Mutagenesi precisa dei fagi con i sistemi CRISPR-Cas assistiti da NgTET

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per ridurre le modifiche del DNA nei batteriofagi utilizzando l'enzima NgTET, consentendo una mutagenesi CRISPR-Cas efficiente e senza cicatrici. Questo metodo facilita l'ingegneria genetica dei fagi per applicazioni in biotecnologia e terapia fagica.

Abstract

I batteriofagi, virus che colpiscono specificamente i loro ospiti batterici, hanno un potenziale significativo per la biotecnologia e la medicina, in particolare nella lotta contro le infezioni multiresistenti. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dell'infezione da fagi rimangono in gran parte inesplorati. La mutagenesi precisa e sito-specifica dei fagi è uno strumento potente per chiarire le funzioni geniche e le interazioni fago-ospite.

Tuttavia, una delle principali sfide nella mutagenesi del genoma dei fagi è la presenza di modifiche del DNA dei fagi che interferiscono con gli strumenti convenzionali di editing del genoma come CRISPR-Cas.

Sebbene i sistemi CRISPR-Cas siano stati utilizzati con successo per la mutagenesi mirata in vari organismi, la loro efficacia nella mutagenesi dei fagi è spesso limitata da modificazioni del DNA come la glicosilazione della citosina. Per superare questa barriera, abbiamo sviluppato un metodo efficiente che riduce temporaneamente l'abbondanza di modifiche del DNA dei fagi, consentendo un efficiente targeting CRISPR-Cas e un'introduzione precisa delle mutazioni nei genomi dei fagi. In particolare, utilizziamo la metilcitosina diossigenasi Ten Eleven Translocation (TET) di Naegleria gruberi (NgTET), che degrada iterativamente le citosine metilate e idrossimetilate nel DNA. Ossidando le citosine idrossimetilate all'interno del DNA dei fagi, NgTET previene le successive modificazioni della citosina come la glicosilazione e migliora significativamente l'efficienza della scissione del DNA mediata da Cas.

In conclusione, l'approccio preciso e senza cicatrici di editing del genoma qui presentato consente l'introduzione efficiente di mutazioni puntiformi mantenendo l'architettura genica nativa nei genomi dei fagi. Preservando intatti i quadri trascrizionali e traduzionali, questo metodo riduce al minimo le interruzioni involontarie delle complesse reti regolatorie. Ciò è particolarmente importante per lo studio delle proteine fagiche essenziali o multifunzionali. La capacità di generare modifiche genetiche mirate senza introdurre sequenze estranee amplia significativamente il kit di strumenti sperimentali per la biologia dei fagi. Questa strategia non solo facilita studi funzionali dettagliati, ma aumenta anche il potenziale per l'ingegneria razionale dei fagi per applicazioni terapeutiche e biotecnologiche.

Introduzione

I batteriofagi sono virus che prendono di mira specificamente i batteri. Hanno suscitato un notevole interesse da parte della ricerca grazie al loro immenso potenziale nella biotecnologia e nella medicina, in particolare nella lotta contro i batteri multiresistenti ^1,2,3. Nonostante ciò, la biologia dei fagi rimane relativamente poco studiata. Una comprensione più profonda dei loro meccanismi molecolari di dirottamento dei loro ospiti batterici è essenziale per sfruttare appieno il loro potenziale terapeutico e biotecnologico⁴. Per studiare i meccanismi molecolari alla base dell'efficiente infezione dei fagi e per ingegnerizzare ulteriormente i fagi per applicazioni specifiche, è essenziale la capacità di modificare geneticamente i genomi dei fagi. Eppure rimane una delle sfide più significative nel campo della biologia dei fagi ^3,5,6.

Il DNA dei fagi è spesso modificato da specifiche alterazioni chimiche delle basi purine e pirimidiniche, ad esempio la glicosilazione e la metilazione della citosina. Queste modifiche proteggono il materiale genetico dei fagi dal riconoscimento e dalla degradazione da parte delle nucleasi dell'ospite⁶. Sebbene queste modifiche siano cruciali per l'idoneità dei fagi, sono un ostacolo significativo per gli approcci di ingegneria del genoma dei fagi che si basano su sistemi di targeting del DNA ^2,3,7.

