Rilevamento rapido di Staphylococcus aureus e Staphylococcus aureus resistente alla meticillina mediante PCR fluorescente multiplex in tempo reale

Summary

Questo protocollo utilizza la PCR multiplex in tempo reale con primer/sonde che hanno come bersaglio i geni mecA mecA nuc specifici per SA e MRSA. Consente una rilevazione rapida (<1 ore) e qualitativa degli acidi nucleici SA/MRSA in campioni di espettorato umano, superando i limiti dei metodi basati sulla coltura.

Abstract

Lo Staphylococcus aureus (S.aureus) è un comune patogeno umano Gram-positivo che causa infezioni nosocomiali e acquisite in comunità, con diverse manifestazioni cliniche che vanno da lesioni superficiali locali e intossicazione alimentare a infezioni sistemiche fatali. La scoperta degli antibiotici ha ridotto significativamente il tasso di mortalità, ma da allora il problema della resistenza ai farmaci è diventato sempre più importante. Dalla prima identificazione dell'MRSA nel 1960, questo ceppo è emerso come una minaccia globale per la salute pubblica. L'MRSA è un importante patogeno delle infezioni nosocomiali, in grado di causare varie malattie gravi come endocardite, osteomielite cronica, polmonite, artrite piogenica e batteriemia. Pertanto, il rilevamento rapido e accurato di S. aureus e della sua resistenza ai farmaci è fondamentale per guidare il trattamento clinico.

Gli attuali metodi di rilevamento di routine per S.aureus e MRSA presentano limitazioni significative. Il metodo tradizionale di coltura batterica, che funge da "gold standard" per decenni, può fornire risultati definitivi di identificazione delle specie e sensibilità ai farmaci, ma il processo richiede molto tempo, dalle 48 alle 72 ore. Inoltre, questo metodo è suscettibile di contaminazione e si basa su strutture di laboratorio specializzate e tecnici qualificati. I test sierologici raggiungono una diagnosi non invasiva rilevando gli anticorpi S.aureus nel siero del paziente, ma non sono in grado di distinguere tra infezioni attive e infezioni pregresse, né possono identificare ceppi resistenti ai farmaci (come l'MRSA).

Questo studio si concentra sullo sviluppo di un nuovo metodo di rilevamento multiplex con PCR a fluorescenza in tempo reale per superare le limitazioni sopra menzionate. Questo metodo progetta primer specifici e sonde fluorescenti TaqMan che hanno come bersaglio il gene nuc specie-specifico di S.aureus e il gene mecA che media la resistenza alla meticillina, consentendo l'amplificazione e la rilevazione simultanea di S.aureus e MRSA in un unico sistema di reazione. Questa tecnologia riduce notevolmente i tempi di rilevamento, fornendo una soluzione rapida, accurata ed economica per il rilevamento di S.aureus e MRSA. Questo approccio innovativo migliora notevolmente l'efficienza diagnostica clinica e facilita l'implementazione precoce di una terapia antibiotica mirata, apportando importanti contributi al controllo delle infezioni batteriche resistenti ai farmaci.

Introduction

S. aureus è un patogeno condizionale Gram-positivo diffuso che colonizza la mucosa nasale di individui sani ^1,2. Quando l'immunità dell'ospite è compromessa, può causare infezioni cutanee locali, invasione dei tessuti profondi o malattie sistemiche (ad esempio, polmonite, endocardite, osteomielite e batteriemia)³. La meticillina, una penicillina semisintetica, è stata applicata clinicamente per le infezioni da S. aureus nel 1959 e, due anni dopo, l'MRSA è emerso nel Regno Unito, diffondendosi rapidamente in paesi europei tra cui Danimarca, Francia^{e Svizzera.} La resistenza dell'MRSA agli antibiotici β-lattamici non solo complica la gestione clinica, ma aumenta anche significativamente i rischi di infezione⁵. Molteplici fattori, tra cui la colonizzazione/diffusione incontrollabile, gli elevati costi di prevenzione e l'uso eccessivo di antibiotici, hanno collettivamente aumentato i tassi di infezione da MRSA⁶. A causa della sua rapida trasmissione e dei complessi meccanismi di resistenza, le infezioni da MRSA sono associate ad alti tassi di letalità, con quasi 150.000 casi segnalati e >7.000 decessi all'anno nei paesi dell'UE⁷. Secondo i dati di sorveglianza CHINET, i tassi di infezione da MRSA in Cina sono rimasti superiori al 30% negli ultimi cinque anni⁸. L'elevato rischio di infezioni crociate nosocomiali aggrava ulteriormente gli oneri per la salute pubblica e mette a dura prova i sistemi sanitari ^9,10. Pertanto, lo sviluppo di tecnologie di rilevamento rapido dell'MRSA efficienti e precise è clinicamente urgente per ottenere una diagnosi precoce, una terapia personalizzata, ridurre la mortalità e interrompere le catene di trasmissione.

