppi) registrati dalla pletismografia di tutto il corpo (WBP)⁸. I dati della nostra ricerca indicano che nel comportamento di tosse indotta, il modello di respirazione a picco singolo rappresentava il 77,55 ± il 2,10% degli eventi, mentre nel comportamento di starnuti, il modello a picco singolo rappresentava il 32,42 ± il 5,88%. Questi risultati confermano che il metodo di classificazione basato sui pattern respiratori WBP è efficace nella maggior parte dei casi, ma presenta limiti e non consente una perfetta differenziazione tra i due comportamenti. Inoltre, alcuni studi hanno tentato di distinguere la tosse dallo starnuto utilizzando le caratteristiche di durata e frequenza dei segnali audio²². Sebbene la durata media dei segnali audio per il comportamento di starnuto sia in genere più lunga di quella per la tosse, esiste una sostanziale sovrapposizione tra le durate dei singoli eventi. Pertanto, fare affidamento sulla durata dell'audio come indicatore distintivo potrebbe non essere sufficientemente discriminante. Inoltre, l'analisi spettrale di tosse e starnuti non ha rivelato un confine chiaro: la tosse lieve può manifestarsi solo come segnali a bassa frequenza, mentre la tosse vigorosa può produrre suoni che includono componenti significative ad alta frequenza, con caratteristiche spettrali simili a quelle degli starnuti. In particolare, gli eventi di tosse mostrano costantemente una percentuale più elevata di energia a bassa frequenza. Al contrario, il rapporto tra l'energia ad alta frequenza e quella a bassa frequenza (High-to-Low Frequency Energy Ratio) può fornire una caratteristica acustica più discriminante per distinguere tra comportamenti di tosse e starnuti.

La nostra innovazione affronta queste limitazioni attraverso la stimolazione meccanica spazialmente vincolata. Il modello comportamentale perfezionato dimostra un duplice vantaggio: (1) precisione millimetrica nelle sonde stabilizzate per l'applicazione di stimoli e (2) maggiore specificità comportamentale. Inoltre, la nostra analisi approfondita dell'acustica di tosse e starnuti rivela che questi comportamenti mostrano profili di intensità sonora distinti, con differenze statisticamente significative nei loro rapporti di energia ad alta e bassa frequenza. Inoltre, la nostra analisi acustica completa degli eventi di tosse e starnuti rivela profili di intensità sonora distintivi tra questi comportamenti, accompagnati da differenze statisticamente significative nei loro rapporti energetici ad alta e bassa frequenza. Inoltre, questo metodo di classificazione è fattibile anche nelle registrazioni acustiche dei comportamenti di tosse e starnuti indotti dalla nebulizzazione della capsaicina. Collettivamente, questi parametri acustici hanno permesso lo sviluppo di uno spazio di caratteristiche multidimensionale che stabilisce uno standard oggettivo e quantificabile per differenziare tosse e starnuti. Il risultato stabilisce un buon standard per lo studio dei meccanismi di difesa delle vie aeree con riduzione dei fattori confondenti e migliore riproducibilità. Questo non solo risolve sfide di lunga data nella ricerca sui riflessi respiratori, ma apre anche la strada a studi precisi di neuromodulazione dei circuiti neurali di tosse e starnuti.

Sebbene questo metodo induca efficacemente comportamenti di tosse e starnuti nei topi, ha ancora alcune limitazioni. Rispetto all'induzione della nebulizzazione, la chirurgia può causare un certo grado di lesioni ai topi, anche se ci sforziamo di ridurre al minimo i danni durante la procedura. Tuttavia, l'intervento chirurgico può ancora suscitare stabilmente comportamenti di tosse e starnuti, indicando che l'intervento chirurgico stesso non diminuisce la sensibilità dei topi a questi stimoli. Sono emerse anche sfide tecniche nella fenotipizzazione comportamentale. La fedeltà del segnale acustico richiedeva una calibrazione precisa del posizionamento del microfono dal soggetto per bilanciare i rapporti segnale/rumore evitando la saturazione dell'ampiezza. Inoltre, l'integrazione dei cateteri per l'erogazione dello stimolo con le camere per pletismografia di tutto il corpo (WBP) ha richiesto un design specializzato: il catetere deve estendersi dalla parte superiore della camera senza ostacolare i movimenti naturali del topo o l'erogazione dello stimolo. In sintesi, nonostante i limiti del metodo chirurgico, fornisce un mezzo efficace per indurre stabilmente comportamenti di tosse e starnuti nei topi e, con un processo sperimentale attentamente progettato, le lesioni al topo possono essere ridotte al minimo per garantire un'accurata raccolta di dati comportamentali.