Le strategie di mutagenesi esistenti, compresi i sistemi di modificazione della restrizione e le tecnologie basate sulle proteine CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-CAS (CRISPR), affrontano sfide significative quando modificano il DNA dei fagi a causa di modifiche epigenetiche protettive come la glicosilazione della citosina⁸. L'editing genomico mediato da CRISPR-Cas, che è altamente efficace nelle cellule batteriche ed eucariotiche, si basa su due passaggi chiave: la scissione precisa del DNA nei loci genomici mirati da parte della Cas nucleasi, seguita dalla riparazione del DNA attraverso la ricombinazione omologa con il DNA del donatore portatore della mutazione desiderata¹. Tuttavia, nei fagi, le modifiche del DNA spesso impediscono alle nucleasi Cas di legarsi o scindere il genoma in modo efficiente. Inoltre, la natura rapida e transitoria della replicazione dei fagi può limitare ulteriormente l'efficienza della ricombinazione omologa. Queste barriere rendono particolarmente difficile l'applicazione della tecnologia CRISPR-Cas mirata al DNA per la mutagenesi dei fagi. È stato dimostrato che le modifiche del DNA fagico compromettono il targeting del DNA fagico con CRISPR-Cas sia in vitro che in vivo ^6,7.

Per affrontare le sfide poste dalle modificazioni protettive del DNA nei fagi, introduciamo una strategia di mutagenesi del genoma che sfrutta l'attività della metilcitosina diossigenasi dieci-undici (TET), in particolare NgTET. Negli eucarioti, gli enzimi TET catalizzano l'ossidazione graduale della citosina metilata attraverso processi iterativi: la metilcitosina (5mdC) viene prima convertita in idrossimetilcitosina (5hmdC), poi in formilcitosina (5fdC) e infine in carbossicitosina (5cadC) (Figura 1).

Nel nostro approccio alla mutagenesi dei fagi, NgTET viene utilizzato per ridurre temporaneamente l'abbondanza di modifiche protettive del DNA, migliorando così l'accessibilità del DNA dei fagi agli strumenti di editing del genoma come gli enzimi Cas⁹. NgTET, è stato selezionato per modulare il genoma del batteriofago a causa di precedenti rapporti sulla sua espressione di successo in forma solubile attiva in un ospite batterico eterologo, in particolare E. coli. Questa proprietà è essenziale, poiché NgTET deve rimanere attivo durante l'infezione da fagi¹⁰.

Figura 1: Ossidazione graduale della 5-metilcitosina da parte della TET diossigenasi¹. La TET diossigenasi catalizza la successiva ossidazione della 5-metil-2'-deossicitidina (5mdC) a 5hmdC, 5-formil-2'-deossicitidina (5fdC) e infine a 5-carbossil-2'-deossicitidina (5cadC). Il prodotto finale, 5cadC, ritorna spontaneamente o enzimaticamente alla citosina non modificata (dC), contribuendo così alla regolazione epigenetica dinamica. Questo processo in più fasi è fondamentale per la metilazione attiva del DNA negli eucarioti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Poiché la metilcitosina e l'idrossimetilcitosina sono precursori comuni delle ipermodificazioni del DNA dei fagi, comprese le strutture protettive ingombranti come le glicosilazioni, l'attività ossidativa della TET diossigenasi può essere sfruttata per prevenire la formazione di queste ipermodificazioni del DNA⁹. In questo approccio di mutagenesi del genoma basato su TET, esprimiamo eterologamente NgTET in modo ricombinante in E. coli per ossidare le citosine idrossimetilate nel genoma del fago dopo l'infezione, prevenendo così la formazione di glicosilazione bulky. Diminuendo l'abbondanza di queste ingombranti modificazioni del DNA, il nostro approccio può aumentare l'accessibilità del DNA dei fagi alle nucleasi CRISPR-Cas. Questa maggiore accessibilità facilita il riconoscimento efficiente del bersaglio, la scissione precisa del DNA e l'introduzione di mutazioni puntiformi senza cicatrici nel genoma del fago, distinguendolo dai tradizionali metodi di mutagenesi dei fagi che si basano su delezioni geniche, inserzioni di geni reporter o l'integrazione di giunzioni artificiali per la selezione dei mutanti basata sulla PCR ^1,11. Queste strategie convenzionali sono state finora gli unici strumenti disponibili per la mutagenesi mirata nei genomi dei fagi e rappresentano quindi una base importante per il metodo qui presentato. Tuttavia, le proteine dei singoli fagi possono possedere molteplici funzioni. La delezione dell'intero gene che codifica per una proteina di interesse interrompe tutte le funzioni associate. Al contrario, l'introduzione mirata di mutazioni puntiformi consente l'inattivazione selettiva di funzioni specifiche, consentendo un'analisi dettagliata dei loro ruoli. Ad oggi, le funzioni di molte proteine fagiche rimangono in gran parte non caratterizzate; Pertanto, potremmo trascurare ulteriori attività legate a un determinato gene. Pertanto, è preferibile un approccio minimalista che mira a rimuovere solo una singola funzione causando cambiamenti minimi alla proteina complessiva ^12,13. Il metodo qui descritto consente di apportare modifiche genetiche precise senza interrompere l'organizzazione o la funzione genomica complessiva. Un'altra grande sfida dei precedenti metodi di mutagenesi dei fagi è stata la loro bassa efficienza, che in genere ha prodotto tassi di mutazione di circa lo 0,1%^1,11. Con questa tecnica, presentiamo la prima strategia di mutagenesi in grado di introdurre cambiamenti a singolo codone, ottenendo un notevole aumento di sette volte dell'efficienza del targeting. Combinandolo con un metodo di screening ad alto rendimento basato su ONT, il rilevamento delle mutazioni puntiformi è semplificato, eliminando la necessità di sottoporre a screening grandi popolazioni di fagi per isolare un mutante. La strategia di mutagenesi basata su TET qui descritta affronta una limitazione di lunga data nel campo e consente un editing genomico più affidabile¹⁴.