Le attuali tecnologie di rilevamento per S.aureus e MRSA abbracciano diversi campi, tra cui il rilevamento fenotipico, il rilevamento genomico, il rilevamento trascrittomico, il rilevamento proteomico, la tecnologia di spettrometria di massa e le analisi basate sulla bioinformatica¹¹.

I metodi di rilevamento fenotipico, come il metodo della diffusione su disco (metodo KB) e il metodo della concentrazione inibitoria minima (metodo MIC), sono raccomandati come "gold standard" dal Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e dal Comitato europeo per i test di suscettibilità antimicrobica (EUCAST). Questi metodi hanno il vantaggio di non aver bisogno di strumenti specializzati, essendo ampiamente utilizzati per la sorveglianza dello spettro di resistenza e l'indagine epidemiologica. Tuttavia, i loro svantaggi sono evidenti: lunghi periodi di coltura (oltre 24 ore) e i risultati del metodo KB per alcuni nuovi antibiotici richiedono la convalida dei valori MIC, con risultati per i ceppi del punto di rottura sensibili ai fattori umani ^12,13.

Tra i metodi di rilevazione a livello genomico, la PCR convenzionale ha le caratteristiche di alta sensibilità e forte specificità, consentendo un giudizio preliminare di resistenza e accorciando i tempi sperimentali, con basso costo e alta efficienza. Ma i suoi limiti risiedono nell'essere in grado di rilevare solo i geni di resistenza noti e nell'affidarsi a strumenti specializzati¹⁴. Il meccanismo della resistenza microbica è molto complesso, il che rende fondamentale lo sviluppo di metodi tecnici in grado di coprire fenotipi di resistenza sconosciuti e consentire una rapida identificazione. L'emergente tecnologia GoPhAST-R (Combined genotypic and phenotypic AST through RNA detection) determina i fenotipi di resistenza rilevando i livelli di espressione dell'mRNA, consentendo il rilevamento simultaneo di diversi geni correlati alla resistenza in più agenti patogeni, riducendo i tempi di risposta sperimentali e raggiungendo un'accuratezza del 94-99% se combinata con l'apprendimento automatico¹⁵.

Tra i metodi di rilevazione a livello proteomico, il metodo di agglutinazione del lattice PBP2a si basa sul legame specifico antigene-anticorpo, con funzionamento semplice e risultati rapidi, con elevata specificità e sensibilità per MRSA. Tuttavia, non è in grado di distinguere tra le diverse specie di stafilococchi e la sensibilità di rilevamento dei kit commerciali è in qualche modo diminuita, richiedendo un nuovo test dopo l'induzione con oxacillina⁸.

I metodi di rilevazione basati su MALDI-TOF MS, come il metodo DOT-MGA (DNA Oligonucleotide Tag-Microarray Detection of Genomic Amplification), raggiungono prestazioni analitiche ottimali a 6-8 ore di incubazione, con un tasso di rilevamento fino al 96,4% e sia la sensibilità che la specificità sono del 100%. Ma il costo è elevato e le posizioni limitate sulla piastra di destinazione rendono difficile rilevare contemporaneamente centinaia di campioni^16,17.

Tra le tecnologie di analisi bioinformatica combinate con i dati omici per la previsione della resistenza, la tecnologia di sequenziamento dell'intero genoma si distingue per l'alta risoluzione e le capacità complete di analisi delle informazioni. In combinazione con database di analisi dei geni di resistenza come Resfinder, è in grado di analizzare se i ceppi trasportano specifici geni di resistenza, prevedere il potenziale di resistenza, rilevare polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) e mutanti genici associati alla resistenza, supportando al contempo l'archiviazione e la rianalisi dei dati dell'intero genoma¹⁸. Tuttavia, questo metodo richiede l'utilizzo da parte di professionisti con background bioinformatico, è raramente utilizzato nei test quotidiani ed è comunemente utilizzato per l'analisi epidemiologica o la sorveglianza molecolare degli agenti patogeni¹⁹.

