Questo protocollo presenta un metodo per valutare l'apoptosi mediata da specie reattive dell'ossigeno (ROS) indotta da composti naturali in cellule di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC).
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo di ricerca
* These authors contributed equally
Questo protocollo presenta un metodo per valutare l'apoptosi mediata da specie reattive dell'ossigeno (ROS) indotta da composti naturali in cellule di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC).
Questo studio esplora il potenziale antitumorale di Pileostegia tomentella, con particolare attenzione alla sua capacità di indurre l'apoptosi classica nelle cellule di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) H1299 attraverso percorsi mediati da specie reattive dell'ossigeno (ROS). Utilizzando un approccio di isolamento guidato dalla bioattività, due composti attivi, umbelliferone (UMB) ed epi-Vogeloside, sono stati identificati come i principali costituenti citotossici. Entrambi i composti hanno mostrato effetti inibitori significativi sulla vitalità cellulare e hanno innescato efficacemente la morte cellulare apoptotica nelle cellule H1299. Le indagini meccanicistiche hanno dimostrato che il trattamento con UMB ed epi-Vogeloside ha portato a un marcato aumento dei livelli di ROS intracellulari, implicando lo stress ossidativo come mediatore chiave. L'analisi Western blot ha rivelato un aumento dei livelli di caspasi-3 scissa e una diminuzione dell'espressione della proteina anti-apoptotica Bcl-2, indicando l'attivazione della via apoptotica mitocondriale intrinseca. Inoltre, il profilo trascrittomico ha mostrato alterazioni diffuse nell'espressione genica, supportando ulteriormente l'interruzione dell'omeostasi cellulare. Questi risultati suggeriscono che la Pileostegia tomentella e i suoi costituenti attivi sono promettenti come potenziali agenti terapeutici per il cancro del polmone.
Il cancro rappresenta una formidabile sfida per la salute pubblica globale, caratterizzata da un notevole tasso di mortalità annuale. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) è il principale fattore globale di decessi correlati al cancro, costituendo circa l'85% dell'incidenza del cancro del polmone1. La cancerogenesi, un'interazione intrinsecamente complessa di processi molecolari e cellulari, è influenzata in modo critico dalle interruzioni dell'omeostasi delle specie reattive dell'ossigeno (ROS). I ROS, che includono ossidanti instabili come gli anioni superossido, i radicali ossidrilici e il perossido di idrogeno, sono sottoprodotti del normale metabolismo cellulare e svolgono funzioni essenziali nella segnalazione, nella proliferazione, nella differenziazione e nell'apoptosi2. Uno squilibrio nelle concentrazioni di ROS può precipitare lo stress ossidativo, attivando potenzialmente le vie di morte cellulare programmate, in particolare l'autofagia e l'apoptosi, impedendo così la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule tumorali3. Di conseguenza, i ROS mostrano un duplice ruolo in oncologia, agendo sia come promotori che come soppressori della progressione tumorale. Nell'ultimo decennio, le strategie terapeutiche per il NSCLC sono progredite in modo significativo, con lo sviluppo di nuovi agenti antitumorali progettati per sfruttare questa natura dicotomica dei ROS che rappresentano un'area di indagine particolarmente vivace4.
Numerosi agenti antitumorali sintetizzati chimicamente, come l'adriamicina (doxorubicina), il cisplatino e la ciclofosfamide, sono noti per indurre l'apoptosi nelle cellule tumorali promuovendo la produzione di ROS5. Nonostante i progressi nelle terapie mirate e negli anticorpi immunoterapici, la chemioterapia a base di platino continua ad essere la pietra angolare del trattamento per i pazienti con NSCLC. Tuttavia, l'emergere di resistenza ed effetti collaterali avversi della chemioterapia richiede lo sviluppo di nuovi farmaci anti-NSCLC. Di conseguenza, l'esplorazione delle fonti naturali di composti antitumorali è sempre più riconosciuta per la sua importanza e il suo potenziale. Recenti ricerche hanno evidenziato che alcuni estratti vegetali e i loro componenti attivi presentano potenti proprietà antitumorali, caratterizzate da bassa tossicità, elevata specificità e capacità di colpire più percorsi6. In particolare, alcuni di questi composti naturali possono modulare i livelli di ROS e la segnalazione7, inducendo così l'autofagia o l'apoptosi nelle cellule tumorali ed esercitando effetti terapeutici 8,9.