Nel complesso, questo metodo non può essere applicato solo per far progredire la nostra comprensione dei meccanismi di infezione da batteriofagi, ma è anche molto promettente per la biologia sintetica. Consentendo un'ingegneria precisa ed efficiente del genoma dei fagi, apre la strada all'adattamento dei fagi ad applicazioni specifiche, migliorando così il loro potenziale per applicazioni biotecnologiche e mediche.

Protocollo

Uno schema che dimostra la generazione del fago T4 trattato con NgTET è mostrato nella Figura 2.

Figura 2: Panoramica schematica del flusso di lavoro stabilito per la mutagenesi dei fagi T4 e lo screening dei mutanti. Il flusso di lavoro include la generazione del fago T4 ipomodificato utilizzando NgTET, che può essere convalidato mediante analisi LC-MS o in alternativa tramite il saggio di scissione CRISPR-Cas. Successivamente, la mutazione di interesse viene introdotta nel genoma del fago attraverso la mutagenesi sito-diretta mediata da CRISPR-Cas e identificata mediante controselezione. La presenza della mutazione desiderata può quindi essere confermata utilizzando il sequenziamento dei nanopori. Dopo la convalida, il fago mutante può essere propagato per ripristinare le ipermodificazioni del DNA. Ciò consente l'uso del fago ingegnerizzato in applicazioni a valle, compresa l'analisi dei fenotipi di infezione attraverso saggi di lisi e misurazioni delle dimensioni del burst. Ogni passaggio della figura è annotato con il numero di protocollo corrispondente tra parentesi per facilitare il collegamento dei passaggi del protocollo con le rispettive parti della figura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Riduzione delle modifiche del DNA dei fagi utilizzando il pretrattamento NgTET (~2 giorni)

NOTA: Questo passaggio è fondamentale per consentire un efficiente targeting della nucleasi di Cas durante la mutagenesi, riducendo l'abbondanza di modifiche del DNA dei fagi.

1. Inoculare il ceppo di E. coli BL21 (DE3) trasformato con pET28a_NgTET trasferendo il materiale da uno stock di glicerolo in 10 mL di terreno LB integrato con 30 μg/mL di kanamicina. Incubare per una notte a 37 °C con agitazione a 160 giri/min.
2. Il giorno seguente, utilizzare la coltura notturna per inoculare una coltura principale a un OD_{iniziale di 600} di 0,1 in 50 mL di terreno LB contenente 30 μg/mL di kanamicina. Indurre la coltura con 50 μM di IPTG quando si raggiunge un OD₆₀₀ di 0,4.
3. Coltivare la coltura a 37 °C agitando a 160 giri/min fino a raggiungere un OD₆₀₀ di 0,8.
4. Infettare la coltura con il fago di interesse a una molteplicità di infezione (MOI) di 0,1 e incubare per 4 ore a temperatura ambiente con agitazione a 120 giri/min.
5. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 4000 × g per 20 minuti a 4 °C.
6. Passare il surnatante attraverso un filtro da 0,45 μm per ottenere fagi trattati con NgTET con DNA ipomodificato. Conservare i fagi filtrati a 4 °C per un uso futuro.
   NOTA: (PUNTO DI PAUSA) I fagi filtrati sono stabili per diversi mesi a 4 °C, conservati in terreno LB in una bottiglia di vetro.

2. Convalida

NOTA: Lo scopo di questa fase è quello di verificare sperimentalmente la ridotta abbondanza di modificazioni del DNA dei fagi.