Le metodologie di cui sopra sono costose, richiedono molto tempo o sono ancora in fase di ricerca e sviluppo. Dal punto di vista clinico, c'è un urgente bisogno di una soluzione che bilanci "immediatezza" e "accuratezza": una nuova tecnologia di PCR fluorescente multiplex colma questa lacuna amplificando simultaneamente i geni nuc/mecA in una singola provetta, comprimendo il ciclo di rilevamento a 1 ora. Colma con precisione il divario della finestra temporale nel tradizionale processo di "screening di emergenza - tipizzazione della resistenza", fornendo uno strumento diagnostico molecolare più efficiente in termini di tempo per la prevenzione e il controllo delle infezioni nosocomiali. Questo specifico test PCR viene utilizzato principalmente per il rilevamento di campioni respiratori, con campioni di espettorato come esempio tipico. Presenta una sensibilità di 500 copie/mL e un'elevata specificità, pur rimanendo inalterato dagli agenti antibatterici. Grazie a queste caratteristiche prestazionali favorevoli, questo test PCR ha un notevole valore applicativo per la diagnosi delle infezioni del tratto respiratorio e la sorveglianza delle infezioni nosocomiali causate da MRSA.

Protocol

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Provinciale del Popolo del Guangdong (Etica n.: KY2025-510-01). Informazioni dettagliate sui materiali utilizzati in questa ricerca (reagenti, sostanze chimiche, attrezzature e software) sono disponibili nella Tabella dei materiali.

1. Protocollo di raccolta e conservazione dei campioni

1. Criteri di inclusione: ad eccezione dei materiali per il controllo della qualità, identificare tutti i campioni raccolti come campioni positivi utilizzando il metodo gold standard (saggio basato sulla coltura).
2. Raccolta di espettorato umano
   1. Raccogliere 1-3 ml di espettorato con tosse profonda dal tratto respiratorio inferiore dei soggetti utilizzando provette di campionamento sterili. Sigillare immediatamente le provette e trasportarle per l'analisi. Elaborare immediatamente i campioni per il test.
3. Conservazione dei campioni:
   1. Analizzare tempestivamente i campioni raccolti tramite il metodo di cui sopra. Lo stoccaggio a breve termine è consentito alle seguenti condizioni:
      2-8 °C: ≤7 giorni
      -20 °C ± 5°C: ≤6 mesi
      -70 °C ± 5°C: ≤24 mesi
      NOTA: In questo studio, i campioni di espettorato non sono stati trattati con conservanti (come brodo BHI + glicerolo, ecc.). Dopo la raccolta, sono stati conservati nelle condizioni sopra descritte ed è stato rigorosamente evitato il congelamento e lo scongelamento ripetuti. Evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo. Cicli massimi di gelo-disgelo consentiti: ≤3.

2. Estrazione con acido nucleico

NOTA: Completare tutte le procedure all'interno di una cabina di biosicurezza per evitare la contaminazione.