Pileostegia tomentella Mano. Lo zucc, un'erba perenne del genere Clematis all'interno della famiglia delle Buttercupaceae, si trova prevalentemente in regioni come il Giappone, la Corea del Nord e la Cina. I vari componenti della pianta, tra cui radici, steli, foglie e fiori, sono noti per le loro proprietà medicinali, offrendo benefici come la rimozione del calore, la disintossicazione, la riduzione del gonfiore, il sollievo dal dolore ed effetti antibatterici e antinfiammatori. Recenti ricerche hanno fatto luce sulle attività antitumorali degli estratti o dei principi attivi di Hoshi Hairy Vine, dimostrando effetti soppressivi del tumore su una serie di tumori, tra cui glioma, cancro al seno, al colon e al collo dell'utero10. Tuttavia, i meccanismi antitumorali specifici di Pileostegia tomentella, in particolare il suo potenziale ruolo nella modulazione dei ROS per indurre l'autofagia o l'apoptosi nelle cellule tumorali, rimangono in gran parte inesplorati.
Nonostante l'interesse emergente per i composti naturali per la terapia del cancro, i meccanismi pro-apoptotici dei costituenti chiave di Pileostegia tomentella nel cancro del polmone rimangono inesplorati. Questo studio è pioniere dell'identificazione e della dissezione meccanicistica di umbelliferone ed epi-Vogeloside come induttori selettivi dell'apoptosi ROS-dipendenti nel NSCLC.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Composizione chimica di Pileostegia tomentella e previsione del target NSCLC
I costituenti chimici di Pileostegia tomentella sono stati analizzati utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni combinata con la spettrometria di massa Orbitrap (HPLC-LTQ/MS). Gli estratti sono stati sciolti in solventi appropriati e filtrati prima dell'iniezione. La separazione cromatografica è stata ottenuta utilizzando una colonna in fase inversa nell'ambito di un programma di eluizione in gradiente su misura per le classi di composti. I dati della spettrometria di massa sono stati raccolti in modalità di ionizzazione elettrospray positiva in un intervallo di massa di 100-1500 m/z. Le strutture molecolari dei composti identificati sono state disegnate utilizzando un software di disegno chimico generico e salvate in formato SDF. Questi file strutturali sono stati inviati a uno strumento di previsione dei bersagli online per identificare potenziali bersagli biologici, con i primi 20 bersagli selezionati per un'ulteriore convalida. I bersagli associati al NSCLC sono stati recuperati da un database genetico accessibile al pubblico. I bersagli sovrapposti di entrambi i set di dati sono stati identificati come potenziali bersagli terapeutici di Pileostegia tomentella.
2. Costruzione della rete componente-target
I dati di interazione proteina-proteina per i bersagli previsti sono stati ottenuti da un database di interazioni proteiche ad accesso aperto. I dati di interazione sono stati importati in un software di visualizzazione di rete generale per costruire la rete di interazione composto-bersaglio. Le proprietà topologiche della rete, tra cui il grado di centralità, l'interposizione e la vicinanza, sono state analizzate utilizzando strumenti analitici integrati per identificare i nodi regolatori chiave.
3. Analisi dell'arricchimento del percorso KEGG
L'arricchimento funzionale delle proteine bersaglio previste è stato eseguito utilizzando l'analisi del percorso KEGG tramite strumenti di arricchimento disponibili al pubblico e software statistici. I percorsi con valori p aggiustati inferiori a 0,05 sono stati considerati significativi. I percorsi significativi sono stati integrati con i dati composto-bersaglio per costruire una rete di interazione "composto-bersaglio-percorso" utilizzando un software generico di visualizzazione della rete. L'analisi della topologia di rete ha evidenziato i principali hub regolatori biologici, illustrando i meccanismi multi-componente e multi-target di Pileostegia tomentella.