1. Convalida del trattamento tramite LC-MS (~ 2 giorni)
   1. Purificazione dei fagi tramite gradiente di saccarosio
      1. Per rimuovere l'acido nucleico residuo dal lisato, trattare 500 μL della sospensione fagica (>10¹⁰ PFU/mL) con 20 U di DNasi I e 2 μL di RNasi A/T1 Mix (4 μg di RNasi A, 10 U di RNasi T1).
      2. Incubare la miscela a 37 °C per 30 minuti.
      3. Preparare un gradiente di saccarosio 0-45% in tampone TM (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, pH 7,5). Prepara la sfumatura utilizzando un mixer di sfumature o manualmente.
         NOTA: Per la preparazione manuale, iniziare pipettando 5 mL di tampone TM in una provetta a gradiente. Quindi, utilizzando una cannula smussata, pipettare lentamente 5 mL della soluzione di saccarosio al 45% dal fondo del tubo, lasciando che la soluzione allo 0% salga gradualmente.
      4. Caricare 500 μl della soluzione di fago trattata sopra il gradiente.
      5. Centrifugare a 70.000 × g per 20 min a 4 °C.
      6. Accendere la provetta da centrifuga dal basso. Ciò consentirà la visualizzazione del fago, che appare come una banda torbida nel gradiente. Rimuovere con cura la frazione contenente fagi utilizzando una cannula smussata.
      7. Trasferire la frazione fagica estratta in una nuova provetta per ultracentrifugazione.
      8. Aggiungere 30 ml di tampone TM ghiacciato e centrifugare a 100.000 × g per 1 ora a 4 °C.
      9. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di tampone TM.
      10. Conservare i fagi risospesi in una fiala di vetro a 4 °C per una notte.
   2. Isolamento del DNA dei fagi
      1. Aggiungere 1 μg di proteinasi K ai fagi risospesi.
      2. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
      3. Aggiungere 1 volume di miscela di fenolo/cloroformio/alcol isoamilico (P/C/I). Mescolare per inversione. Separare le fasi mediante centrifugazione a 15.000 x g per 1 min a 4 °C. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta di reazione. Ripetere l'estrazione tre volte.
         ATTENZIONE: Il fenolo/cloroformio/alcol isoamilico (P/C/I) è altamente tossico, corrosivo e volatile. Maneggiarlo sempre all'interno di una cappa aspirante indossando dispositivi di protezione adeguati, tra cui camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e doppi guanti in nitrile. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi e conservare in un contenitore ermeticamente chiuso in un armadietto chimico designato. Smaltire i rifiuti attraverso canali di rifiuti pericolosi approvati. In caso di contatto, sciacquare immediatamente con acqua e consultare un medico.
      4. Per rimuovere il fenolo residuo, eseguire tre volte le retroestrazioni di cloroformio con 1 volume di cloroformio.
      5. Far precipitare il DNA durante la notte con 0,1 volumi di NaOAc 3 M (pH 5,5) e 2,5 volumi di etanolo a -20 °C.
      6. Il giorno successivo, pellettare il DNA mediante centrifugazione a 15.000 × g per 1 ora a 4 °C.
      7. Lavare due volte il pellet di DNA con 200 μl di etanolo al 70%, agitando delicatamente, centrifugando a 15.000 × g per 15 minuti a 4 °C e rimuovendo con cura il surnatante.
      8. Risospendere il DNA purificato in acqua ultrapura.
      9. Conservare il DNA a -20 °C fino a nuovo utilizzo.
         NOTA: (PUNTO DI PAUSA) Il DNA precipitato può essere conservato a -20 °C per diversi mesi.
   3. Preparazione del DNA dei fagi per l'analisi LC-MS
      1. Digerire il DNA purificato in singoli nucleosidi utilizzando una miscela per la digestione dei nucleosidi.
      2. Analisi della composizione del DNA tramite LC-MS.
         NOTA: Questo passaggio consente la convalida dell'efficacia del trattamento NgTET. Il protocollo è adattato all'attrezzatura e alla colonna specifiche disponibili in laboratorio, ma può essere regolato in base alle risorse e alle condizioni disponibili.
      3. Utilizzare DNA digerito isolato da fago purificato (passaggio 2.1.10).
      4. Includere i seguenti standard disponibili in commercio per le misurazioni: dA, dT, dG, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC. Se disponibile, includere lo standard dell'ipermodificazione della citosina presente sul DNA del fago.
      5. Utilizzare un sistema HPLC dotato di una colonna C18 (150 × 2,1 mm, 100 Å, 3 μm) e di una colonna di protezione da 20 × 2,1 mm.
      6. Impostare la temperatura della colonna a 40 °C e la portata dell'eluente a 0,2 mL/min.
      7. Preparare gli eluenti come segue:
         Eluente A: 10 mM di Acetato di Ammonio in acqua (pH 4,5).
         Eluente B: 0,1% di acido formico in metanolo.
         ATTENZIONE: L'acido formico allo 0,1% nel metanolo è infiammabile e può irritare la pelle, gli occhi e le vie respiratorie. Utilizzare sempre in un'area ben ventilata o in una cappa aspirante. Indossare dispositivi di protezione adeguati, tra cui camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti in nitrile. Tenere lontano da fonti di calore, scintille e fiamme libere. Conservare in un armadietto infiammabile. Smaltire tramite protocolli approvati per i rifiuti pericolosi.
      8. Applicare il seguente profilo di fase mobile: 0-1 min: Costante al 5% B; 1-5 min: Pendenza dal 5% al 90% B; 5-7 min: Costante al 90% B; 7-7,1 min: Pendenza dal 90% al 5% B; 7,1-12 min: Costante al 5% B.
      9. Utilizzare uno spettrometro di massa in modalità di ionizzazione negativa e positiva (iniezioni separate) con una sorgente di ionizzazione elettrospray ad alta temperatura (H-ESI) nelle seguenti condizioni:
         Tensione di spruzzo H-ESI: 3400 V (+), 2400 V (-), Gas guaina: 35 unità arbitrarie, Gas ausiliario: 7 unità arbitrarie, Gas di scansione: 0 unità arbitrarie, Temperatura del tubo di trasferimento ionico: 300 °C, Temperatura del vaporizzatore: 275 °C, Modalità di rilevamento: Scansione completa con l'analizzatore di massa Orbitrap, Risoluzione di massa: 120.000, Intervallo di massa: 200-450 (m/z).
      10. Estrarre i cromatogrammi ionici delle forme [M-H]^- (dA, dT, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC) e [M+H]⁺ (5ghmdC) utilizzando il software Tracefinder.
      11. Calcola l'abbondanza relativa di ciascuna modifica normalizzando l'area di picco di ciascun segnale all'area di picco dG all'interno del campione, utilizzando dG come standard interno specifico del campione.
2. Convalida con il saggio di scissione CRISPR-Cas (~2,5 giorni)
   NOTA: Questa fase consente la valutazione fenotipica del successo del trattamento NgTET e del suo impatto sulla scissione di CRISPR-Cas. Se NgTET è attivo, non dovrebbero formarsi placche dal DNA del fago trattato, o il titolo del fago dovrebbe essere ridotto, poiché la rimozione delle modifiche protettive del DNA rende il genoma suscettibile alla scissione di CRISPR-Cas12 o 9. Al contrario, se il DNA del fago non viene trattato, il numero delle placche formate corrisponderà al titolo dei fagi, indicando che il genoma del fago T4 ipermodificato è resistente alla scissione CRISPR-Cas12 o 9.
   1. Inoculare E. coli BL21 (DE3) da una coltura notturna, trasformato sia con il plasmide pET28a_NgTET che con un plasmide di espressione Cas12 o Cas9 (ad esempio, DS-spCas o pCpf1 senza spaziatore). Tutti i plasmidi con informazioni aggiuntive possono essere trovati nella Tabella 1.
      1. Far crescere le cellule in terreno LB integrato con gli antibiotici appropriati a 3 °C con agitazione, partendo da un OD₆₀₀ di 0,1. Una volta che la coltura raggiunge un OD₆₀₀ di circa 0,4, indurre l'espressione di NgTET aggiungendo 0,05 mM di IPTG e incubare per altre 2 ore a 3 °C.
      2. Come controllo, confrontare i ceppi di E. coli BL21 (DE3) con e senza sovraespressione di NgTET. In assenza di attività di NgTET, è previsto un numero maggiore di unità formanti placche, indicando una ridotta efficienza di CRISPR-Cas a causa della presenza di 5ghmdC glicosilato nel DNA del fago.
   2. Trasferire 300 μl delle colture di E. coli in una provetta sterile.
   3. Infettare la coltura con T4 WT o fago trattato con NgTET con MOI 0,01. Per questo esperimento, applicare un MOI basso per garantire che i batteri siano infettati da un solo fago alla volta. Ciò massimizza l'efficienza dello screening della scissione CRISPR-Cas e semplifica l'interpretazione dei risultati. Mescolare delicatamente per garantire una distribuzione uniforme dei fagi.
   4. Incubare la sospensione batterico-fagica a 37 °C per 7 minuti.
   5. Aggiungere la miscela batterio-fago a 4 ml di LB soft agar (0,75%) integrato con antibiotici. Mescolare accuratamente ma delicatamente per evitare di introdurre bolle.
   6. Versare la miscela morbida di agar su una piastra di agar LB preriscaldata.
   7. Lasciare solidificare brevemente le piastre a temperatura ambiente. Incubare le piastre a 37 °C per una notte.
   8. Il giorno successivo, contare le placche risultanti per determinare le unità di formazione delle placche (PFU).

