Articolo metodologico

Visualizzare il guardiano: la valutazione di Evan basata sul colorante blu della permeabilità della barriera emato-encefalica nel pesce zebra adulto

DOI:

10.3791/69010

⸱

30 settembre 2025

 ,  ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, Kulliyyah of Medicine, International Islamic University Malaysia (IIUM), 2Department of Biotechnology, Kulliyyah of Science, International Islamic University Malaysia (IIUM), 3Department of Physiology, Faculty of Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia, 4Clinical Pharmacology Department, Menoufia Medical School, Menoufia University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta un metodo affidabile per valutare l'integrità della barriera emato-encefalica (BBB) nel modello adulto di pesce zebra (Danio rerio) utilizzando la valutazione basata sul colorante blu di Evan, consentendo un'analisi sia qualitativa che quantitativa dell'interruzione neurovascolare.

Abstract

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La barriera emato-encefalica (BBB) è un'interfaccia semipermeabile che mantiene l'omeostasi del sistema nervoso centrale (SNC) regolando il movimento delle sostanze dentro e fuori dal cervello, proteggendo così il tessuto neurale da agenti potenzialmente dannosi. L'interruzione della BBB è una caratteristica ben consolidata in molte malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD) e il morbo di Alzheimer (AD), dove l'aumento della permeabilità contribuisce ed esacerba la progressione della malattia. Sebbene il pesce zebra adulto (Danio rerio) sia sempre più riconosciuto come un modello prezioso per lo studio delle malattie neurodegenerative, i metodi standardizzati per valutare l'integrità della BBB in questa specie rimangono limitati. Questo protocollo descrive un approccio semplice, riproducibile ed economico per valutare la permeabilità della BBB nel pesce zebra adulto analizzando lo stravaso del colorante blu di Evan (EB) dal sistema neurovascolare nel tessuto cerebrale. Il metodo combina la visualizzazione qualitativa con l'analisi quantitativa delle immagini della distribuzione EB per rilevare l'interruzione della BBB. I passaggi chiave includono la corretta iniezione intraperitoneale del colorante EB, la conferma della circolazione sistemica del colorante, un'attenta dissezione cerebrale e la misurazione coerente dell'imaging e dell'intensità della scala di grigi. I controlli positivi e negativi sono incorporati per convalidare la penetrazione del colorante e supportare un'interpretazione accurata. I risultati rappresentativi dimostrano una maggiore stravaso di EB nel cervello di pesce zebra parkinsoniano rispetto ai controlli iniettati con soluzione salina, indicando un aumento della permeabilità della BBB. Questa tecnica richiede un'attrezzatura specializzata minima ed è adatta a laboratori con risorse limitate. Nel complesso, questo protocollo offre uno strumento pratico per studiare l'integrità della BBB in modelli adulti di zebrafish e può essere adattato per diverse applicazioni, tra cui studi sui meccanismi della malattia e la valutazione di interventi terapeutici mirati alla funzione neurovascolare.

Introduzione

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La barriera emato-encefalica (BEE) è un'interfaccia fisiologica selettiva e semi-permeabile formata principalmente da cellule endoteliali cerebrali specializzate, supportate da periciti e astrociti, che regola lo scambio molecolare tra il flusso sanguigno e lo spazio interstiziale del cervello per preservare il microambiente del sistema nervoso centrale (SNC). La sua integrità è essenziale per preservare l'omeostasi del SNC e proteggere il tessuto neurale da sostanze nocive o tossiche1. L'interruzione della BBB è una caratteristica patologica ben nota in varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Alzheimer e la sclerosi laterale amiotrofica 2,3. La compromissione della funzione della BBB porta ad un aumento della permeabilità, consentendo ai composti neurotossici e ai mediatori infiammatori di infiltrarsi nel tessuto cerebrale, esacerbando così la progressione della malattia4. Pertanto, la valutazione dell'integrità della BBB è fondamentale per ottenere informazioni più approfondite sui meccanismi neurovascolari e infiammatori alla base di questi disturbi.

