Un test LIVE/DEAD ottimizzato abbinato alla citometria a flusso per quantificare la sopravvivenza post-stress nelle cellule di lievito

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare la sopravvivenza post-stress in campioni di lievito. Il test utilizza due coloranti fluorescenti, SYTO 9 e ioduro di propidio (PI), per quantificare l'integrità della membrana plasmatica. Utilizza la citometria a flusso per fornire stime quantitative e riproducibili delle frazioni cellulari vive, morte e danneggiate per campioni di stress post-ossidativo.

Abstract

Quantificare la sopravvivenza è un compito comune e critico nella ricerca sul lievito. Le colorazioni LIVE/DEAD basate sull'integrità della membrana plasmatica forniscono un test rapido e ad alto rendimento per la sopravvivenza del lievito se abbinate alla citometria a flusso. Tuttavia, le variazioni nel tampone di colorazione, nella concentrazione del colorante, nel tempo di incubazione e nelle impostazioni della citometria a flusso possono influire sulla qualità e sulla riproducibilità dei dati. Questo protocollo presenta un saggio standardizzato LIVE/DEAD per la quantificazione della sopravvivenza post-stress nel lievito mediante citometria a flusso. Dopo aver trattato la Candida glabrata, un patogeno opportunistico del lievito, con diverse dosi di perossido di idrogeno, i campioni post-stress sono stati colorati con una colorazione bicomponente VIVO/MORTO costituita da SYTO 9 e ioduro di propidio (PI). La citometria a flusso è stata utilizzata per distinguere le popolazioni di cellule vive, danneggiate e morte e quantificare le loro percentuali in ciascun campione. Le stime di sopravvivenza basate sulla statistica della percentuale di vivi sono state confrontate con il risultato dell'Unità Formante Colonia (CFU) sullo stesso campione. I due metodi hanno prodotto risultati coerenti per i campioni trattati con dose simulata e letale (1 M, H_{, 2}, O₂). Alla dose subletale di 100 mM H₂O₂, SYTO 9/PI ha stimato un tasso di sopravvivenza più elevato rispetto alle CFU, riflettendo una differenza chiave tra i due, dove il protocollo qui presentato valuta la sopravvivenza cellulare immediatamente dopo lo stress, mentre le CFU quantificano la percentuale di cellule in grado di riprendersi e riprodursi. Pertanto, questo protocollo misura la vitalità in una fase precoce del processo di morte cellulare. In sintesi, il protocollo qui descritto fornisce un'alternativa rapida e scalabile alle CFU per la quantificazione della sopravvivenza post-stress nel lievito. I suoi risultati forniscono informazioni complementari alle UFC, valutando la sopravvivenza in uno stadio precoce e distinguendo tra cellule morte e danneggiate.

Introduzione

Il subphylum del lievito in gemmazione contiene molti importanti modelli biologici e biotecnologici. Un compito comune e critico nella ricerca sul lievito è quantificare l'effetto di perturbazioni genetiche o ambientali, queste ultime includono stress o trattamenti farmacologici. Nella fermentazione industriale, ad esempio, i produttori devono monitorare la vitalità delle colture di lievito per garantire l'efficienza e la qualità del processo di fermentazione ^1,2. Quando si studiano le specie di lievito patogene, misurare la loro sopravvivenza dopo stress o trattamento antimic....

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Applicazione dello stress da perossido di idrogeno

1. Almeno un giorno prima dell'esperimento, innoculare una coltura notturna di C. glabrata da una singola colonia su una piastra appena striata in 3 ml di terreno sintetico completo (SC) (1,7 g/L di base di azoto per lievito, miscela completa di aminoacidi, 2% p/v di glucosio, acqua) e coltivarla posizionando il tubo di vetro in un tamburo a rulli e crescere a 30 °C. In alternativa, è possibile utilizzare....

Risultati

La colorazione SYTO 9/PI distingue le cellule di lievito vive da quelle morte in base ai loro segnali di fluorescenza nei canali verde (500 nm-560 nm) e rosso (>600 nm). Le cellule vive, che accumulano solo SYTO 9, emettono una forte fluorescenza nel canale verde, con segnali rossi minimi. Le cellule morte accumulano sia SYTO 9 che PI e si prevede che emettano una forte fluorescenza nel canale rosso, con segnali di fluorescenza verde inferiori rispetto al.......

Discussione

Questo protocollo descrive un saggio VIVO/MORTO utilizzando due coloranti fluorescenti, SYTO 9 e PI, e utilizzando la citometria a flusso per quantificare la sopravvivenza post-stress nel lievito. Sebbene queste due colorazioni siano state applicate in letteratura per valutare la sopravvivenza in varie specie di lievito e siano disponibili come kit commerciale, né il manuale del produttore né la letteratura forniscono dettagli sufficienti sul protocollo di colorazione o sulle impostazion.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra del pozzo profondo a 96 pozzi	Thermo Fisher	278606	NUNC 96
Citometro di flusso Attune NxT con lettore di piastre	Thermo Fisher A24858	A24858	Autocampionatore (A42901)
Candida glabrata			CG99, ceppo di laboratorio derivato da isolato clinico (Cormack & Falkow, 1999)
FungaLight Yeast LIVE/DEAD Kit	Thermo Fisher A24858	L34952	Contiene SYTO 9 (3,34 mM) e propidio ioduro (20 mM). Questi due componenti possono anche essere acquistati separatamente da vari venditori.
Perossido di idrogeno	Sigma Aldrich	H1009
Microscopio Leica Confocal SP8	Leica	TCS SP8 X
Cloruro di sodio	Sigma Aldrich	S9888	Usato per preparare una soluzione sterilizzata di NaCl allo 0,85%
Base azotata del lievito senza amminoacidi	Sigma Aldrich	Y0626	usata per produrre il mezzo completo sintetico con un mix al 2% di glucosio e amminoacidi