In conclusione, attraverso queste delicate manipolazioni chirurgiche e un rigoroso disegno sperimentale, abbiamo stabilito un modello che induce stabilmente comportamenti di tosse e starnuti nei topi, fornendo una base sperimentale affidabile per ulteriori studi di questi due comportamenti riflessi respiratori.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filamento di nylon da 0,25 mm			https://item.taobao.com/item.htm?app =weixin& bc_fl_src=share-1041234389 826863-2-1&; bxsign=scdVy4Xlh07ZND yojKnPqZ8vQnR_0pjarQFoQH9h636l au-W1sONf-RPbGobT6VinB8J0CrFC xRXoB-tghl13JMFQh3DrBLpqflgMRg DY2repq1fcQGIoPm4AuDfQSUQXE p& cpp=1&; h5_spm=a-tb-item.b-tb-ite m& id=595514372480& share_crt_ v=1& shareurl=true& short_name=h .hIi5xvPc8rHTjez& sp_tk=eDdVczR SSG1vODU%3D& SPM=a2159r.13 376460.0.0&; tbSocialPopKey=shar eItem& tk=x7Us4RHmo85& UN=B3 859eAb62EF44248BD7bab98FFEB2 63& un_site=0&; ut_sk=1.ZZv9EYy wWWkDAI%2FaThaoYLYt_2164 6297_1755074424775.TaoPassw ord-WeiXin.1& wxsign=tbwr_qqSc esj7OBC_MTN-urBRm3r6GFm9t SERXxmOXNfgDGI3usP8mgVRu QmtuQ3LRrt9OkMGFP3XV55Hpp DzZZUQ4jUaki80cL79BKkrc85YE 5VYZfdiqppGkhao6kzkKF& x-ssr=true
Ago da 28G			https://item.taobao.com/item.htm? app=weixin& bc_fl_src=share-1041 234389566731-2-1& bxsign=scdfvM o7l21o6H5xXAgtKjf4TGT54QtHpk ED6yQRvvPvkGUKWiNyteUooM8e 6wcMmSKQpRsUCHjVo1q6Cliyp61 S3Nr1VadjTYKEJ1_SxSFZln_zI-0U omdKkkegvM6O5Rr& cpp=1&; h5_sp m=a-tb-item.b-tb-item& id=670272 286239& share_crt _v=1& shareurl=true& short_name= h.hIiUFWFOj35n1LJ& sp_tk=eHFJ QTRSSE9xZDc%3D& SPM=A2159 r.13376460.0.0&; tbSocialPopKey= shareItem& tk=xqIA4RHOqd7& UN =B3859eAb62EF44248BD7bab98FF EB263& un_site=0&; ut_sk=1.ZZv9 EYywWWkDAI%2FaThaoYLYt_2 1646297_1755074424775.TaoPa ssword-WeiXin.1& wxsign=tbwwJc wF20yLPkLax6kR7BPCJ3uPXx_ KPLTBjHUIph1nmN96mu0vYRC 0-DQxpG6mWPKWPZwSElseb HTR6nMzL7zthSG_67CIodTi_3i bFk7SKNFmbLeg1MVSDl9YzKs axPI& x-ssr=true
2-metil-2-butanolo	Sigma-Aldrich	240486-100ML
Avisoft RECORDER USGH	Avisoft		Per la registrazione ultrasonica
Iniettore stereotattico cerebrale	RWD	68801
Capsaicina	MCE	HY-10448
Bilanciamento elettronico	Shanghai ZhuoJing	BSM-220.4
