Articolo metodologico

Un test LIVE/DEAD ottimizzato abbinato alla citometria a flusso per quantificare la sopravvivenza post-stress nelle cellule di lievito

DOI:

10.3791/69005

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29 agosto 2025

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1Department of Biology, University of Iowa, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per quantificare la sopravvivenza post-stress in campioni di lievito. Il test utilizza due coloranti fluorescenti, SYTO 9 e ioduro di propidio (PI), per quantificare l'integrità della membrana plasmatica. Utilizza la citometria a flusso per fornire stime quantitative e riproducibili delle frazioni cellulari vive, morte e danneggiate per campioni di stress post-ossidativo.

Abstract

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Quantificare la sopravvivenza è un compito comune e critico nella ricerca sul lievito. Le colorazioni LIVE/DEAD basate sull'integrità della membrana plasmatica forniscono un test rapido e ad alto rendimento per la sopravvivenza del lievito se abbinate alla citometria a flusso. Tuttavia, le variazioni nel tampone di colorazione, nella concentrazione del colorante, nel tempo di incubazione e nelle impostazioni della citometria a flusso possono influire sulla qualità e sulla riproducibilità dei dati. Questo protocollo presenta un saggio standardizzato LIVE/DEAD per la quantificazione della sopravvivenza post-stress nel lievito mediante citometria a flusso. Dopo aver trattato la Candida glabrata, un patogeno opportunistico del lievito, con diverse dosi di perossido di idrogeno, i campioni post-stress sono stati colorati con una colorazione bicomponente VIVO/MORTO costituita da SYTO 9 e ioduro di propidio (PI). La citometria a flusso è stata utilizzata per distinguere le popolazioni di cellule vive, danneggiate e morte e quantificare le loro percentuali in ciascun campione. Le stime di sopravvivenza basate sulla statistica della percentuale di vivi sono state confrontate con il risultato dell'Unità Formante Colonia (CFU) sullo stesso campione. I due metodi hanno prodotto risultati coerenti per i campioni trattati con dose simulata e letale (1 M, H, 2, O2). Alla dose subletale di 100 mM H2O2, SYTO 9/PI ha stimato un tasso di sopravvivenza più elevato rispetto alle CFU, riflettendo una differenza chiave tra i due, dove il protocollo qui presentato valuta la sopravvivenza cellulare immediatamente dopo lo stress, mentre le CFU quantificano la percentuale di cellule in grado di riprendersi e riprodursi. Pertanto, questo protocollo misura la vitalità in una fase precoce del processo di morte cellulare. In sintesi, il protocollo qui descritto fornisce un'alternativa rapida e scalabile alle CFU per la quantificazione della sopravvivenza post-stress nel lievito. I suoi risultati forniscono informazioni complementari alle UFC, valutando la sopravvivenza in uno stadio precoce e distinguendo tra cellule morte e danneggiate.

Introduzione

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Il subphylum del lievito in gemmazione contiene molti importanti modelli biologici e biotecnologici. Un compito comune e critico nella ricerca sul lievito è quantificare l'effetto di perturbazioni genetiche o ambientali, queste ultime includono stress o trattamenti farmacologici. Nella fermentazione industriale, ad esempio, i produttori devono monitorare la vitalità delle colture di lievito per garantire l'efficienza e la qualità del processo di fermentazione 1,2. Quando si studiano le specie di lievito patogene, misurare la loro sopravvivenza dopo stress o trattamento antimicotico è fondamentale per comprendere le basi genetiche e meccanicistiche dei tratti correlati alle infezioni, come la resistenza agli antifungini. Anche la misurazione della sopravvivenza su cateteri e superfici è un compito importante in ambito clinico3. Questi diversi scenari richiedono tutti approcci quantitativi in grado di misurare rapidamente e accuratamente l'esito dei trattamenti farmacologici e di stress.