3. Mutagenesi CRISPR-Cas (~ 1 settimana)

NOTA: La mutagenesi CRISPR-Cas si basa sul principio che un sito specifico all'interno del genoma del fago è preso di mira da una nucleasi Cas durante l'infezione da fago, con conseguente rottura del doppio filamento. Questa rottura viene riparata attraverso la ricombinazione omologa utilizzando il DNA del donatore, che viene fornito su un secondo plasmide presente nel ceppo ospite infetto durante la mutagenesi. Il plasmide che contiene il DNA del donatore codifica anche per NgTET, che è essenziale per mantenere l'accessibilità del DNA del fago per la nucleasi Cas riducendo l'abbondanza di citosine modificate, come descritto in precedenza. In questa fase, le mutazioni bersaglio vengono introdotte nel genoma dei fagi T4 trattati con NgTET dopo l'infezione di E. coli¹⁵. Per garantire livelli costantemente bassi di modificazioni del DNA nel genoma T4, la NgTET diossigenasi è espressa mediante l'aggiunta di 50 μM di IPTG (analogamente al passaggio 1.2) durante tutto il processo di mutagenesi.

1. Generazione di plasmidi di DNA pET28a_NgTET_donor tramite clonaggio golden gate¹⁵
   1. Per la generazione del DNA del donatore, ordinare la sequenza desiderata come un intero gene o amplificare da un genoma, ad esempio dal genoma del fago, e introdurre la mutazione desiderata.
      NOTA: Per la progettazione del DNA del donatore, includere regioni omologhe che fiancheggiano il sito bersaglio (≈200 bp su ciascun lato per mutazioni puntiformi; regioni più lunghe per inserti più grandi). Il frammento donatore lineare dovrebbe contenere siti di riconoscimento BsaI che generano sporgenze compatibili con il plasmide al momento della scissione. Si consiglia la clonazione in silico per verificare il progetto del costrutto. Nei risultati rappresentativi, tutti i componenti critici per il DNA del donatore sono illustrati in un esempio.
   2. Introdurre il frammento di DNA del donatore a valle della sequenza codificante NgTET e del terminatore nella dorsale pET28a_NgTET utilizzando l'assemblaggio Golden Gate.
      1. Preparare le reazioni di assemblaggio combinando 70 fmol di plasmide pET28a_NgTET, 140 fmol di inserto di DNA donatore, 1 μL di BsaI (20 U/μL), 5 U di DNA ligasi T4 e 2 μL di tampone ligasi 10×, con l'aggiunta di acqua priva di nucleasi a un volume finale di 20 μL.
      2. Eseguire le reazioni in 25 cicli in un PCR-cycler con le seguenti impostazioni: 1) Restrizione, 37 °C per 1,5 min, 2) Legatura, 16 °C per 3 min, 3) Restrizione finale, 37 °C per 5 min, e 4) Denaturazione, 60 °C per 10 min.
   3. Aggiungere 6 μl della miscela di reazione (dal punto 3.1.2) a 100 μl di E. coli chimicamente competente DH5α, incubare su ghiaccio per 10 minuti e shock termico a 42 °C per 45 s. Posizionare immediatamente le cellule sul ghiaccio per 1 minuto, quindi aggiungere 750 μl di terreno da libbra. Recuperare a 37 °C con agitazione (500 giri/min) per 1 ora. Piastra su agar LB contenente kanamicina (30 μg/mL) e incubare per una notte a 37 °C.
   4. Scegliere una singola colonia e inoculare 20 ml di terreno LB integrato con kanamicina (30 μg/mL). Incubare per una notte a 37 °C con agitazione a 160 giri/min.
   5. Da 5 mL di coltura notturna, pellettare le cellule e isolare il DNA plasmidico utilizzando un metodo di estrazione plasmidico standard. Eluire il plasmide in 40 μL di acqua priva di nucleasi.
   6. Confermare il corretto clonaggio sequenziando il sito di inserzione del plasmide utilizzando il sequenziamento Sanger.
2. Costruzione di plasmidi CRISPR-Cas contenenti spaziatori (pCpf1-sp come modello)¹⁵
   NOTA: Il plasmide descritto in questo capitolo consente la prima fase della mutagenesi introducendo una rottura sito-specifica del doppio filamento nel genoma del fago. Mentre la procedura è dimostrata qui con il sistema CRISPR-Cas12 (plasmide pCpfl-sp), possono essere impiegate anche nucleasi alternative come CRISPR-Cas9 (plasmide DS-spCas)¹⁵ .
   1. Progettare un distanziatore da 20 nt mirato al sito di mutagenesi (PAM: TTTV). Identificare e progettare protospaziatori adatti e corrispondenti spaziatori utilizzando strumenti bioinformatici.
   2. Sintetizzare due oligonucleotidi 5'-fosforilati. Assicurarsi che ciascuno porti 10 nt della sequenza di spaziatori desiderata (insieme formano l'intero spaziatore da 20 nt) e un'ulteriore regione di 10 nt complementare al sito di inserzione all'interno del plasmide pCpf1-sp.
