Estrazione di RNA basata su fenolo caldo ottimizzata da micobatteri: un approccio robusto per l'analisi affidabile dell'espressione genica

Sommario

Questo studio ottimizza un metodo di estrazione dell'RNA basato sul fenolo caldo per Mycobacterium, producendo RNA di alta qualità adatto ad analisi trascrittomique. Confrontato con TRIzol e RNeasy in condizioni identiche, il metodo ha fornito un resa superiore, integrità comparabile e una maggiore efficienza economica, offrendo un'alternativa pratica per studi su larga scala dell'espressione genica.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) rimane una grave minaccia per la salute globale, evidenziando la necessità di studi trascrittomica affidabili per comprenderne la biologia e i meccanismi di resistenza ai farmaci. Tali analisi dipendono dall'ottenimento di RNA di alta qualità e resa elevata. Sebbene siano disponibili diversi metodi di estrazione dell'RNA, molti richiedono reagenti costosi, grandi volumi di coltura o attrezzature specializzate, limitandone l'adeguatezza per studi su larga scala, in particolare in contesti con risorse limitate. In questo lavoro viene presentato un metodo ottimizzato di estrazione dell'RNA basato sul fenolo caldo, specificamente adattato per i micobatteri. Il metodo utilizza un volume minimo di coltura e reagenti comunemente disponibili, garantendo costantemente RNA di alta qualità adatto ad applicazioni trascrittomiche ad alto rendimento. La quantità e l'integrità dell'RNA sono state valutate mediante elettroforesi su gel e analisi dell'integrità dell'RNA (RIN), mentre la sua idoneità per applicazioni successive è stata confermata mediante qPCR e Qubit 4. Per confrontare le prestazioni del metodo ottimizzato, è stata effettuata un'estrazione parallela dell'RNA utilizzando TRIzol e RNeasy in condizioni sperimentali identiche, inclusa la stessa specie di Mycobacterium, volume di coltura, fase di crescita (logaritmica e stazionaria) e condizioni di lisi. Ciò ha permesso un confronto diretto in termini di resa, qualità, fattibilità e costo. Il metodo ottimizzato con fenolo caldo ha dimostrato una resa e una qualità dell'RNA paragonabili o migliori, riducendo significativamente il costo dei reagenti e la dipendenza da attrezzature specializzate. Grazie alla sua efficienza, riproducibilità e convenienza economica, questo protocollo rappresenta un'alternativa pratica per studi su larga scala di espressione genica e trascrittomica in Mtb e in altre specie di micobatteri.

Introduzione

M. tuberculosis (Mtb), l'agente causale della tubercolosi (TB), rimane la principale causa di morte dovuta a un singolo patogeno infettivo, superando l'HIV/AIDS. Nel 2024, la TB ha causato circa 1,3 milioni di decessi in tutto il mondo¹. Questo carico è aggravato dall'aumento della prevalenza di ceppi multiresistenti (MDR) ed estensivamente resistenti ai farmaci (XDR). Pertanto, è urgente comprendere la base molecolare della patogenesi della TB e identificare nuovi bersagli terapeutici².

Il profilo trascrizionale di Mtb è diventato uno strumento importante per chiarire gli elementi funzionali coinvolti nelle interazioni ospite-patogeno³, nell'adattamento allo stress ambientale⁴ e nei meccanismi alla base della resistenza ai farmaci⁵. Metodologie avanzate come la PCR in tempo reale, i microarray e il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) hanno notevolmente migliorato la capacità di analizzare il trascrittoma micobatterico⁶. Tuttavia, il successo di questi metodi dipende fortemente dalla disponibilità di RNA di alta qualità, che a sua volta dipende da una lisi cellulare efficiente durante l'estrazione. La parete cellulare complessa di Mtb, composta da miocolil–arabinogalattano–peptidoglicano, rende l'estrazione dell'RNA particolarmente difficile⁷. Le tecniche di lisi esistenti, tra cui l'idrolisi enzimatica⁸, la sonificazione⁹ e la lisi meccanica con perline¹⁰, richiedono spesso apparecchiature costose e grandi volumi di coltura, limitandone l'applicabilità in molti laboratori BSL-3. Inoltre, il tasso di crescita lento di Mtb richiede tempi prolungati di coltura per ottenere una biomassa sufficiente¹¹.