I metodi esistenti per raggiungere l'obiettivo di cui sopra rientrano in tre categorie principali in base a ciò che misurano. La prima categoria misura la clonogenicità, o la capacità delle singole cellule di lievito di formare una singola colonia in seguito allo stress. Il metodo rappresentativo in questa categoria è il saggio dell'Unità Formante Colonia (CFU). La seconda categoria misura la vitalità, che si basa sul rilevamento delle attività enzimatiche nelle cellule vive. Gli esempi includono sonde chimiche come il colorante FUN-14. La terza categoria di metodi misura l'integrità della membrana plasmatica: una perdita irreversibile dell'integrità della membrana plasmatica è considerata il "punto di non ritorno" per la morte cellulare5. Esempi di questa categoria includono coloranti fluorescenti come lo ioduro di propidio (PI).

Questo lavoro presenta un saggio VIVO/MORTO ottimizzato accoppiato con citometria a flusso per ottenere una quantificazione rapida e scalabile della sopravvivenza del lievito dopo il trattamento da stress. Questo test basato sulla permeabilità della membrana è più veloce del CFU, impiegando 15-30 minuti di colorazione rispetto alle 24-48 ore di incubazione per la formazione delle colonie. Inoltre, i campioni colorati con una colorazione LIVE/DEAD possono essere facilmente analizzati utilizzando la citometria a flusso oltre alla microscopia, che misura decine di migliaia di cellule in pochi secondi e può facilmente elaborare campioni a 96 pozzetti per saggi ad alto rendimento. Di conseguenza, questo test è rapido, quantitativo e scalabile. In questo protocollo, viene utilizzato un colorante VIVO/MORTO a due componenti costituito da SYTO 9 e PI per ottenere un maggiore potere risolutivo. SYTO 9 marca tutte le cellule, vive o morte, mentre PI entra solo nelle cellule con membrane plasmatiche compromesse 6,7. Pertanto, le cellule vive accumulano solo SYTO 9 mentre le cellule morte accumulano sia SYTO 9 che PI. Poiché PI ha un'affinità maggiore rispetto a SYTO 9 per l'acido nucleico, esclude in modo competitivo quest'ultimo nella cellula8. Inoltre, i due coloranti formano una coppia di trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET), in cui l'emissione di SYTO 9 viene assorbita da PI come sua eccitazione. Di conseguenza, le cellule morte mostrano un verde tenue e una forte fluorescenza rossa. Al contrario, le cellule vive mostrano una fluorescenza verde brillante8. Questa differenza consente una migliore differenziazione tra cellule vive e morte in presenza di variazioni nell'intensità della fluorescenza all'interno di ciascun gruppo.

Da un rapporto iniziale sulla sua applicazione nel lievito nel 2004, l'uso di SYTO 9/PI negli studi sul lievito è stato frammentario e in gran parte limitato a valutazioni qualitative utilizzando la microscopia 7,9,10,11,12,13,14,15. Uno dei principali limiti alla sua adozione come saggio quantitativo per la sopravvivenza del lievito è la mancanza di caratterizzazione sistematica e di confronto con metodi ampiamente utilizzati come i CFU. Questo protocollo descrive un test standardizzato che include il tampone di colorazione, la concentrazione del colorante, il tempo di colorazione e le impostazioni della citometria a flusso, che sono stati trovati per ridurre al minimo gli artefatti e generare risultati riproducibili quando applicati a C. glabrata e ad altre due specie di lievito16. Poiché la colorazione SYTO 9/PI rivela una popolazione intermedia "danneggiata" di cellule che differiscono sia dalle cellule vive che da quelle morte nel loro modello di colorazione, può integrare le CFU rivelando informazioni più sfumate sugli effetti del trattamento da stress sulle cellule di lievito, consentendo potenzialmente nuove applicazioni.

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Protocollo

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I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Applicazione dello stress da perossido di idrogeno