1. Per il pretrattamento del campione di espettorato, mescolare il campione con una soluzione di NaOH al 4% nel rapporto di 1:4 (campione di espettorato: soluzione di NaOH al 4%) per liquefare i campioni di espettorato viscoso ed eliminare le impurità interferenti, quindi agitare accuratamente (30 s) e incubare a temperatura ambiente (22-25 °C) per 30 minuti per ottenere la liquefazione.
2. Preparazione dei reagenti per l'estrazione degli acidi nucleici
   1. Estrarre la piastra preconfezionata da 96 pozzetti dal kit. Muovere leggermente la piastra a 96 pozzetti per concentrare i reagenti e le microsfere magnetiche sul fondo della piastra a 96 pozzetti.
   2. Strappare con cura la pellicola sigillante in foglio di alluminio, evitando di far vibrare la piastra a 96 pozzetti per evitare schizzi di liquido.
   3. Nelle soluzioni della colonna 1 e della colonna 7 della piastra a 96 pozzetti: in primo luogo, aggiungere 20 μl di proteinasi K, quindi aggiungere 200-300 μl di campione da estrarre.
3. Estrazione automatizzata dell'acido nucleico (metodo basato su biglie magnetiche)
   1. Posizionare la piastra preconfezionata a 96 pozzetti con i campioni aggiunti nella fessura corrispondente dello strumento di estrazione automatica degli acidi nucleici.
   2. Seguire il processo di estrazione dell'acido nucleico come descritto di seguito.
      1. Utilizzando il bastoncino magnetico sulla camera di laboratorio, trasferire le microsfere magnetiche adsorbite con acido nucleico in diversi fori di reagente.
      2. Utilizzare il set di agitazione per mescolare il liquido rapidamente e ripetutamente, in modo che il liquido e le perle magnetiche si mescolino uniformemente.
      3. Man mano che il liquido e le perle magnetiche si combinano armoniosamente, la macchina automatizzata per l'estrazione dell'acido nucleico progredisce attraverso le fasi successive della lisi cellulare, dell'adsorbimento dell'acido nucleico (70 °C, 15 min, 3 volte di adsorbimento magnetico), del lavaggio (3 volte, mescolare per 2 minuti ogni volta, quindi eseguire l'adsorbimento magnetico due volte (15 s ciascuno) e dell'eluizione (2 volte, mescolare per 5 minuti ogni volta, 3 volte di adsorbimento magnetico), alla fine, ottiene acido nucleico di elevata purezza.
      4. Convalidare la concentrazione e la purezza degli acidi nucleici utilizzando uno spettrofotometro. Il volume del campione di acido nucleico era di 50 μL, con una concentrazione compresa tra 50 e 100 ng/μL e un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 ± 0,2.
   3. Al termine del programma, aspirare direttamente la soluzione di eluizione contenente acido nucleico dalla colonna 6 e dalla colonna 12 per i test successivi. Se necessario, conservare i campioni di acido nucleico estratti rimanenti a -20 °C per la conservazione a lungo termine e l'uso futuro.

3. qPCR Rilevamento degli acidi nucleici di S. aureus e degli acidi nucleici MRSA

1. Preparazione dei reagenti di amplificazione
   1. Estrarre la soluzione di reazione di amplificazione dell'acido nucleico e la soluzione di reazione nuc/mecA dal kit (primer/sonda specifici per il gene nuc per S. aureus e mecA per MRSA). Dopo lo scongelamento a 22-25 °C, oscillare completamente e mescolare in modo uniforme, quindi eseguire la centrifugazione istantanea (~6000 g, 15 s, 22-25 °C).
   2. In base al numero di campioni da testare, N, preparare i reagenti in base alla quantità totale di N+2 (N è il numero di campioni e 2 sono i controlli di qualità negativi e positivi). I passaggi specifici sono i seguenti:
      1. Preparare la miscela del sistema di reazione (16 μL di soluzione di reazione di amplificazione degli acidi nucleici (tampone, dNTP, DNA polimerasi, enzima UDG) + 4 μL di soluzione di reazione nuc/mecA (primer e sonde per i geni di rilevamento target nuc, mecA e il riferimento interno GAPDH).
      2. Aggiungerlo a una provetta da centrifuga di dimensioni adeguate, oscillare completamente e mescolare in modo uniforme ed eseguire la centrifugazione istantanea (~6000 g, 15 s, 22 °C-25 °C). Quindi erogare 20 μl per provetta nelle provette di reazione PCR.
2. Aggiungere l'acido nucleico e i campioni di controllo qualità:
   1. Nelle provette di reazione PCR sopra preparate (20 μl), rispettivamente, aggiungere 5 μl di acido nucleico dai campioni testati, controllo positivo e controllo negativo, ottenendo un volume finale di 25 μl per provetta.
   2. Tappare bene le provette ed eseguire la centrifugazione istantanea (~6000 × g, 15 s, 22-25 °C), quindi inserire le provette nello strumento PCR.
3. Amplificazione PCR:
   1. Impostare il programma di ciclismo come segue: Pre-denaturazione: 97 °C, 90 s, 1 ciclo; le seguenti 2 fasi per 42 cicli: denaturazione a 97 °C per 2 s e ricottura a 55 °C per 15 s.
   2. Impostare i parametri di rilevamento del segnale di fluorescenza come segue: utilizzare la marcatura fluorescente FAM dei geni nuc ; marcatura fluorescente VIC di geni mecA ; e marcatura fluorescente CY5 del gene GAPDH come controllo interno del kit. Raccogli dati a 55 °C. Al termine della reazione, assicurarsi che i dati vengano salvati per analisi future.
   3. Analisi dei dati utilizzando un software specifico per qPCR (SLAN 96P):
      1. Informazioni sul campione: Nel diagramma di layout della piastra a pozzetti del software, etichettare i tipi di campione (ad esempio, controllo positivo, controllo negativo, campione sconosciuto, gene di riferimento interno, ecc.) corrispondenti alle posizioni di caricamento del campione.
      2. Posizionamento delle provette di reazione: Aprire il coperchio del modulo di riscaldamento dello strumento, posizionare saldamente la piastra/le provette sigillate per PCR all'interno, assicurarsi che si adattino perfettamente al modulo di riscaldamento e chiudere ermeticamente il coperchio del modulo (per evitare irregolarità di temperatura)
      3. Avvio della reazione: dopo aver confermato che le impostazioni del programma nel software sono corrette, fare clic su Avvia esecuzione e registrare l'ID dell'esperimento per riferimento futuro.
      4. Interruzione della corsa e rimozione delle provette: al termine dell'esecuzione del programma, attendere che la temperatura del modulo di riscaldamento scenda al di sotto di 50 °C, quindi aprire il coperchio per rimuovere la piastra/le provette per PCR e maneggiare correttamente i campioni.
4. Analisi dei dati
   1. Prima dell'analisi dei dati, confermare tre risultati visivi: 1) Le curve di amplificazione di tutti i campioni (compreso il controllo interno) mostrano una tipica forma a S, senza curve di salita piatte o anormalmente ritardate; 2) La linea di soglia della fluorescenza attraversa la fase esponenziale delle curve, e i valori di Ct del controllo interno (es. GAPDH) sono entro ≤ 38 cicli (coefficiente di variazione < 5%); 3) I controlli negativi/positivi sono inclusi durante l'intero esperimento per monitorare la possibilità di contaminazione.
      1. Se l'esperimento non è sotto controllo, ricontrolla l'intero batch. Se un campione mostra un'amplificazione anomala (come una curva S atipica o un valore Ct all'interno dell'intervallo critico), ricontrollare quel campione specifico.
   2. Richiamare i dati sperimentali nel software, impostare la soglia e la linea di base e calcolare i valori Ct automaticamente o manualmente, poiché lo strumento seleziona automaticamente la soglia di base. Impostare il valore finale di determinazione positiva su Ct ≤ 36; l'intervallo di riferimento per il gene di riferimento interno richiede Ct ≤ 38. Verificare che le loro curve di amplificazione mostrino caratteristici profili a forma di S.