GraphPad Prism	GraphPadSoftware		Utilizzato per grafici e analisi dei dati
Sistema di telecamere ad alta velocità	Filr	20102748
Iodoforo	LIRCON		https://www.lircon.cn/products_details/218.html
Pompa per microiniezione	XIMAINANOTECH	XMSP-C
Argilla da modellare			https://detail.tmall.com/item.htm? app=weixin& bc_fl_src=share-10 41234985980666-2-1& bxsign=s cdTRuE_YDJUf3ImFGBBqpft8S OgQqVocuYNmXEUcLyxiJX85R eVH8uZxdnVBKeXGONiCQ_Fc UDXoNcDga8mP3sClXi1CKRn R6SHFSitGVUGOFOA7eGoZT 38cLXHb8wUW-S& cpp=1&; h5_ spm=a-tb-item.b-tb-item& id=61 1429671875& condividi _crt_v=1& shareurl=true& short _name=h.hs0LTq88ockDBN6& sp_tk=cldZNjRSREhKUDU%3 D& SPM=A2159R.13376460.0.0 & tbSocialPopKey=shareItem& tk=rWY64RDHJP5& UN=B385 9eAb62EF44248BD7bab98FFEB 263& un_site=0&; ut_sk=1.ZZv9 EYywWWkDAI%2FaThaoYLYt _21646297_1755091386528.T aoPassword-WeiXin.1& wxsign =tbwPFmvLRyYmleaKSyVP7W t1XJnfAXUas_u1d5JJPUA91z9 4BTPKze3BbE2bNJHvC4-agGF ARD4JFW0c8hjdn7Z1Mfk1qgIZ VJ2SaGNFy8b809h3okigHQkp8 LhDopd5-VF& x-SSR=vero
Nebulizzatore	YUWELL	M105	Per l'atomizzazione della capsaicina
Tubi PE	RWD	62323
Tubo in silicone			https://item.taobao.com/item.htm? id=618505617112& pisk=gFrice1c WPu1u5K6Stm15sEF8l7d5cijiSK xMmhV8XlBXSntDD-EBYH2ux8Z Ty27ifBf5cUniWPn_S2fCxl4gScY WwI8CRij0_Uc2ge6-dJRw5xZ3p Wqex8NpV5Fxrz-0_CR2epE51n 4Mg0bwy8EFXkZ3m8NK2krnmk< br/> Z7jWnTxDWuCPq09XnnYxw_xu qLMksIm8q7n-ULYH-QCuZ72W nhX8Z0mPqY9DjTjoq0b1J0bq4A k5cCgtoXJh0xA0iaJbW0nvrQQhu QN-D0k4n8bR-tn-4xA2cQfKHqZ hzPf3-MWSpjm2En5hLag-nY44 7HxVGjhoT8yZsXkCkMVmK_4z q-OSaKccirl3lD1igu5Zm5PvfFJo aOzGS7w1IKlE-obgHT1yLKfuuo5 CB0fUuLW08vBK-cWa4gxVesglW 8U8O0ngpWb8XlVkIKbKQBDHRe 4RzM9XHPNgZdACRK9YXlVkIKb BhKUOj7vMOw& SPM=a21xtw.291 78619.0.0
Software Spike2	Spike2		Utilizzato per l'analisi delle tracce respiratorie e dell'audio
SpinView	Filr		Utilizzato per la registrazione video ad alta velocità
Tribromoetanolo	Sigma-Aldrich	T48402-100G
UltraSoundGate 116Hme	Avisoft	116Hme/63
Software admiad WBP	TOW-INT-TECH		Utilizzato per la registrazione WBP
Sistema di pletismografia corporea WBP	TOW-INT-TECH	2403-3204