  1. Almeno un giorno prima dell'esperimento, innoculare una coltura notturna di C. glabrata da una singola colonia su una piastra appena striata in 3 ml di terreno sintetico completo (SC) (1,7 g/L di base di azoto per lievito, miscela completa di aminoacidi, 2% p/v di glucosio, acqua) e coltivarla posizionando il tubo di vetro in un tamburo a rulli e crescere a 30 °C. In alternativa, è possibile utilizzare un agitatore orbitale posizionando il tubo di vetro con un angolo inclinato e agitando la coltura a 200 giri/min.
    1. Misurare la densità ottica (OD600) della coltura notturna la mattina successiva e diluirla con terreno SC fresco a OD600 ~0,2 in un volume totale di 10 mL. Lasciarlo crescere per due raddoppi, che impiegano circa 4 ore, per raggiungere la fase di metà tronco (OD600 ~1).
      ESEMPIO: Se una coltura notturna ha un OD600 = 10, aggiungere 200 μL di questa coltura a 9,8 mL di terreno SC.
  2. Entro 30 minuti prima del trattamento da stress, preparare il mezzo di stress con perossido di idrogeno. Diluire in serie il perossido di idrogeno dal 30% (9,798 M) in mezzi sintetici completi (SC) alla concentrazione desiderata. Includere un trattamento simulato (SC senza perossido di idrogeno aggiunto) e una dose letale (1 M è adatto per C. glabrata).
    ESEMPIO: Per creare un mezzo di stress con perossido di idrogeno da 100 mM, aggiungere 10,3 μl di perossido di idrogeno da 9,798 M a 1 mL SC. Pipettare delicatamente per miscelare. Per creare un mezzo di stress con perossido di idrogeno da 10 mM, diluire 500 μL dei 100 mM di terreno di stress con perossido di idrogeno in 4,5 mL di SC.
  3. Misurare l'OD600 della coltura mid-log e standardizzarlo, ad esempio, a OD600 = 1, aggiungendo terreni SC.
    ESEMPIO: la cultura mid-log è a OD600 = 1,2. Aggiungere 0,2 mL di terreno SC per 1 mL di coltura.
  4. Trasferire 600 μL di coltura mid-log per condizione di test in una piastra a 96 pozzetti. Celle a pellet per centrifugazione a 3.000 x g per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela il surnatante per aspirazione senza disturbare il pellet cellulare.
  5. Aggiungere 600 μl di terreno di stress simulato o di perossido di idrogeno preparato al punto 1.2 a ciascun pozzetto e pipettare delicatamente per risospendere le cellule.
  6. Incubare la piastra per 120 minuti a 30 °C agitando a 300 giri/min.
    NOTA: Il tempo di incubazione dipende dalla questione biologica di interesse.

2. Applicazione del colorante SYTO 9/PI

  1. Prima dell'esperimento, preparare almeno 10 ml di tampone salino sterile allo 0,85%.
    NOTA: Abbiamo riscontrato che il tampone salino allo 0,85% produce artefatti di colorazione minimi, cioè cellule non colorate e morte in campioni trattati con simulazione, rispetto all'acqua deionizzata o ai terreni di crescita16.
  2. Preparare una soluzione madre di PI a 0,2 mM utilizzando acqua sterile e deionizzata.
    NOTA: Questa scorta di PI può essere conservata fino a 6 mesi a 4 °C.
  3. Immediatamente prima dell'esperimento, preparare una soluzione madre di SYTO 9 funzionante a 33,4 μM con acqua sterile e deionizzata.
    NOTA: Preparare il brodo di lavoro SYTO 9 fresco per ogni esperimento. Non conservare e riutilizzare.
  4. Pipettare delicatamente per mescolare le cellule in ciascun pozzetto dalla piastra di trattamento. Misurare OD600 di ciascuna condizione di trattamento e calcolare la quantità di tampone necessaria per risospendere le cellule a un OD600 di 1.
    NOTA: Le pipette multicanale possono essere utilizzate per una miscelazione efficiente e uniforme. Evitare di mescolare eccessivamente i campioni.
  5. Raccogliere le cellule di lievito dopo il mock o il trattamento di stress mediante centrifugazione a 3.000 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante con cura attraverso l'aspirazione. Risospendere le cellule in tampone salino sterile allo 0,85% con OD600 = 1 (calcolato al punto 2.4).
    NOTA: Utilizzare una pipetta multicanale per risospendere le cellule. Maneggiare con cura tutte le colture post-trattamento ed evitare la miscelazione eccessiva.
  6. Riservare 50 μl di ciascun campione per i controlli di colorazione non colorati e con colorante singolo.
    NOTA: È stata riscontrata un'autofluorescenza minima per C. glabrata wild-type in entrambi i canali per SYTO 9 e PI. Tuttavia, controllare sempre l'autofluorescenza dei campioni non colorati ed eseguire una corretta sottrazione del fondo o utilizzare terreni di crescita a bassa autofluorescenza.
  7. Aliquotare 16 μl di campione post-trattamento risospeso in tampone salino allo 0,85% in una provetta PCR da 50 μl. Aggiungere 2 μl di 0,2 mM di PI alla sospensione cellulare. Quindi aggiungere 2 μl del materiale di lavoro da 33,4 μM di SYTO 9 alla stessa provetta fino a un volume finale di 20 μl.
    1. Le concentrazioni finali di PI e SYTO 9 saranno rispettivamente di 20 μM e 3,34 μM. Pipettare delicatamente per mescolare e incubare per 30 minuti al buio (è possibile utilizzare una scatola nera) a temperatura ambiente.