Per superare questi limiti, è stato sviluppato un metodo ottimizzato di estrazione dell'RNA basato sul fenolo caldo, rapido ed economico. Utilizzando soltanto 3 mL di coltura in fase esponenziale, il metodo consente di ottenere da 45 a 60 µg di RNA di alta qualità, adatto ad analisi trascrittomique successive. La lisi cellulare viene ottenuta mediante un omogenizzatore tissutale portatile compatto e reagenti facilmente reperibili, eliminando la necessità di strumenti costosi. Sebbene il metodo del fenolo caldo sia stato descritto in precedenza^11,12, la versione ottimizzata migliora praticità, convenienza economica e resa di RNA. L'ottimizzazione è stata effettuata utilizzando M. smegmatis mc²155 (Msmeg) ed è stata convalidata con successo su Mtb H37Rv.

Protocollo

I reagenti e l'attrezzatura utilizzati sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Coltura di Mycobacterium

1. Inoculare 1 mL dallo stock glicerolato di Msmeg o Mtb in 10 mL di terreno Middlebrook 7H9 integrato con 0,2% di glicerolo, 0,05% di Tween 80 e 10% di ADC a 37 °C con agitazione a 150 rpm fino a quando l'OD raggiunge 1–1,5.
2. Fare crescere la coltura secondaria aggiungendo l'1% della coltura primaria in 10 mL di terreno 7H9 fino alla fase esponenziale intermedia, OD_600nm = 0,6–0,7.
3. Distribuire in aliquote da 3 mL e centrifugare le colture a 2000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (23–25 °C).
4. Conservare i pellet a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA.
   ATTENZIONE: Per le colture di Mtb, seguire le appropriate linee guida BSL3 e inattivare termicamente il pellet a 95 ˚C per 20–25 minuti.
   NOTA: Figura 1 mostra il diagramma di flusso dei passaggi fondamentali seguiti durante l'estrazione dell'RNA con il metodo del fenolo caldo.

Figura 1: Rappresentazione schematica del metodo del fenolo caldo e dell'analisi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Estrazione dell'RNA

