Studio sperimentale su Muscone che riduce l'attività della via NF-κB prendendo di mira IL-1R1 per attenuare il danno da stress ossidativo nelle cellule di Schwann

Sommario

Questo articolo studia l'effetto del muscone, il componente principale del muschio, sulla proliferazione e l'apoptosi delle cellule di Schwann. I risultati illustrano preliminarmente il potenziale meccanismo del muschio che riduce l'attività della via NF-κB inibendo IL-1R1 per attenuare il danno da stress ossidativo nella paralisi di Bell.

Abstract

Il meccanismo alla base del modo in cui il muschio naturale tratta la paralisi di Bell non è chiaro. Questo studio mira a rivelare il potenziale meccanismo del muschio nel trattamento della lesione dei nervi periferici in vitro. Per raggiungere questo obiettivo, è stato stabilito un modello di danno da stress ossidativo in cellule di Schwann (SC) utilizzando cloruro di cobalto (CoCl₂). Per valutare gli effetti protettivi di Muscone (Mus) su questa lesione ed esplorarne il meccanismo, sono stati impiegati saggi di vitalità cellulare, trasfezione di siRNA, saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR), western blotting, colorazione in immunofluorescenza e analisi ultrastrutturale delle cellule. Di conseguenza, è indicato che l'intervento di Mus ha aumentato la proliferazione delle SC e l'mRNA di S-100b in ipossia, riducendo anche le specie reattive dell'ossigeno (ROS) e aumentando i livelli di superossido dismutasi (SOD). Mus ha migliorato lo stress ossidativo e l'infiammazione nelle SC ipossiche riducendo IL-1β e TNF-α. Inoltre, Mus ha modulato indicatori chiave coinvolti nel metabolismo dell'ossigeno, nella riparazione cellulare e nel neurometabolismo, tra cui C-JUN e GDNF. IL-1R1, localizzata nella membrana SC, è stata sovraregolata dall'ipossia ma significativamente sottoregolata dopo l'intervento di Mus. Mus ha anche inibito l'espressione dei componenti della via NF-κB (IRAK1, IKK, p65, p50) e ha aumentato l'IκB-α. In modo critico, l'abolizione dell'espressione di IL-1R1 tramite knockdown di siRNA ha mostrato un effetto coerente con Mus. Si è concluso che sopprimendo IL-1R1, Mus attenua l'infiammazione nelle SC ipossiche attraverso l'inibizione della via NF-κB. Questo studio ha indicato il ruolo di IL-1R1 nella disfunzione SC indotta dall'ipossia. Inoltre, il Mus potrebbe essere un medicinale potenzialmente efficace per il trattamento della paralisi di Bell.

Introduzione

Il muscone (Mus), 3-metilciclopentadecanone, è stato isolato dall'estratto naturale di muschio di cervo già nel 1906¹. Il muschio, una medicina tradizionale cinese (MTC) preziosa ed efficace, ha ampi effetti curativi come la detumescenza, l'antinfiammatorio, la rianimazione e la promozione della circolazione sanguigna². La MTC contenente muschio è stata utilizzata per una varietà di malattie comuni, tra cui la malattia del sistema nervoso centrale³, la disintossicazione⁴, i tumori gastrointestinali⁵, l'epatite virale⁶ e la malattia coronarica⁷, ecc. Come ingrediente farmaceutico attivo del muschio, il mus ha mostrato eccellenti effetti biologici che coinvolgono l'antinfiammatorio⁸, l'antiossidante ^8,9, la riparazione del danno neuronale e l'alleviamento dell'infarto del miocardio¹⁰, ecc. Meccanicisticamente, gli studi hanno dimostrato che Mus può ridurre il rilascio di citochine infiammatorie come l'interleuchina (IL)-1β, IL-6, il fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, le specie reattive dell'ossigeno (ROS)^1,8 e regolare la proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK), il fattore nucleare kappa-light-chain-enhancer delle cellule B attivate (NF-κB), AKT/bersaglio meccanicistico della rapamicina (mTOR) e^{la via 1} CaN/Erk1/2^{, 8,11}, ecc.