3. Impostazione e calibrazione del citometro a flusso

NOTA: Questo dovrebbe essere fatto su ogni nuovo strumento e anche su nuove applicazioni della colorazione SYTO 9/PI, anche per una specie/ceppo diverso, un nuovo fattore di stress o un protocollo di crescita, ecc. Le impostazioni seguenti sono state sviluppate su un citometro a flusso Attune NxT. Fare riferimento al manuale d'uso dello strumento in uso per istruzioni specifiche.

  1. Scegliere i canali/filtri di fluorescenza appropriati per il citometro a flusso: un filtro passa-banda da 530 nm ± 30 nm (BL1) e un filtro passa-lungo da 600 nm (> 600 nm, BL3) sono stati utilizzati per raccogliere i segnali nei canali verde (SYTO 9) e rosso (PI e SYTO 9). Entrambi erano eccitati da un laser blu a 488 nm.
  2. Impostare la portata su 200 μL/min e fermarla quando sono stati raccolti almeno 30.000 eventi.
    NOTA: Il numero di eventi per campione può essere regolato con l'obiettivo di ottenere stime affidabili delle percentuali. I campioni con un numero insufficiente di eventi (celle) devono essere esclusi. Il passaggio successivo consiste nel regolare le tensioni sui canali FSC e SSC durante la configurazione iniziale.
  3. Diluire 16 μL di campione non colorato in 200 μL di tampone salino sterile allo 0,85%. Pipettare delicatamente per miscelare immediatamente prima della citometria a flusso. Eseguire questo esempio e regolare le tensioni dei canali FSC e SSC in modo che la popolazione sia al centro dell'FSC rispetto all'FSC vs. Grafico della densità SSC.
    NOTA: Una tensione di 345 mV e 399 mV è stata utilizzata rispettivamente per l'FSC e l'SSC. I passaggi successivi consistono nel regolare le tensioni sui canali di raccolta (BL1 e BL3) durante la configurazione iniziale.
  4. Miscelare 24 μL di campione simulato con 24 μL di campione trattato con perossido di idrogeno da 1000 mM o ucciso termicamente.
  5. Dividere il campione misto di cellule vive e morte in tre provette da 16 μl ciascuna. Colorare le tre provette con (1) 2 μL di SYTO 9 e 2 μL di acqua per 30 minuti; (2) 2 μL di PI e 2 μL di acqua per 30 minuti; (3) 2 μL di SYTO 9 e 2 μL di PI per 30 min. Seguire il protocollo di colorazione della sezione precedente.
    1. Dopo l'incubazione, aggiungere 200 μl di tampone salino sterile allo 0,85% in ciascuna provetta. Ora sono pronti per la citometria a flusso.
  6. Far scorrere il tubo (1) per regolare la tensione del canale a fluorescenza verde (BL1); quindi far scorrere il tubo (2) per regolare la tensione della fluorescenza rossa (BL3). L'obiettivo è quello di avere la modalità di distribuzione dell'intensità di ciascun canale ~10 4-105 in modo da utilizzare l'intera gamma dinamica dello strumento.
    NOTA: Si prega di seguire le istruzioni del citometro a flusso specifico quando si regolano le tensioni. Alcuni citometri a flusso hanno tensioni fisse e questo passaggio viene omesso.
  7. Eseguire la provetta (3) per verificare se le popolazioni di cellule vive e morte sono ben separate. Se necessario, regolare le tensioni dei canali BL1 o BL3.
    NOTA: Una tensione di 200 mV è stata utilizzata per entrambi i canali BL1 e BL3 sull'Attune NxT.
  8. Eseguire il campione non colorato con finto trattamento con le impostazioni di tensione stabilite per garantire che il campione abbia un'autofluorescenza minima nei canali di interesse (<102).