4. Estrazione dei costituenti di Pileostegia tomentella
I tralci di vite essiccati di Corydalis spinosa sono stati macinati in una polvere fine. Il materiale in polvere è stato estratto con il 70% di etanolo sotto trattamento ad ultrasuoni a temperatura ambiente per un periodo definito. L'estratto grezzo è stato filtrato e concentrato a pressione ridotta. La partizione liquido-liquido è stata eseguita utilizzando solventi di polarità crescente, tra cui etere di petrolio, acetato di etile e n-butanolo. La frazione di acetato di etile, che ha mostrato la più alta attività biologica nei saggi preliminari, è stata raccolta, concentrata, liofilizzata e conservata a -20 °C fino a nuovo utilizzo.
5. Linea cellulare e condizioni di trattamento
La linea cellulare di carcinoma polmonare umano H1299 è stata coltivata in terreno RPMI 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2. Le cellule sono state seminate a una densità appropriata e lasciate aderire durante la notte prima del trattamento. Le cellule sono state esposte a concentrazioni variabili (500 μg/mL, 750 μg/mL e 1.000 μg/mL) di due composti in esame, UMB ed epi-Vogeloside, come elencato nella Tabella 1. Dopo 24 ore di incubazione in condizioni di coltura standard, le cellule sono state raccolte per le analisi successive per valutare gli effetti biologici dei composti.
6. Saggio MTT per la vitalità cellulare
Gli effetti citotossici dei composti sono stati valutati utilizzando un saggio MTT colorimetrico. Le cellule H1299 sono state seminate in piastre da 96 pozzetti a una densità definita e lasciate aderire durante la notte. Le cellule sono state quindi trattate con i composti in esame per 72 ore in condizioni di coltura standard. Dopo il trattamento, una soluzione di MTT è stata aggiunta a ciascun pozzetto e incubata per consentire alle cellule vitali di convertire l'MTT in cristalli di formazano viola insolubili. Dopo l'incubazione, il terreno è stato rimosso e i cristalli di formazan sono stati disciolti in dimetilsolfossido (DMSO). L'assorbanza è stata misurata a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre. I valori di assorbanza corrispondono alla vitalità cellulare, fornendo una valutazione quantitativa della citotossicità dei composti.
7. Valutazione dell'integrità della membrana tramite rilascio di LDH
L'integrità della membrana cellulare è stata valutata misurando il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) come indicatore di citotossicità. Le cellule H1299 sono state trattate con i composti in esame per 24 ore, 48 ore o 72 ore. In ogni momento, i surnatanti di coltura sono stati raccolti e sottoposti a un test di attività LDH secondo il protocollo del produttore. Poiché l'LDH viene rilasciato solo da cellule con membrane danneggiate, i valori di assorbanza misurati riflettono l'entità del danno alla membrana indotto dai composti nel tempo.
8. Analisi citofluorimetrica dell'apoptosi
L'induzione dell'apoptosi è stata valutata mediante citometria a flusso utilizzando l'annessina V e la colorazione con 7-amminoattinomicina D (7-AAD). Dopo il trattamento con i composti in esame, le cellule H1299 sono state raccolte mediante centrifugazione, lavate con soluzione salina tamponata con fosfato freddo e risospese in tampone legante. Le cellule sono state quindi incubate con annessina V coniugata a un colorante fluorescente e 7-AAD secondo il protocollo di colorazione. I campioni sono stati immediatamente analizzati mediante citometria a flusso. Questo metodo ha permesso la differenziazione tra cellule vitali (non colorate), cellule apoptotiche precoci (annessina V positiva, 7-AAD negativo) e cellule apoptotiche o necrotiche tardive (positive per entrambe le colorazioni).