Mentre i roditori in vivo e i modelli in vitro rimangono gli standard di riferimento per la ricerca sulla BBB5, il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un prezioso modello di vertebrato nelle neuroscienze grazie alla sua trattabilità genetica, al rapporto costo-efficacia, alla facilità di manipolazione e alle caratteristiche neuroanatomiche e di BBB conservate con i mammiferi6. Nonostante il loro crescente utilizzo negli studi neurodegenerativi, i metodi per valutare l'integrità della BBB nel pesce zebra adulto sono ancora limitati 7,8. Tecniche come le iniezioni di traccianti fluorescenti o i reporter transgenici sono state ampiamente utilizzate nelle larve 9,10, ma pongono sfide significative negli adulti a causa della pigmentazione e della ridotta trasparenza. Pertanto, l'obiettivo del presente studio è quello di stabilire un protocollo semplice, riproducibile e visivamente dimostrabile per valutare la permeabilità della BBB nel pesce zebra adulto utilizzando lo stravaso del colorante blu (EB) di Evan. Questo metodo incorpora sia l'osservazione qualitativa che la misurazione quantitativa della perdita di colorante nel tessuto cerebrale, fornendo uno strumento pratico per valutare l'integrità neurovascolare in condizioni patologiche.

Il colorante Blue di Evan, che si lega all'albumina sierica e normalmente non può attraversare la BBB11 intatta, offre un'alternativa fattibile per valutare la rottura della barriera12. Lo stravaso di EB è stato ampiamente applicato nei modelli di roditori per rilevare la perdita di BBB in condizioni come lesioni cerebrali traumatiche, ictus e neuroinfiammazione13. Tuttavia, la sua applicazione nel pesce zebra adulto è rimasta in gran parte inesplorata. Questo studio presenta un nuovo adattamento della tecnica del colorante EB ottimizzato per il pesce zebra adulto, consentendo una valutazione qualitativa e quantitativa affidabile della permeabilità della BBB. Il metodo è economico, richiede un'attrezzatura specializzata minima e può essere facilmente scalato per più animali, offrendo un vantaggio pratico rispetto agli approcci più complessi basati sull'imaging tipicamente utilizzati nelle larve.

Utilizzando questo protocollo, abbiamo valutato l'integrità della BBB sia nel pesce zebra sano che in quello adulto parkinsoniano. Per indurre il parkinsonismo nel pesce zebra, la neurotossina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) è stata somministrata per via intraperitoneale, seguendo un metodo precedentemente descritto14. I risultati hanno rivelato uno stravaso di EB significativamente maggiore nel cervello del pesce zebra parkinsoniano, in linea con l'interruzione ben documentata della BBB osservata nel PD. Questi risultati convalidano la sensibilità e l'affidabilità del metodo, supportando la sua utilità nel collegare la patologia vascolare agli esiti molecolari e comportamentali. Questa tecnica rappresenta quindi uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano i contributi neurovascolari alle malattie neurodegenerative e può essere applicata sia in modelli genetici che indotti da tossine.

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Protocollo

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Questo protocollo è stato seguito ed è stato autorizzato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Università Islamica Internazionale della Malesia (IIUM), con riferimento all'approvazione dell'etica animale (rif. n.: IIUM/504/14/2/IACUC).

1. Preparare la soluzione madre del colorante Evans Blue

  1. Sciogliere 0,1 g di colorante EB in 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x per preparare una soluzione madre all'1% (p/v). Mescolare accuratamente fino a quando il colorante non è completamente sciolto.
    ATTENZIONE: L'EB è classificato come cancerogeno di categoria 1B. Evitare il contatto diretto con la pelle e gli occhi. Utilizzare indumenti protettivi, guanti, occhiali di sicurezza e un respiratore antipolvere. Evitare di inalare la polvere e seguire le istruzioni per l'uso del produttore. Non gettare il colorante Evans Blue (solido o in soluzione) nel lavandino. Conservare i rifiuti nei contenitori originali etichettati. Smaltire secondo le normative nazionali e locali sui rifiuti pericolosi.
  2. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,45 μm. Raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL. Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio e conservare a 4 °C.
    NOTA: È possibile utilizzare anche un filtro con pori di dimensioni inferiori (ad es. 0,2 μm). La soluzione madre può essere conservata a 4 °C per un massimo di due settimane o a -20 °C per un massimo di un mese, con l'aliquotazione consigliata per ridurre al minimo i ripetuti cicli di gelo-scongelamento quando conservata congelata.