In Cina, è stato riportato che alcuni medici hanno trattato con successo la paralisi di Bell con muschio naturale secondo precedenti registrazioni di letteratura ed esperienza clinica 12,13,14,15. La Mus non è un farmaco raccomandato nelle linee guida per la diagnosi e il trattamento, ma in aree mediche sottosviluppate o per alcune persone che non possono usare steroidi o farmaci antivirali, la Mus può essere un'altra opzione preferita. L'analisi della letteratura negli ultimi anni mostra anche che il muschio è la medicina cinese più frequentemente utilizzata nelle prescrizioni di cerotti di medicina cinese pubblicate e negli studi sui punti di agopuntura per il trattamento della paralisi facciale periferica¹⁶. Sebbene ci siano molti studi farmacologici e medici sul Mus, non si sa ancora come il muschio abbia curato esattamente la paralisi di Bell e quali siano i meccanismi biologici neurochimici e cellulari sottostanti.

La paralisi di Bell, una paralisi facciale idiopatica acuta, deriva da una disfunzione del nervo facciale periferico, che innerva tutti i muscoli facciali. Il segno più evidente dei sintomi della paralisi di Bell è la debolezza e l'abbassamento dei muscoli facciali su un lato. Sebbene la paralisi facciale di Bell non sia pericolosa per la vita, può influire sulla qualità della vita del paziente e persino causare ansia e depressione. Ciò che è particolarmente preoccupante è che fino al 30% dei pazienti soffre di sequele a lungo termine, tra cui sincinesi, contrattura, paresi facciale permanente e asimmetria facciale, anche con un trattamento appropriato. Pertanto, trovare la risoluzione della paralisi di Bell e diminuire il rischio di paralisi sono i nostri obiettivi principali. Le attuali conoscenze sul meccanismo patogenetico della paralisi di Bell rimangono poco chiare. Recenti ricerche hanno dimostrato che la riattivazione dei virus può essere la causa principale della paralisi di Bell e questi virus possono causare un edema neuronale e un'infiammazione per innescare l'attacco della paralisi di Bell.

Sulla base di prove recenti, abbiamo ipotizzato che Mus allevi i sintomi della paralisi di Bell migliorando il danno da stress ossidativo al nervo facciale. Questo studio ha indicato sperimentalmente gli effetti terapeutici di Mus, rivelando che l'IL-1R1 sovraregolata nelle SC attiva la via NF-κB, causando danni cellulari. Fondamentalmente, abbiamo dimostrato che Mus inibisce la segnalazione di NF-κB sottoregolando IL-1R1. I nostri risultati hanno identificato il ruolo dell'upregolazione di IL-1R1 nelle SC esposte a stress ossidativo in vitro e hanno posizionato la somministrazione di Mus come una nuova strategia terapeutica.

Protocollo

Questa ricerca sperimentale è stata condotta con l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (Numero di approvazione: LL-240077).

Coltura cellulare e intervento farmacologico
Le cellule di Schwann di ratto (SC) sono state coltivate nel terreno cellulare di Schwann, costituito da terreno basale, 5% siero bovino fetale, 1% integratore per la crescita delle cellule di Schwann, 1% penicillina e 1% streptomicina. Tutte le celle sono state mantenute in un'atmosfera di CO₂ al 5% a 37 °C. Quando è stato lasciato crescere fino a una densità del 70-80%, gli SC sono stati divisi in quattro gruppi (n = 5 per gruppo): (1) gruppo NC; (2) gruppo NC+CoCl₂ ; (3) Gruppo NC+CoCl₂+Mus; (4) Gruppo NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus.

Il cloruro di cobalto (CoCl₂), un agente frequentemente impiegato per imitare l'ipossia, è noto per innescare risposte simili a quelle dell'ipossia, come l'impedimento della degradazione e della stabilizzazione dei fattori inducibili dall'ipossia e l'accumulo della proteina HIF-1α¹⁵. Secondo il metodo modificato basato su Osuru et ^al.17, nel gruppo NC+CoCl₂ e nel gruppo NC+CoCl₂+Mus, le SC sono state coltivate in terreno cellulare di Schwann integrato con 240 μM di CoCl₂ per 8 ore, in condizioni atmosferiche del 95% di aria e del 5% di CO₂ a 37 °C in un incubatore umidificato (21% O₂). Quindi, nei gruppi Mus, è stato applicato l'intervento di 1,25 μg/mL Mus per ulteriori 24 ore. Nel frattempo, nel gruppo NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus, le SC sono state prima trattate con 24 ore di infezione da siRNA, quindi coltivate continuamente con 240 μM di CoCl₂ per 8 ore, seguite dall'intervento di 1,25 μg/mL Mus per ulteriori 24 ore, come nei primi gruppi. Il diagramma di flusso del processo sperimentale è mostrato in Figura 1.

