Articolo metodologico

Visualizzare il guardiano: la valutazione di Evan basata sul colorante blu della permeabilità della barriera emato-encefalica nel pesce zebra adulto

DOI:

10.3791/69010

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30 settembre 2025

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1Department of Basic Medical Sciences, Kulliyyah of Medicine, International Islamic University Malaysia (IIUM), 2Department of Biotechnology, Kulliyyah of Science, International Islamic University Malaysia (IIUM), 3Department of Physiology, Faculty of Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia, 4Clinical Pharmacology Department, Menoufia Medical School, Menoufia University

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo presenta un metodo affidabile per valutare l'integrità della barriera emato-encefalica (BBB) nel modello adulto di pesce zebra (Danio rerio) utilizzando la valutazione basata sul colorante blu di Evan, consentendo un'analisi sia qualitativa che quantitativa dell'interruzione neurovascolare.

Abstract

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La barriera emato-encefalica (BBB) è un'interfaccia semipermeabile che mantiene l'omeostasi del sistema nervoso centrale (SNC) regolando il movimento delle sostanze dentro e fuori dal cervello, proteggendo così il tessuto neurale da agenti potenzialmente dannosi. L'interruzione della BBB è una caratteristica ben consolidata in molte malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD) e il morbo di Alzheimer (AD), dove l'aumento della permeabilità contribuisce ed esacerba la progressione della malattia. Sebbene il pesce zebra adulto (Danio rerio) sia sempre più riconosciuto come un modello prezioso per lo studio delle malattie neurodegenerative, i metodi standardizzati per valutare l'integrità della BBB in questa specie rimangono limitati. Questo protocollo descrive un approccio semplice, riproducibile ed economico per valutare la permeabilità della BBB nel pesce zebra adulto analizzando lo stravaso del colorante blu di Evan (EB) dal sistema neurovascolare nel tessuto cerebrale. Il metodo combina la visualizzazione qualitativa con l'analisi quantitativa delle immagini della distribuzione EB per rilevare l'interruzione della BBB. I passaggi chiave includono la corretta iniezione intraperitoneale del colorante EB, la conferma della circolazione sistemica del colorante, un'attenta dissezione cerebrale e la misurazione coerente dell'imaging e dell'intensità della scala di grigi. I controlli positivi e negativi sono incorporati per convalidare la penetrazione del colorante e supportare un'interpretazione accurata. I risultati rappresentativi dimostrano una maggiore stravaso di EB nel cervello di pesce zebra parkinsoniano rispetto ai controlli iniettati con soluzione salina, indicando un aumento della permeabilità della BBB. Questa tecnica richiede un'attrezzatura specializzata minima ed è adatta a laboratori con risorse limitate. Nel complesso, questo protocollo offre uno strumento pratico per studiare l'integrità della BBB in modelli adulti di zebrafish e può essere adattato per diverse applicazioni, tra cui studi sui meccanismi della malattia e la valutazione di interventi terapeutici mirati alla funzione neurovascolare.

Introduzione

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La barriera emato-encefalica (BEE) è un'interfaccia fisiologica selettiva e semi-permeabile formata principalmente da cellule endoteliali cerebrali specializzate, supportate da periciti e astrociti, che regola lo scambio molecolare tra il flusso sanguigno e lo spazio interstiziale del cervello per preservare il microambiente del sistema nervoso centrale (SNC). La sua integrità è essenziale per preservare l'omeostasi del SNC e proteggere il tessuto neurale da sostanze nocive o tossiche1. L'interruzione della BBB è una caratteristica patologica ben nota in varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Par....

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Protocollo

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Questo protocollo è stato seguito ed è stato autorizzato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Università Islamica Internazionale della Malesia (IIUM), con riferimento all'approvazione dell'etica animale (rif. n.: IIUM/504/14/2/IACUC).

1. Preparare la soluzione madre del colorante Evans Blue

  1. Sciogliere 0,1 g di colorante EB in 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x per preparare una soluzione madre all'1% (p/v). Mescolare accuratamente fino a quando il colorante non è completamente sciolto.
    ATTENZIONE: L'EB è classificato come cancerogeno di categoria 1B. ....

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Risultati

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Questo protocollo è stato testato su un modello di zebrafish parkinsoniano. La compromissione della BBB è un fenomeno ben documentato nei pazienti con PD 16,17,18 e in vari modelli animali parkinsoniani 19,20,21. Per studiare l'integrità della BBB nel modello parkinsoniano adulto di zebrafish, lo stravaso del colorante EB nei tessuti ce.......

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Discussione

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Valutare l'integrità della BBB è essenziale per comprendere la fisiopatologia delle malattie correlate al cervello, poiché una BBB compromessa può sia causare che peggiorare la progressione della malattia4. Sebbene il pesce zebra adulto sia emerso come un modello efficace per lo studio delle malattie neurodegenerative, i metodi per valutare l'integrità della BBB in questa specie rimangono poco sviluppati8. Il protocollo qui presentato forni.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata finanziata dal Ministero dell'Istruzione Superiore della Malesia (MoHE) nell'ambito del Fundamental Research Grant Scheme (FRGS), numero di sovvenzione FRGS19-125-0734. L'aiuto alla pubblicazione di questo studio è stato supportato dalla Facoltà di Medicina dell'Università Kebangsaan Malaysia (UKM).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agarosio in polvereVivantisPC0701
La tintura blu di EvanSigma-AldrichE2129
Figi ImageJIstituti Nazionali di Sanità, Stati UnitiLink per scaricare: https://imagej.net/software/fiji/downloads
Fotocamera per microscopioFornitore verificato - ShenZhen Hayear Electronics Co., Ltd.HY-500M
Paraformaldeide (PFA) in polvereSigma-Aldrich158127
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma-AldrichP4417
Cloruro di sodio (NaCl)Prodotti chimici HmbG7647-14-5
StereomicroscopioSocietà OlimpoSZ40
Unità filtro siringa, 0,45µ mMerck Millipore SLHV004SL

Riferimenti

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  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17, 1-24 (2020).
  2. Knox, E. G., Aburto, M. R., Clarke, G., Cryan, J. F., O'Driscoll, C. M. The blood-br....

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Colorante Blu di EvansModello di ZebrafishPermeabilit della BBBValutazione NeurovascolareDissezione del CervelloAnalisi delle Immagini con FijiZebrafish ParkinsonianiStravaso del ColoranteQuantificazione in Scala di Grigi

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