2. Somministrare il colorante Evans Blue al pesce zebra adulto

  1. Anestetizzare il pesce zebra tramite shock ipotermico abbassando gradualmente la temperatura dell'acqua da 12 °C a 7 °C, fino a quando il pesce non risponde più agli stimoli tattili.
    NOTA: La riduzione graduale della temperatura può essere ottenuta aggiungendo piccole quantità di ghiaccio tritato all'acqua lentamente per diversi minuti, consentendo alla temperatura di diminuire progressivamente. L'immersione nella tricaina è anche un metodo anestetico alternativo adatto.
  2. Iniettare 20 μl di colorante EB all'1% nella cavità intraperitoneale (IP) utilizzando una siringa da insulina da 31 G. Applicare una leggera pressione nel sito di iniezione per 10 s per evitare il riflusso.
    NOTA: La cavità intraperitoneale del pesce zebra si trova posteriormente al cingolo pelvico. Per aumentare il tasso di successo della somministrazione di EB, digiunare il pesce per 24 ore prima dell'iniezione. Questo svuoterà la cavità addominale per fornire un migliore accesso e precisione allo spazio intraperitoneale.
  3. Trasferire il pesce in una vasca di recupero e lasciare che il recupero per 30 minuti. Monitorare la presenza di lesioni, mortalità o cambiamenti comportamentali.
    NOTA: Per aiutare il pesce zebra a riprendersi, utilizzare una temperatura dell'acqua leggermente ridotta (20-24 °C) per la vasca di recupero per fornire un lieve effetto anestetico e aiutare a intorpidire il potenziale disagio post-iniezione. Il pesce iniettato mostrerà una tonalità blu, che indica una corretta circolazione del colorante (Figura 1).
  4. Dopo 30 minuti, sopprimere il pesce tramite shock ipotermico a 1-3 °C. Quindi, decapita il pesce usando una lama sterile o forbici chirurgiche.
    NOTA: Per facilitare la dissezione cerebrale in seguito, lasciare della carne extra dietro la testa durante la decapitazione.
  5. Sciacquare la testina due volte in 1x PBS (rapporto pesce/PBS 1:20) per rimuovere il sangue in eccesso e il colorante EB.
    NOTA: Un lavaggio insufficiente può portare a risultati falsi positivi e compromettere l'accuratezza dell'analisi. Per evitare ciò, lavare accuratamente il tessuto cerebrale almeno due volte con 1x PBS, assicurandosi che tutto il sangue visibile e il colorante a flusso libero vengano rimossi. Se rimane qualche residuo di colorante, si consiglia vivamente un terzo lavaggio.
  6. Fissare la testa in paraformaldeide al 4% (PFA) a 4 °C per una notte (rapporto pesce/fissativo 1:20). Non è necessaria l'agitazione durante la fissazione, poiché le dimensioni ridotte della testa del pesce zebra e il volume di fissazione sufficiente consentono una penetrazione efficace in condizioni statiche.
    ATTENZIONE: Il PFA è dannoso se ingerito, inalato o a contatto con la pelle. Preparare la soluzione di PFA sotto una cappa aspirante. Utilizzare dispositivi di protezione individuale adeguati ed evitare l'inalazione di polvere. Seguire tutte le linee guida di sicurezza del produttore. Trattare i PFA come rifiuti pericolosi. Evitare di gettarlo nello scarico. Raccogliere ed etichettare i rifiuti in contenitori sigillati e smaltirli in conformità con le normative locali e nazionali.
  7. Sezionare il cervello del pesce zebra
    1. Posizionare la testa fissa in una capsula di Petri pulita e sezionare il cervello come descritto in precedenza15, utilizzando una pinzetta a punta. Aggiungere continuamente 1x PBS goccia a goccia durante la dissezione per mantenere il tessuto idratato e prevenire l'essiccazione.
    2. Preparare la piastra di agarosio sciogliendo 1 g di agarosio in 100 ml di acqua distillata. Cuocetelo nel microonde fino a completo scioglimento, versatelo in una capsula di Petri e lasciatelo solidificare.
    3. Sciacquare il cervello sezionato due volte in due bagni PBS separati. Quindi, posizionare il tessuto su una piastra di agarosio all'1% per trattenere l'umidità e prevenire il restringimento.
      NOTA: Un lavaggio insufficiente può portare a risultati falsi positivi e compromettere l'accuratezza dell'analisi. Per evitare ciò, lavare accuratamente il tessuto cerebrale almeno due volte con 1× PBS, assicurandosi che tutto il sangue visibile e il colorante a flusso libero vengano rimossi. Se rimane qualche residuo di colorante, si consiglia vivamente un terzo lavaggio.