1. Metodo Hot-Phenol (metodo HP)
   1. Aggiungere 200 µL di tampone TES (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 5 mM EDTA, pH 8,0; 0,1 M NaCl; % SDS; 1% β-mercaptoetanolo) al pellet cellulare e risospendere il pellet mediante vortex.
   2. Aggiungere circa 0,1 g di perle di silice da 0,1 mm al campione. Utilizzare un omogenizzatore manuale per 10–15 s fino a quando il pellet non si sarà completamente scongelato su ghiaccio. Ripetere questo passaggio per altri 2 cicli, seguiti da congelamento rapido in azoto liquido dopo ogni ripetizione.
   3. OPPURE utilizzare un omogeneizzatore meccanico ad alta velocità per 1 min a velocità 5 (5,0 m/s) a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio per 3 cicli e incubare il campione su ghiaccio per prevenire il surriscaldamento dopo ogni ciclo.
      NOTA: Ripetere la lisi delle cellule di Mtb per 6–8 cicli (ciascun ciclo di 1 min) con un omogenizzatore manuale o un omogeneizzatore meccanico, raffreddando intermittente su ghiaccio dopo ogni ciclo. Utilizzare acqua trattata con DEPC (dietilpirocarbonato) per la preparazione di tutti i tamponi e reagenti necessari per l'estrazione dell'RNA.
   4. Aggiungere ulteriori 200 µL di tampone TES (pre-riscaldato a 65 °C) a ciascun campione per raggiungere un volume finale di 400 µL. Aggiungere a ciascun campione 200 µL di fenolo acido (fenolo equilibrato con tampone citrato 100 mM, pH 4,5) e 200 µL di cloroformio (miscelare il fenolo acido e il cloroformio in rapporto 1:1 prima di aggiungerli al campione).
   5. Incubare il campione a 65 °C su un blocco termico con agitazione a 900 rpm per 30 min e centrifugare a 12000 x g per 15 min a temperatura ambiente. Assicurarsi di ottenere una corretta separazione delle fasi dopo la centrifugazione (si osserverà una fase acquosa superiore chiara contenente l'RNA, un'interfase distinta contenente il DNA e una fase organica inferiore contenente proteine e lipidi).
   6. Prelevare lo strato superiore della fase acquosa e trasferirlo in una nuova provetta microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere nuovamente un volume equivalente di fenolo acido:cloroformio. Centrifugare a 12.000 x g per 15 min a temperatura ambiente. Assicurarsi una corretta separazione delle fasi.
   7. Trasferire lo strato acquoso superiore in una provetta microcentrifuga pulita da 1,5 mL, quindi aggiungere 30 µL di tampone acetato di sodio 3 M, pH 5,3, e 240 µL di isopropanolo freddo. Incubare a −80 °C per 30 min – 1 h.
      NOTA: La provetta microcentrifuga può essere conservata tutta la notte a -80 °C in questo passaggio. Sigillare la provetta microcentrifuga con più strati di parafilm per evitare che si apra a 65 °C durante l'incubazione.
      ATTENZIONE: Il fenolo e il cloroformio sono sostanze chimiche pericolose; pertanto, è necessario utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati, controlli ingegneristici come cappe aspiranti e procedure specifiche per lo smaltimento dei rifiuti.
   8. Centrifugare a 12.000 x g per 1 h a temperatura ambiente. Verificare la formazione del pellet e rimuovere con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet.
   9. Risospenderе il pellet in 1 mL di etanolo al 75% e centrifugare a 12.000 x g per 1 min a temperatura ambiente. Eseguire questo passaggio due volte e lasciare asciugare il pellet all'aria.
   10. Risospenderе il pellet in 50 µL di acqua priva di nucleasi.
       ​NOTA: Per sciogliere l'RNA, incubarlo in acqua priva di RNasi per 10–30 min a temperatura ambiente.
2. Metodo TRIzol
   1. Aggiungere 200 µL di reagente TRIzol al pellet cellulare.
      ATTENZIONE: Il TRIzol è una sostanza chimica pericolosa; pertanto, è necessario utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati, controlli ingegneristici come cappe aspiranti e procedure specifiche per lo smaltimento dei rifiuti.
   2. Seguire il metodo di lisi cellulare descritto nei passaggi 2.1.2 - 2.1.3.
   3. Aggiungere ulteriori 200 µL di reagente TRIzol, seguiti da 200 µL di cloroformio, e vortexare per 1 min. Centrifugare a 13.400 x g per 15 min a 4 °C. Assicurarsi una corretta separazione delle fasi dopo la centrifugazione.
   4. Trasferire con attenzione la fase acquosa in una nuova provetta microcentrifuga da 1,5 mL.
   5. Precipitare l'RNA aggiungendo 500 µL di isopropanolo alla fase acquosa e incubando a −80 °C per 30 min – 1 h.
   6. Formare il pellet dell'RNA mediante centrifugazione a 15.000 x g per 20 min a 4 °C. Osservare attentamente il pellet e rimuovere il soprannatante senza disturbarlo.
   7. Risospenderе il pellet con 1 mL di etanolo al 75% e centrifugare a 13.400 x g per 1 min a 4 °C. Ripetere questo passaggio due volte, lasciare asciugare il pellet per 30 min a temperatura ambiente e risospendere in 50 µL di acqua priva di nucleasi.
3. Metodo con kit commerciale per l'estrazione dell'RNA
   1. Risospenderе il pellet cellulare in 200 µL di tampone di risospensione (fornito nel kit).
   2. Seguire il metodo di lisi cellulare descritto nei passaggi 2.1.2 - 2.1.3.
   3. Proseguire l'esperimento seguendo le istruzioni del produttore.