Results

Rilevamento di S. aureus e MRSA mediante qPCR
Sulla base del gene nuc specie-specifico di S. aureus e del gene mecA di resistenza ai farmaci di MRSA, abbiamo progettato primer e sonde marcati con fluorofori distinti per il rilevamento della qPCR. Tutti i risultati del controllo di qualità durante gli esperimenti qPCR sono costantemente rientrati nelle soglie raccomandate, confermando l'affidabilità dei risultati di rilevamento (F...

Discussion

La diagnosi accurata e precoce della resistenza alla meticillina è fondamentale per la prognosi delle infezioni causate da S. aureus. L'identificazione precoce di S. aureus e MRSA può ridurre l'uso improprio di antibiotici ad ampio spettro e diminuire la pressione selettiva che porta all'insorgenza e alla diffusione della resistenza batterica.

I metodi di rilevamento fenotipico tradizionali, come la diffusione del disco di cefoxitina, richied...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estrattore di acidi nucleici automatizzato	DAAN	Intelligente 32	Per estrazione di DNA
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Armadio di biosicurezza
E-Centrifuga	WEALTEC		Centrifugare il liquido residuo dalla parete della provetta
Kit per il rilevamento di geni di resistenza ai farmaci Staphylococcus aureus resistente alla meticillina	BOJIE	ZC-HX-38-2	Rilevamento di geni di resistenza allo Staphylococcus aureus meticillino-resistenti
Kit di estrazione dell'acido nucleico	BOJIE	TQ-BG-001-96B	Estratto di acido nucleico
SLAN Sistema di analisi PCR medicale completamente automatico	HONGSHI		Analisi dei dati
Macchina per PCR in tempo reale SLAN-96S	HONGSHI	SLAN-96S	Amplificazione PCR quantitativa fluorescente
Thermo Scientific NanoDrop	Termo Scientifico	NanoDrop Uno	Analisi quantitativa di DNA, RNA e proteine
Congelatori a bassissima temperatura (DW-YL450)	MELING	20172220091 SEDA	-20 ° C per la conservazione dei reagenti
Vortice-5	Kylin-campana		Per la miscelazione di reagenti