9. Quantificazione intracellulare dei ROS
I livelli intracellulari di specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono stati misurati utilizzando un test basato sulla fluorescenza. Le cellule H1299 sono state seminate in piastre a 12 pozzetti a una densità di 1 × 105 cellule per pozzetto e coltivate fino a raggiungere circa l'80% di confluenza. Le cellule sono state quindi trattate con i composti designati per 72 ore. Dopo il trattamento, le cellule sono state incubate con 1 μM della sonda fluorescente 2',7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA) sensibile ai ROS a 37 °C per 30 minuti al buio. Dopo l'incubazione, le cellule sono state raccolte e l'intensità della fluorescenza è stata misurata a una lunghezza d'onda di emissione di 525 nm utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza. L'intensità della fluorescenza corrisponde ai livelli intracellulari di ROS.
10. PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)
Le cellule H1299 sono state seminate in piastre a 6 pozzetti a una densità di 2 × 105 cellule per pozzetto e coltivate fino a raggiungere circa l'80% di confluenza. Le cellule sono state quindi trattate con i composti designati per 72 ore. L'RNA totale è stato estratto utilizzando un metodo fenolo-cloroformio ampiamente utilizzato. La sintesi del DNA complementare (cDNA) è stata eseguita utilizzando un kit di trascrizione inversa secondo le istruzioni del produttore. La PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) è stata condotta utilizzando un sistema di PCR in tempo reale con primer specifici (elencati nella Tabella 2). I livelli relativi di espressione genica sono stati calcolati utilizzando il metodo Ct comparativo, con i geni di housekeeping utilizzati come controlli interni.
11. Immunoblotting per l'espressione proteica
L'analisi del western blot è stata condotta su cellule H1299 coltivate e trattate. La proteina totale è stata estratta utilizzando un tampone di lisi appropriato e i lisati sono stati chiarificati mediante centrifugazione a 10.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Le concentrazioni proteiche sono state determinate utilizzando un saggio spettrofotometrico. Quantità uguali di proteine da ciascun campione sono state separate mediante SDS-PAGE e trasferite su una membrana di difluoruro di polivinilidene (PVDF). Le membrane sono state bloccate con latte in polvere scremato al 5% per 2 ore a temperatura ambiente e poi incubate per una notte a 4 °C con anticorpi primari specifici per Bcl-2, caspasi-3, PARP1, BAX, GAPDH e tubulina a diluizioni ottimizzate. Dopo il lavaggio, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari appropriati per 2 ore a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate e visualizzate utilizzando un substrato chemiluminescente. L'analisi densitometrica è stata eseguita con un software di analisi delle immagini e le intensità di banda sono state normalizzate a GAPDH e Tubulina come controlli di carico.
12. Microscopia a immunofluorescenza della Caspasi-3
L'espressione e la localizzazione subcellulare della caspasi-3, una proteina apoptotica chiave, sono state valutate mediante colorazione in immunofluorescenza. Dopo il trattamento, le cellule H1299 sono state fissate con paraformaldeide, permeabilizzate con una soluzione detergente delicata e incubate con un anticorpo primario contro la caspasi-3. È stato quindi applicato un anticorpo secondario marcato in fluorescenza per rilevare il segnale dell'anticorpo primario. I nuclei cellulari sono stati controcolorati utilizzando un colorante fluorescente legante il DNA. Le cellule colorate sono state visualizzate al microscopio a fluorescenza. L'intensità e la distribuzione cellulare del segnale di fluorescenza hanno fornito informazioni qualitative e spaziali sull'attivazione della caspasi-3, supportando il suo coinvolgimento nella risposta apoptotica indotta dal composto.