Saggio di vitalità cellulare
La vitalità delle SC è stata determinata utilizzando il reagente per il test di conteggio delle cellule (CCK-8) secondo le istruzioni del produttore. Le SC coltivate a una densità di 5 × 10⁵ cellule/pozzetto sono state seminate in una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti con 100 μL di terreno di crescita completo a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO₂ . Quando la confluenza ha raggiunto il 70-80%, sono stati aggiunti 10 μL di soluzione CCK-8 a ciascun pozzetto e le piastre sono state incubate per 1 ora a 37 °C. La densità ottica (OD) delle piastre a 96 pozzetti è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre ed è stata calcolata la vitalità cellulare. Le cellule sono state divise in quattro gruppi: gruppo NC, gruppo NC+CoCl₂ , gruppo NC+CoCl₂+Mus e gruppo NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus. I risultati sperimentali sono stati corretti utilizzando un pozzetto in bianco (soluzione medium+CCK8). Tasso di sopravvivenza cellulare = [(gruppo sperimentale - pozzetto bianco)/(gruppo NC - pozzetto bianco)] × 100%.

Trasfezione di siRNA
La trasfezione è stata condotta secondo le istruzioni del produttore di un reagente di trasfezione commerciale in vitro siRNA/miRNA utilizzando duplex sintetici di siRNA di siIL-1R1 (AUAGUCUUGGAUUUUCUCCAA, GGAGAAAAUCCAAGACUAUGA) con una concentrazione di 100 ng/μL per 24 ore. Dopo la trasfezione di siIL-1R1, le espressioni di siIL-1R1 sono state valutate eseguendo l'analisi RT-qPCR dopo 24 ore di trasfezione¹⁸ e l'efficienza deve essere garantita per essere superiore all'80%

Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)
I surnatanti post-coltura sono stati raccolti e centrifugati in condizioni specifiche del gruppo (2950 g, 20 min, 25 °C). I livelli extracellulari di IL-1β, TNF-α, ROS e SOD sono stati dosati tramite ELISA seguendo le istruzioni del kit. Le letture finali dell'assorbanza a 450 nm sono state ottenute utilizzando un lettore di micropiastre.

Isolamento dell'RNA e PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)
Seguendo le istruzioni del produttore, l'RNA totale è stato estratto dalle cellule in coltura utilizzando il reagente TRizol. I geni bersaglio (IL-1β, TNF-α, S-100b, IL-1R1) sono stati amplificati in 20 μL di reazioni di miscelazione SYBR qPCR per 40 cicli su uno strumento PCR. Normalizzazione dei dati utilizzata β-actina, con specificità PCR verificata mediante analisi della curva di fusione. Il metodo 2^−ΔΔCt ha quantificato l'espressione relativa da cinque campioni indipendenti analizzati in triplicato. I primer sono elencati nella Tabella 1.