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Figura 1: Confronto della colorazione della pelle tra un pesce zebra normale e uno iniettato con EB. (A) Pesce zebra normale che mostra un tipico tono della pelle brunastro. (B) Zebrafish iniettato con EB che mostra una notevole tonalità bluastra, che indica una corretta circolazione sistemica del colorante. Barra della scala = 1 cm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Stabilire un controllo positivo tramite la ferita da taglio (SWI)

NOTA: La ferita da taglio rompe la BBB e consente lo stravaso di EB nel sito della lesione.

  1. Anestetizzare il pesce con il metodo dello shock ipotermico (vedi passaggio 2.1). Una volta anestetizzato, iniettare 20 μl di colorante EB all'1% e lasciare che il pesce si riprenda per 30 minuti come descritto nei passaggi 2.2 e 2.3.
  2. Dopo un periodo di recupero di 30 minuti, preparare un ago sterile da 31 G collegato a una siringa da insulina ed eseguire una procedura di ferita da taglio come segue:
    1. Anestetizzare nuovamente il pesce.
    2. Posizionare il pesce in posizione verticale su una superficie piana e fredda (ad es. impacco di gel di ghiaccio). Inserire l'ago in un lato del telencefalo con un angolo di 90° a una profondità non superiore a 1,5 mm (Figura 2).
      NOTA: Per evitare il contatto diretto della pelle con l'impacco di gel di ghiaccio ed evitare potenziali danni alla pelle, posizionare uno strato di garza o tovagliolo di carta tra il pesce e la superficie fredda (Figura 2). In alternativa, il pesce può essere posizionato in una capsula di Petri poco profonda posizionata sopra l'impacco freddo per mantenere il raffreddamento senza contatto diretto. Segnare 1,5 mm sull'ago per evitare una penetrazione eccessiva.
    3. Trasferire il pesce in una vasca di recupero e lasciarlo recuperare per 30 minuti.
    4. Eutanasia, decapitare, fissare e sezionare il cervello come descritto nei passaggi da 2.4 a 2.7.
    5. Per il controllo negativo, ripetere i passaggi da 2.1 a 2.7 utilizzando 20 μl di 1x PBS invece del colorante EB.

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Figura 2: Ferita da taglio per il controllo positivo. (A) Inserire brevemente un ago 31G nel telencefalo (cerchio rosso) per facilitare la penetrazione del colorante EB nel tessuto cerebrale; Confronto fianco a fianco di un cervello non danneggiato e di un cervello pugnalato, (B) vista dorsale del sito della pugnalata (cerchio rosso), (C) vista laterale del sito della pugnalata. Barra della scala = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Analisi qualitativa dello stravaso di EB

  1. Osservare i tessuti cerebrali sezionati con uno stereomicroscopio. Ottimizza le impostazioni dell'immagine (zoom, bilanciamento del bianco, esposizione, contrasto, ecc.) per garantire la coerenza.
  2. Acquisisci immagini utilizzando una fotocamera montata sul microscopio e salvale in formato . Formato TIFF.
    NOTA: Utilizzare impostazioni di imaging identiche per tutti i campioni per garantire la validità comparativa.