13. Sequenziamento trascrittomico
Per profilare la risposta trascrizionale cellulare ai composti in esame, l'RNA totale è stato estratto dalle cellule H1299 trattate e ne è stata valutata l'integrità utilizzando metodi standard di controllo della qualità. Le librerie di sequenziamento sono state preparate seguendo protocolli stabiliti e sottoposte a sequenziamento ad alto rendimento utilizzando una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione. I dati grezzi di sequenziamento sono stati elaborati attraverso una pipeline bioinformatica convenzionale, che includeva il filtraggio del controllo di qualità, l'allineamento al genoma di riferimento e la quantificazione dell'abbondanza dei trascritti. L'analisi dell'espressione genica differenziale è stata condotta per identificare i geni con cambiamenti statisticamente significativi nell'espressione dopo il trattamento. Sono state eseguite analisi di arricchimento e di percorso dei geni differenzialmente espressi per chiarire i processi biologici chiave influenzati dai composti, fornendo così una panoramica trascrittomica completa dei loro effetti molecolari.
14. Analisi statistica
Tutti i dati sono espressi come media ± deviazione standard (SD) di almeno tre esperimenti indipendenti. La significatività statistica tra i gruppi è stata determinata utilizzando metodi standard, tra cui il t-test di Student o l'ANOVA a una via, ove appropriato. Le differenze sono state considerate statisticamente significative per valori P inferiori a 0,05.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Screening dei componenti chiave di Pileostegia tomentella contro il cancro del polmone
Una panoramica del disegno sperimentale è presentata nella Figura 1. HPLC-LTQ/Orbitrap MS è stato impiegato per caratterizzare sette principali costituenti bioattivi presenti in Pileostegia tomentella (Tabella 3). Successivamente, è stata condotta una predizione del bersaglio in silico su questi composti utilizzando il...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) rimane un problema sanitario globale pressante, caratterizzato da una biologia aggressiva, una rapida progressione clinica e un elevato potenziale metastatico, che spesso si traduce in esiti scadenti per i pazienti12. Sebbene gli interventi standard, come la resezione chirurgica, la radioterapia e la chemioterapia, offrano benefici terapeutici nella fase iniziale della malattia, la loro efficacia diminuisce negl...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto di costruzione di discipline chiave di alto livello della medicina tradizionale cinese - farmacia delle minoranze etniche (farmacia Zhuang) dell'amministrazione statale della medicina tradizionale cinese (n. zyyzdxk-2023165); il Programma di Coltivazione dei Talenti "Progetto Giovanile" del Guangxi International Zhuang Medical Hospital (n. 2022001); il Progetto del Team Multidisciplinare di Innovazione Crociata in Medicina Cinese del Guangxi (n. GZKJ2309); il programma di team di innovazione per la coltivazione di talenti di alto livello dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese del Guangxi (n. 2022A008); il progetto chiave di ricerca e sviluppo del Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Guangxi (n. Gui Ke AB21196057); il piano d'azione triennale 2023 per la costruzione di team di talenti di alto livello dell'ospedale medico internazionale di Guangxi Zhuang (n. GZCX20231203, GZCX20231202); il terzo lotto del programma di coltivazione di team di talenti di alto livello "Qihuang Project" dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese del Guangxi (n. 202414).