Western blot
Dopo il trattamento, le SC di tutti i gruppi sperimentali sono state incubate per 24 ore e raccolte. Le proteine totali sono state estratte utilizzando un kit di estrazione delle proteine totali. I lisati proteici sono stati combinati con un tampone di caricamento per elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecil-solfato di sodio (SDS-PAGE) denaturato a 98 °C per 5 minuti e separato (20 μg per corsia) su gel di poliacrilammide SDS al 10-12%. Le proteine risolte sono state trasferite elettroforeticamente alle membrane del fluoruro di polivinilidene (PVDF). Le membrane sono state bloccate con latte in polvere scremato al 5% per 60 minuti a temperatura ambiente, quindi incubate per una notte a 4 °C in un volume di 6 mL con i seguenti anticorpi primari: anticorpo anti-HIF-1α (1:1000), anticorpo anti-GAPDH (1:1000), anticorpo anti-IL-1R1 (1:1000), anticorpo anti-C-JUN (1:1000), anticorpo anti-GDNF (1:1000), anticorpo anti-IRAK1 (1:1000), anticorpo anti-IKK (1:1000), anticorpo anti-p65 (1:800), anticorpo anti-p50 (1:900), anticorpo anti-IκB-α (1:900) e anticorpo anti-β-actina (1:1000). Dopo il lavaggio, le membrane sono state sondate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) per 60 minuti a 25 °C. I segnali proteici sono stati rilevati utilizzando Image Studio Digits Ver 4.0. Le intensità di banda sono state quantificate con il software ImageJ e normalizzate all'espressione di β-actina e GAPDH. Sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti.

Immunofluorescenza
La localizzazione di IL-1R1 nelle SC è stata valutata seguendo Zhao et ^al.19. Raccogliere le cellule durante la fase di crescita logaritmica mediante tripsinizzazione, risospenderle in un terreno completo fresco e triturare accuratamente per ottenere una sospensione uniforme di una singola cellula. Seminare le cellule su piastre di coltura contenenti vetrini di copertura sterili. Una volta che le cellule hanno raggiunto la completa confluenza, sciacquarle 1-2 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), rimuovere con cura i vetrini coprienti e fissare le cellule aderenti con paraformaldeide al 4% in PBS per 10 minuti, permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,05% (10 minuti) e bloccare con siero di capra al 5% (1 ora). L'incubazione primaria ha utilizzato un mAb di coniglio anti-ratto IL-1R1. Dopo i lavaggi PBS, i campioni sono stati incubati con IgG di capra anti-coniglio coniugata con FITC per 2 ore a temperatura ambiente. Aggiungere agenti di montaggio idrosolubili al vetrino coprioggetti per il montaggio. Le cellule immunomarcate sono state visualizzate e quantificate utilizzando un microscopio a fluorescenza con lunghezza d'onda di eccitazione 492 nm e lunghezza d'onda di emissione 520 nm.

Analisi delle ultrastrutture
Seguendo il protocollo¹⁹ di Zhao et al., le SC sono state fissate in glutaraldeide al 2,5% e post-fissate per una notte a 4°C in tetrossido di osmio all'1%. I campioni sono stati sottoposti a una serie di disidratazione con etanolo/acetone. Le sezioni ultrasottili (80 nm) sono state colorate con acetato di uranile e citrato di piombo prima dell'esame ultrastrutturale utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione.

Smaltimento di reagenti chimici pericolosi
Il terreno e le soluzioni contenenti CoCl₂ vengono raccolti in un apposito contenitore per rifiuti di metalli pesanti. Tutti i materiali monouso che sono entrati in contatto con i suddetti liquidi, inclusi puntali per pipette, provette da centrifuga e guanti, sono classificati come rifiuti pericolosi di metalli pesanti e vengono trasferiti a una società di gestione dei rifiuti pericolosi autorizzata e approvata dalle autorità competenti per il corretto smaltimento. Gettare la soluzione di paraformaldeide di scarto in un contenitore di scarto di aldeidi dedicato. I materiali di consumo usati devono essere raccolti come rifiuti aldeidici e trattati dalla stessa società di gestione dei rifiuti pericolosi autorizzata.

Analisi statistica
I confronti multi-gruppo sono stati analizzati mediante ANOVA unidirezionale con il test post-hoc di Tukey in GraphPad Prism 8.0. La significatività statistica è stata definita come P < 0,05. I dati sono presentati come media ±± deviazione standard (SD).

Risultati

Effetti protettivi del Mus sul danno da stress ossidativo delle cellule di Schwann in vitro
L'espressione di HIF-1α ha mostrato cambiamenti in risposta a variazioni in circostanze ipossiche²⁰. Per modellare l'ipossia, le SC sono state esposte a CoCl₂, che ha indotto con successo l'ipossia, come confermato da elevati livelli di proteina HIF-1α, un marcatore canonico di ipossia, tramite western blotting (Figura 2A...