   3. Inserire il distanziatore CRISPR-Cas progettato nel plasmide pCpf1-sp mediante amplificazione PCR utilizzando i primer della fase 2. Impostare la reazione come segue (volume finale 50 μL): 5 μL di tampone GC 10×, 1 μL di dNTP da 10 mM, 1 μL di primer diretto (10 μM), 1 μL di primer inverso (10 μM), 2,5 μL di DMSO, stampo plasmidico corrispondente a 2 fmol, 1 μL di DNA polimerasi Phusion (2 U/μL) e acqua priva di nucleasi fino a 50 μL.
   4. Posizionare le provette di reazione in un termociclatore ed eseguire il seguente programma: denaturazione iniziale a 98 °C per 30 s; 25 cicli a 98 °C per 10 s, ricottura alla temperatura appropriata (X °C) per 30 s e prolungamento a 72 °C per 6 min; segue un'ultima estensione a 72 °C per 10 min. Conservare i campioni a 4 °C fino a nuova lavorazione.
   5. Miscelare 5 μl della reazione PCR con il tampone di caricamento del DNA (10×) e caricare su un gel di agarosio all'1%. Far scorrere il gel a 130 V per 20 minuti e visualizzare le bande di DNA utilizzando l'illuminazione trans UV. Se l'amplificazione ha esito positivo, purificare il prodotto della PCR utilizzando un kit di pulizia adatto ed eluire in 20 μL di acqua priva di nucleasi.
   6. Circolarizzare il plasmide mediante legatura utilizzando 100 ng di prodotto amplificato miscelato con 1× tampone DNA ligasi T4 e 60 U T4 DNA ligasi in un volume di reazione totale di 15 μL. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Trasformare 100 μl di E. coli chimicamente competente con il prodotto di legatura come descritto al punto 3.1.3. Piastra le cellule su agar LB contenente 50 μg/mL di streptomicina e incuba per una notte a 37 °C.
   7. Prelevare una singola colonia dalla piastra e inocularela in 20 ml di terreno LB integrato con 50 μg/mL di streptomicina. Incubare per una notte a 37 °C con agitazione a 160 giri/min. Da 5 mL di coltura notturna, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e isolare il DNA plasmidico utilizzando un metodo di estrazione plasmidico a scelta. Eluire il plasmide in 40 μL di acqua priva di nucleasi.
   8. Confermare il successo del clonaggio sequenziando il plasmide nel sito di inserimento utilizzando il sequenziamento Sanger.
3. Mutagenesi dei fagi
   1. Trasformare le cellule BL21 (DE3) di E. coli con due plasmidi: pET28a_NgTET_donor-DNA e distanziatore pCpf1-sp (Cas12)/DS-SPcas (Cas9) (generato nei passaggi 3.1 e 3.2). Miscelare 1 μL di ciascun plasmide con 100 μL di E. coli BL21 (DE3) chimicamente competente. Seguire il protocollo descritto nel passaggio 3.1.3. Placcare le cellule trasformate su agar contenente 50 μg/mL di streptomicina e 30 μg/mL di kanamicina e incubare per una notte a 37 °C.
   2. Inoculare il ceppo trasformato di E. coli (E. coli BL21 (DE3) pET28a_NgTET_donor-DNA e pCpf1-sp(Cas12)/DS-SPcas(Cas9)_spacer) in 10 mL di terreno LB integrato con 30 μg/mL di kanamicina e 50 μg/mL di streptomicina. Incubare per una notte a 37 °C con agitazione a 160 giri/min.
   3. Il giorno successivo, diluire la coltura notturna a un OD iniziale di₆₀₀ di 0,1 in 50 mL di terreno LB contenente 30 μg/mL di kanamicina e 50 μg/mL di streptomicina.
   4. Coltivare la coltura a 37 °C agitando a 160 giri/min fino a raggiungere un OD₆₀₀ di 0,8. Abbassare la temperatura a temperatura ambiente (RT) e ridurre la velocità di agitazione a 130 giri/min.
      1. Per migliorare l'adsorbimento dei fagi e l'iniezione di DNA, aggiungere MgCl₂ e CaCl₂ a concentrazioni finali di 1 mM ciascuna, poiché questi cationi bivalenti facilitano l'efficiente interazione fago-ospite.
      2. Infettare la coltura con fagi T4 pretrattati con NgTET e, come controllo negativo, con fagi T4 non trattati con NgTET a un MOI di 0,1. Continuare l'incubazione in RT per 4 ore.
   5. Dopo l'incubazione, trasferire le colture in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 4000 × g a 4 °C per 20 minuti per pellettare le cellule. Filtrare i surnatanti attraverso un filtro da 0,45 μm per rimuovere eventuali cellule batteriche residue. Utilizzare i surnatanti filtrati per i saggi di placca (descritti al punto 2.2) per determinare la concentrazione di fagi o eseguire la controselezione.