3. Trattamento con DNasi, quantificazione e visualizzazione

1. Per rimuovere la contaminazione da DNA genomico, aggiungere 1 µL di DNasi I (10 unità) e 5 µL di tampone RDD (1x) a ciascun campione di RNA e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
2. Quantificare il campione di RNA mediante spettrofotometria utilizzando Nanodrop e l'integrità dell'RNA mediante Qubit4. Il valore accettato di RIN è compreso tra 7,5 e 10. I valori accettati di A₂₆₀/A₂₈₀ e A₂₆₀/A₂₃₀ sono rispettivamente nell'intervallo 1,8–2,0 e 2,0–2,2.
3. Visualizzare l'RNA su gel di agarosio al 1% utilizzando colorante di carico RNA 1X.

4. Sintesi del cDNA e PCR quantitativa in tempo reale

1. Impostare una reazione da 20 µL per la preparazione del cDNA utilizzando il kit di trascrizione retrovirale del cDNA e 1 µg di RNA, seguendo le istruzioni del produttore in un termociclatore.
2. Impostare una reazione di PCR in tempo reale da 10 µL utilizzando 50 ng di cDNA, 0,4 µM di ciascun primer e SYBR secondo le istruzioni del produttore. Eseguire il campione sul termociclatore per PCR in tempo reale.
   NOTA: Per l'analisi di qPCR sono stati utilizzati i seguenti primer:
   Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
   Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
   Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
   Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
   Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
   Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'

5. Analisi statistica

1. Eseguire il test t di Student t-test con tutti i replicati biologici utilizzando Graph Pad Prism, P Un valore di ≤ 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Le barre di errore rappresentano l'errore standard di almeno tre replicati biologici.

Risultati

Qualità e resa dell'RNA

La qualità e la quantità dell'RNA sono state valutate mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2). Sono state osservate bande distinte e ben definite corrispondenti all'rRNA 23S e 16S per tutti i metodi di estrazione, confermando un isolamento riuscito di RNA totale. I metodi con fenolo caldo e TRIzol hanno mostrato tre bande chiare corrispondenti all'rRNA 23S (~2900 pb), 16S (~1500 pb) e 5S (~120 ...

Discussione

Sviluppare un metodo semplice e robusto per l'estrazione dell'RNA Mycobacterium, il metodo del fenolo caldo è stato ottimizzato. Successivamente, l'RNA estratto è stato confrontato con due approcci comunemente utilizzati: TRIzol e un metodo basato su kit con colonne^12,13Queste tecniche sono state confrontate in base al rendimento, purezza, integrità dell'RNA, costo e tempo di lavorazione, al fine di valutarne l'applicabilità pratica per applicazioni mole...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
sfere di silice da 0,1 mm	MP Biomedicals	MP116911050
2-propanolo	Sigma	278475
Bead Ruptor 4	revvity
cloroformio	Sigma	288306
centrifuga fredda	ThermoScientific	42541217
DNasi I	qiagen	79254
EDTA	sigma	E02SS
HCl	SRL	62889
blocco riscaldante	MIULAB	MU-E02-1049
kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription	Thermo Fischer Scientific	4368814
macinatore meccanico per tessuti G10	Coron	G22616008
NaCl	sigma	S5886
Nanophotometro N50	IMPLEM	T51601
fenolo equilibrato con tampone citrato 0,1 M, pH 4,5	Sigma	P4682
PowerUP SYBR	Applied Biosystems	A25742
fluorimetro Qubit 4	Invitrogen	2.32262E+12
ciclatore termico per PCR in tempo reale	Analytik Jena AG	844-00503-2
kit RNA easy	Qiagen	74104
SDS	Sigma	S9888
acetato di sodio	Sigma	S2889
ciclatore termico	Biorad	621BR29739
TRI Reagent	Sigma	T9424
Tris base	Himedia	MB029
β-mercaptoetanolo	Sigma	516732