Discussione

La paralisi di Bell è una paralisi idiopatica del nervo facciale periferico caratterizzata da debolezza facciale unilaterale. La guaina mielinica svolge varie funzioni cruciali nell'efficace funzionamento dei neuroni²³. Assicura la conduzione regolare degli impulsi nervosi, supporta i neuroni fornendo fattori nutritivi e aiuta nel processo di rigenerazione²⁴ . Pertanto, la perdita di mielina nel sistema nervoso periferico può provocare neur...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di digestione di tripsina allo 0,25% (senza EDTA)	Servicebio	G4002
10x TBS	Eubiotech	BF0153
10-180 KDPmarcatore di proteine colorate colorate	Eubiotech	P0069
5% latte scremato in polvere	Beyotime Biotechnology, Cina	P0216-300g
anticorpo anti-C-JUN	Segnalazione cellulare, USA	#9165T
anticorpo anti-GAPDH	abcam, Regno Unito	ab245355
anticorpo anti-GDNF	Segnalazione cellulare, USA	#47808
anti-HIF-1&alfa; anticorpo	Segnalazione cellulare, USA	#14179
anticorpo anti-IKK	Segnalazione cellulare, USA	#2682
anticorpo anti-IL-1R1	Segnalazione cellulare, USA	#6775	per WB
anticorpo anti-IL-1R1	ProteinTech	84094-6-RR	per immunofluorescenza
anticorpo anti-IRAK1	Segnalazione cellulare, USA	#4395
anti-Iκ B-&alfa; anticorpo	Segnalazione cellulare, USA	#8943
Anticorpo anti-P50	abcam, Regno Unito	ab305263
Anticorpo anti-P65	abcam, Regno Unito	ab16502
anti-ratto IL-1R1 mAb	Beyotime Biotechnology, Cina	AF7212
anticorpo anti-beta;-actina	abcam	ab179467
Kit di quantificazione delle proteine BCA	Eubiotech	WB2123
Reagente per il saggio del kit per il conteggio delle cellule-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, Cina	C0048M
Cloruro di cobalto (CoCl2)	Macklin, Cina	C804815
Stella EuECL	Eubiotech	WB2131
Siero fetale bovino (FBS)	Bergolin, Cina	PWL001
IgG anti-coniglio di capra marcato Fitc	Servicebio	GB22303
Microscopio a fluorescenza	Nikon
Reagente di trasfezione siRNA/miRNA in vitro Hieff Trans	YEASEN, Cina	Numero 40806ES01
Anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) IgG anti-topo di capra marcata con Hrp	Servicebio, Cina	GB23301
Kit ELISA IL-1β, TNF-α, ROS e SOD	BOSTER, Cina	BES1762K, BES0481K, BES5018K, BES2920K
Muscone (Mus)	Aladino, Cina	M141496
Tampone PBS	Servicebio	G4202
Soluzione di penicillina-streptomicina, 100x	Procella	PB180120
Membrane in fluoruro di polivinilidene (PVDF)	Millipore, Stati Uniti	IPFL00010
Cellule di Schwann di ratto (SC)	Procell Scienze della Vita & Tecnologia Cina	CM-M111
Tampone di lisi RIPA	Eubiotech	WB2116
Terreno cellulare di Schwann	ScienCell, Stati Uniti	1701
Buffer di caricamento SDS-PAGE	Beyotime Biotechnology, Cina	P0015
SDS-PAGE Tampone di caricamento delle proteine l, 5x	Eubiotech	Visualizzazione del materiale WB2122
si-IL-1R1	Gene universale	RX0114371
Sodio dodecil solfato poliacrilammide gelelettroforesi (SDS-PAGE) Kit di preparazione	Eubiotech	WB2118
Miscela SYBR qPCR	Beyotime Biotechnology, Cina	D7260
Kit per l'estrazione totale delle proteine	Beyotime Biotechnology, Cina	PP123-01
Microscopio elettronico a trasmissione	Hitachi	HT7800
Trizol	Beyotime Biotechnology, Cina	R0011
Interpolazione-20	Eubiotech	WB2114
Agenti di montaggio solubili in acqua	Absin, Cina	in ABS9240
Buffer di trasferimento occidentale	Eubiotech	Visualizzazione del materiale WB2129