4. Esecuzione dei campioni sul citometro a flusso

  1. Applicare le impostazioni del citometro a flusso stabilite sopra ed eseguire prima il campione non colorato per assicurarsi che i segnali di autofluorescenza siano inferiori a 102 in entrambi i canali BL1 e BL3.
  2. Aggiungere 200 μl di tampone salino allo 0,85% a ciascun campione colorato ed eseguirlo sul citometro a flusso.
    NOTA: Se vengono analizzati più campioni, sfalsare la fase di colorazione in modo che ogni campione venga colorato per 30 minuti prima di essere eseguito sul citometro a flusso.
  3. Esportazione dell'output della citometria a flusso come file .fcs (standard FCS 3.0 o 3.1).

5. Analisi dei dati in R

NOTA: uno script di analisi di esempio viene fornito come file supplementare 1. Esempi di strategie di gating sono forniti nella sezione Risultati rappresentativi.

  1. Installa e carica i pacchetti richiesti: (1) flowCore (2) ggplot2 (3) ggcyto.
  2. Importare i file con estensione fcs nell'ambiente R corrente.
  3. Regola i nomi dei file e specifica le condizioni di trattamento.
  4. Crea un grafico di densità 2D per tutti gli eventi su FSC. H contro SSC.H. Utilizzare un gate poligonale per escludere eventi non di cella. Chiama questo cancello "celle".
    NOTA: Su alcuni citometri a flusso, il parametro Area è consigliato rispetto all'altezza. Controllare le raccomandazioni specifiche dello strumento.
  5. Per la popolazione con gate "cellule", creare un grafico di densità 2D su FSC. H contro FSC.W. Tipicamente, sono visibili due cluster con intervalli simili di FSC. H ma diverso FSC.W. Il cluster con un FSC medio inferiore. Il livello W contiene le singole celle ("singoletto"). Disegna un cancello poligonale per selezionarli e denomina il cancello "singolette".
  6. Per la popolazione recintata "singoletto", crea un grafico di densità 2D su BL1. H contro BL3.H. Disegna porte poligonali per popolazioni vive, danneggiate e morte in base ai controlli delle celle vive e morte. Un esempio è fornito nella sezione Risultati rappresentativi.
  7. Determina la sopravvivenza utilizzando le percentuali di ogni popolazione ed esporta le statistiche.

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Risultati

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La colorazione SYTO 9/PI distingue le cellule di lievito vive da quelle morte in base ai loro segnali di fluorescenza nei canali verde (500 nm-560 nm) e rosso (>600 nm). Le cellule vive, che accumulano solo SYTO 9, emettono una forte fluorescenza nel canale verde, con segnali rossi minimi. Le cellule morte accumulano sia SYTO 9 che PI e si prevede che emettano una forte fluorescenza nel canale rosso, con segnali di fluorescenza verde inferiori rispetto al...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un saggio VIVO/MORTO utilizzando due coloranti fluorescenti, SYTO 9 e PI, e utilizzando la citometria a flusso per quantificare la sopravvivenza post-stress nel lievito. Sebbene queste due colorazioni siano state applicate in letteratura per valutare la sopravvivenza in varie specie di lievito e siano disponibili come kit commerciale, né il manuale del produttore né la letteratura forniscono dettagli sufficienti sul protocollo di colorazione o sulle impostazion...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare il Dr. Michael Dailey e il Carver Center for Imaging per la loro formazione e il loro supporto per la microscopia. Vorremmo ringraziare i membri passati e attuali del Gene Regulatory Lab per il prezioso feedback sul protocollo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra del pozzo profondo a 96 pozziThermo Fisher278606NUNC 96
Citometro di flusso Attune NxT con lettore di piastreThermo Fisher A24858A24858Autocampionatore (A42901)
Candida glabrataCG99, ceppo di laboratorio derivato da isolato clinico (Cormack & Falkow, 1999)
FungaLight Yeast LIVE/DEAD KitThermo Fisher A24858L34952Contiene SYTO 9 (3,34 mM) e propidio ioduro (20 mM). Questi due componenti possono anche essere acquistati separatamente da vari venditori.
Perossido di idrogenoSigma AldrichH1009
Microscopio Leica Confocal SP8LeicaTCS SP8 X
Cloruro di sodioSigma AldrichS9888Usato per preparare una soluzione sterilizzata di NaCl allo 0,85%
Base azotata del lievito senza amminoacidiSigma AldrichY0626usata per produrre il mezzo completo sintetico con un mix al 2% di glucosio e amminoacidi