CONTRIBUTO DELL'AUTORE:
Wen Zhong, Leimin Jiang e Bing Qing hanno contribuito in egual misura a questo lavoro e ne condividono la prima paternità. Erano i principali responsabili della progettazione sperimentale, dell'acquisizione dei dati e dell'interpretazione dei risultati. Xiumei Ma ha condotto l'analisi dei dati e ha contribuito alla preparazione del manoscritto. Shi Xianyi, Deng Qingmei e Zhou Guangyun hanno partecipato alla progettazione dello studio, alla raccolta dei dati e alla ricerca della letteratura. Jiangcun Wei, l'autore corrispondente, ha supervisionato l'analisi e l'interpretazione dei dati e ha svolto un ruolo di primo piano nella stesura e nella revisione del manoscritto.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Annessione V Kit di rilevamento dell'apoptosi PE / 7-AAD | BD Bioscienze | 556547 | Rilevamento dell'apoptosi basato sulla citometria a flusso |
| Anticorpo: BAX | Abcam | ab32503 | Western blot per la proteina pro-apoptotica |
| Anticorpo: Bcl-2 | Abcam | ab182858 | Western blot/immunofluorescenza |
| Anticorpo: Caspasi-3 scissa | Abcam | ab32042 | Western blot / IF |
| Anticorpo: GAPDH | Abcam | ab8245 | Controllo interno nel Western blot |
| Anticorpo: PARP1 | Abcam | ab32064 | Western blot per marcatore di apoptosi |
| Anticorpo: Tubulina | Abcam | ab78078 | Controllo interno nel Western blot |
| ChemDraw | PerkinElmer Informatica | CCG821391 | Disegno strutturale di piccole molecole |
| Sistema di imaging a chemiluminescenza | Tanon Scienza & Tecnologia | Tanon 5200 | Per visualizzare le bande proteiche |
| Cytoscape | Cytoscape.org | https://cytoscape.org | Costruzione e analisi della rete |
| Colorazione nucleare DAPI | Sigma | D9542 | Controcolorante nucleare blu per IF |
| DAVIDE | NIH | https://david.ncifcrf.gov | Annotazione funzionale e arricchimento del percorso KEGG |
| DMSO | Sigma | MFCD00002089 | Utilizzato per sciogliere i cristalli di formazan |
| Etanolo (per l'estrazione) | Sigma | MFCD00003568 | Solvente per estrazione assistito da ultrasuoni |
| Acetato di etile | Sigma | MFCD00009171 | Utilizzato per il frazionamento bioattivo |
| Anticorpo secondario coniugato con FITC | Abcam | AB6785 | Utilizzato in immunofluorescenza |
| Citometro a flusso | Termo Scientifico | Codice: A29001 | Utilizzato per l'apoptosi e il rilevamento di ROS |
| Microscopio a fluorescenza | Società Olimpo | BX53F | Per l'imaging di vetrini in immunofluorescenza |
| Liofilizzatore | Labconco Corporation | 7670520 | Per la liofilizzazione e la conservazione dei campioni |
| Schede GeneGene | Istituto Weizmann | https://www.genecards.org | Banca dati genetica per la rilevanza della malattia |
| Spettrometria di massa HPLC-LTQ-Orbitrap | Termo Scientifico | IQLAAEGAAVFACZMAIK | Identificazione dei composti mediante MS |
| Piattaforma di sequenziamento Illumina NovaSeq | Illumina Inc. | 20012850 | Utilizzato per RNA-seq |
| Kit per il test di citotossicità LDH | Beyotime | Visualizzazione del materiale C0016 | Per misurare il rilascio di LDH come indicatore di citotossicità |
| Lettore di micropiastre | Termo Scientifico | VL0000D0 | Per misure di assorbanza in saggi MTT e LDH |
| Kit per il test di vitalità cellulare MTT | Beyotime | C0009S | Utilizzato per il test MTT per valutare la vitalità cellulare |
| Macchina qPCR | Termo Scientifico | 4485701 | Per l'analisi dell'espressione genica |
| R software | Fondazione R | https://www.r-project.org | Calcolo statistico e tracciamento dei percorsi |
| Kit di trascrizione inversa (RT Kit) | Vazyme | Visualizzazione MR201 | Per la sintesi del cDNA |
| Kit di preparazione della libreria RNA-seq | Illumina Inc. | 20020594 | Preparazione della libreria per il sequenziamento |
| SwissTargetPrediction | Istituto Svizzero | http://www.swisstargetprediction.ch | Strumento di previsione del bersaglio composto |
| Miscela qPCR verde SYBR | Vazyme | Domanda 311-02 | Per la PCR quantitativa |
| Reagente TRIzol (estrazione con RNA) | Sigma | T3934 | Per l'estrazione dell'RNA totale |
| Ultrasuoni | Branson | Codice: M1800-CPXH | Per l'estrazione assistita da ultrasuoni |
| Apparecchio Western Blot | Termo Scientifico | Codice A56727 | Elettroforesi su gel e trasferimento di proteine |
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.