5. Analisi quantitativa dello stravaso di EB

  1. Scarica e installa Fiji (un link per scaricare il software è disponibile nella Tabella dei materiali). Apri l'immagine nelle Figi.
  2. Esegui la deconvoluzione del colore facendo clic su: Immagine > Colore > Deconvoluzione del colore > RGB, ottenendo tre immagini separate che rappresentano le tonalità di rosso, verde e blu.
    NOTA: Questo passaggio isola la tonalità blu dalle altre componenti del colore, assicurando che venga misurata solo l'intensità del colorante blu.
  3. Attiva l'immagine blu del canale (solitamente etichettata "Color_3") facendo clic sull'immagine. Convertilo in scala di grigi a 8 bit facendo clic su: Tipo di > immagine > 8 bit.
    NOTA: La conversione della scala di grigi riduce al minimo gli artefatti cromatici e migliora l'analisi basata sull'intensità.
  4. Misura l'intensità del grigio dell'immagine a 8 bit.
    1. Impostare le misurazioni selezionando: Analizza > Imposta misurazioni; selezionare Area e Valore medio di grigio.
    2. Utilizzando lo strumento di selezione del rettangolo, disegna una regione di interesse (ROI) di dimensioni uniformi e misura l'intensità del grigio selezionando Analizza > misura o premendo Ctrl + M.
      NOTA: La stessa dimensione del ROI deve essere utilizzata per tutti i campioni. Le dimensioni assolute del ROI possono variare a seconda dell'ingrandimento e della risoluzione dell'immagine acquisita, quindi i ricercatori dovrebbero standardizzare le dimensioni del ROI all'interno del loro set di dati per garantire la comparabilità. Ogni pixel nell'immagine in scala di grigi a 8 bit ha un valore di intensità compreso tra 0 e 255, dove 0 rappresenta il nero puro, 255 rappresenta il bianco puro e i valori intermedi rappresentano varie tonalità di grigio.
    3. Per ridurre la distorsione, disegnare da tre a cinque ROI all'interno di regioni anatomicamente coerenti del cervello in tutti i campioni. Evitare le regioni con artefatti o macchie incoerenti.
      NOTA: La coerenza del posizionamento può essere ottenuta facendo riferimento ai punti di riferimento anatomici e garantendo che il posizionamento del ROI sia simmetrico tra i gruppi sperimentali.
    4. Fare la media dei valori di grigio a partire dai ROI per ogni immagine per ottenere un singolo valore di intensità per cervello. Utilizzare questa media per il confronto statistico tra i gruppi.

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Risultati

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Questo protocollo è stato testato su un modello di zebrafish parkinsoniano. La compromissione della BBB è un fenomeno ben documentato nei pazienti con PD 16,17,18 e in vari modelli animali parkinsoniani 19,20,21. Per studiare l'integrità della BBB nel modello parkinsoniano adulto di zebrafish, lo stravaso del colorante EB nei tessuti ce...

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Discussione

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Valutare l'integrità della BBB è essenziale per comprendere la fisiopatologia delle malattie correlate al cervello, poiché una BBB compromessa può sia causare che peggiorare la progressione della malattia4. Sebbene il pesce zebra adulto sia emerso come un modello efficace per lo studio delle malattie neurodegenerative, i metodi per valutare l'integrità della BBB in questa specie rimangono poco sviluppati8. Il protocollo qui presentato forni...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata finanziata dal Ministero dell'Istruzione Superiore della Malesia (MoHE) nell'ambito del Fundamental Research Grant Scheme (FRGS), numero di sovvenzione FRGS19-125-0734. L'aiuto alla pubblicazione di questo studio è stato supportato dalla Facoltà di Medicina dell'Università Kebangsaan Malaysia (UKM).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agarosio in polvereVivantisPC0701
La tintura blu di EvanSigma-AldrichE2129
Figi ImageJIstituti Nazionali di Sanità, Stati UnitiLink per scaricare: https://imagej.net/software/fiji/downloads
Fotocamera per microscopioFornitore verificato - ShenZhen Hayear Electronics Co., Ltd.HY-500M
Paraformaldeide (PFA) in polvereSigma-Aldrich158127
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma-AldrichP4417
Cloruro di sodio (NaCl)Prodotti chimici HmbG7647-14-5
StereomicroscopioSocietà OlimpoSZ40
Unità filtro siringa, 0,45µ mMerck Millipore SLHV004SL

Riferimenti

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