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lourens-Hattingh, A., Viljoen, B. Growth and survival of a probiotic yeast in dairy products. Food Res Int. 34 (9), 791-796 (2001).
  2. Qiu, X., et al. Stress tolerance phenotype of industrial yeast: industrial cases, cellular changes, and improvement strategies. Appl Microbiol Biotechnol. 103 (16), 6449-6462 (2019).
  3. Welsh, R., et al. Survival, persistence, and isolation of the emerging multidrugresistant pathogenic yeast Candida auris on a plastic health care surface. J Clin Microbiol. 55 (10), 2996-3005 (2017).
  4. Millard, P. J., Roth, B. L., Thi, H. P., Yue, S. T., Haugland, R. P. Development of the FUN1 family of fluorescent probes for vacuole labeling and viability testing of yeasts. Appl Environ Microbiol. 63 (7), 2897-2905 (1997).
  5. WlochSalamon, D. M., Bem, A. E. Types of cell death and methods of their detection in yeast Saccharomyces cerevisiae. J Appl Microbiol. 114 (2), 287-298 (2013).
  6. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD BacLight: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. J. Microbiol. Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  7. Zhang, T., Fang, H. H. P. Quantification of Saccharomyces cerevisiae viability using BacLight. Biotechnol Lett. 26 (12), 989-992 (2004).
  8. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry A. 61A (2), 189-195 (2004).
  9. Sun, S., Baryshnikova, A., Brandt, N., Gresham, D. Genetic interaction profiles of regulatory kinases differ between environmental conditions and cellular states. Mol Syst Biol. 16 (5), e9167(2020).
  10. Li, Z., et al. Allicin shows antifungal efficacy against Cryptococcus neoformans by blocking the fungal cell membrane. Front Microbiol. 13, 1012516(2022).
  11. Jin, Y., Zhang, T., Samaranayake, Y., Fang, H. H. P., Yip, H. K., Samaranayake, L. P. The use of new probes and stains for improved assessment of cell viability and extracellular polymeric substances in Candida albicans biofilms. Mycopathologia. 159 (3), 353-360 (2005).
  12. Bojsen, R., Regenberg, B., Folkesson, A. Saccharomyces cerevisiae biofilm tolerance towards systemic antifungals depends on growth phase. BMC Microbiol. 14, 305(2014).
  13. Ryan, L. K., et al. Activity of potent and selective host defense peptide mimetics in mouse models of oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3820-3827 (2014).
  14. Chudzik, B., Koselski, M., Czuryło, A., Trębacz, K., Gagoś, M. A new look at the antibiotic amphotericin B effect on Candida albicans plasma membrane permeability and cell viability functions. Eur. Biophys. J. (EBJ). 44 (1-2), 77-90 (2015).
  15. Roscetto, E., Contursi, P., Vollaro, A., Fusco, S., Notomista, E., Catania, M. R. Antifungal and antibiofilm activity of the first cryptic antimicrobial peptide from an archaeal protein against Candida spp. clinical isolates. Sci Rep. 8 (1), 17570(2018).
  16. Tang, H., Liang, J., He, B. Z. An optimized LIVE/DEAD assay using flow cytometry to quantify poststress and antifungaltreatment survival in diverse yeasts. BioRiv. , (2025).
  17. Stiefel, P., SchmidtEmrich, S., ManiuraWeber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiol. 15 (1), 36(2015).
  18. Rego, A., Ribeiro, A., CôrteReal, M., Chaves, S. Monitoring yeast regulated cell death: Trespassing the point of no return to loss of plasma membrane integrity. Apoptosis. 27 (9), 778-786 (2022).
  19. CarmonaGutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  20. Miller, J., et al. Using colony size to measure fitness in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 17 (10), e0271709(2022).

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