4. Identificazione dei mutanti

NOTA: Lo scopo della controselezione è quello di diminuire la percentuale di fagi wild-type che rimangono nella popolazione dopo la mutagenesi. Per questo, i fagi ottenuti dalla fase di mutagenesi (fase 3.3) vengono utilizzati per infettare E. coli che trasporta lo stesso sistema CRISPR-Cas13, che è codificato da un altro plasmide pBA560 (informazioni aggiuntive nella Tabella 1) e dalla stessa sequenza spaziatrice applicata durante la mutagenesi. In questa configurazione, le nucleasi Cas riconoscono selettivamente e scindono il DNA dei fagi wild-type, mentre i fagi portatori delle mutazioni desiderate rimangono inalterati. Questa pressione selettiva sopprime la replicazione wild-type e arricchisce la popolazione per i fagi mutanti¹⁴.

1. Controselezione con Cas13
   1. Infettare E. coli Cas13a_spacer (plasmide pBA560) con i fagi per la controselezione. Questo passaggio facilita la controselezione degradando l'RNA del fago che non ha subito la mutazione prevista.
   2. Eseguire la controselezione nelle stesse condizioni utilizzate durante la mutagenesi (vedere i passaggi 3.3.1-3.3.5). Utilizzare E. coli che esprime un distanziatore Cas13a non mirato come controllo negativo per confermare che la riduzione della placca è specifica per lo spaziatore.
   3. Dopo l'incubazione, filtrare il surnatante contenente fagi controselezionati attraverso un filtro da 0,45 μm per rimuovere i detriti batterici.
      NOTA: (PUNTO DI PAUSA) I fagi filtrati sono stabili per diversi mesi a 4 °C, conservati in terreno LB in una bottiglia di vetro.
   4. Utilizzare i fagi controselezionati e filtrati per un test di placca su un ceppo di E. coli B per isolare le singole placche per la convalida a valle.
2. Sequenziamento di nuova generazione (~ 1 settimana)
   NOTA: Il metodo per l'approccio di sequenziamento altamente multiplexato prevede un processo di PCR in due fasi per generare DNA di amplicone multiplexato adatto per il sequenziamento di nuova generazione a lettura lunga¹⁶.
   1. Separare i fagi dalla mutagenesi piastrendoli come descritto nel passaggio 2.2. Includere controlli appropriati utilizzando fagi ottenuti da mutagenesi eseguiti sia in presenza che in assenza di espressione di NgTET. Come controllo, il targeting di CRISPR-Cas9 e Cas12 senza NgTET non dovrebbe comportare l'introduzione di mutazioni puntiformi. Al contrario, ci si aspetta che la co-espressione di NgTET consenta un editing di successo, portando a una maggiore efficienza di mutagenesi.
   2. Per isolare i singoli fagi, prelevare le singole placche dalla piastra e trasferirle in una provetta contenente 100 μL di tampone Pi-Mg (26 mM Na₂PHO₄, 68 mM NaCl, 22 mM KH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, pH 7,5) e 1 μL di CHCl₃.
      ATTENZIONE: Il cloroformio è tossico, volatile e sospetto cancerogeno, anche in piccoli volumi. Maneggiare solo in una cappa aspirante e indossare dispositivi di protezione completi, tra cui camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti in nitrile. Evitare l'inalazione e il contatto con la pelle. Conservare in un contenitore ermeticamente chiuso in un armadio chimico ventilato e infiammabile. Smaltire i rifiuti di cloroformio tramite la raccolta dei rifiuti pericolosi.
   3. Utilizzare 1 μL di fago T4 isolato nel tampone Pi-Mg come modello per lo screening.
   4. Preparare la miscela di reazione con 0,125 μM di ciascun primer (intorno alla posizione di inserimento) e 1 miscela master di polimerasi ad alta precisione, regolando il volume totale della reazione di amplificazione a 10 μL. Eseguire una reazione PCR con 30 cicli di amplificazione.
   5. Eseguire una seconda PCR per allegare i codici a barre. Pertanto, utilizzare 1 μL di una diluizione 1:10 del prodotto dalla prima PCR come modello.
   6. Preparare la miscela di reazione con primer per codici a barre da 0,3 μM e una miscela di polimerasi hot-start ad alta fedeltà in un volume totale di 7 μl. Eseguire la PCR con 20 cicli di amplificazione.
      NOTA: (PUNTO DI PAUSA) I prodotti PCR possono essere conservati a -20 °C per diverse settimane.
   7. Raggruppa tutti i prodotti PCR con codice a barre e purificali utilizzando la pulizia basata su biglie magnetiche secondo protocolli standard per la preparazione di librerie di sequenziamento di nuova generazione.
   8. Catturare il DNA utilizzando biglie magnetiche, lavare due volte con etanolo all'80% ed eluire in 100 μL di tampone di eluizione (5 mM Tris-HCl, pH 8,5).
   9. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando metodi spettrofotometrici e fluorimetrici, applicando un saggio ad ampio raggio o ad alta sensibilità, a seconda dei casi.
      NOTA: (PUNTO DI PAUSA) Il DNA può essere conservato a -20 °C per diverse settimane.
   10. Generare librerie di sequenziamento utilizzando un protocollo basato sulla legatura secondo le istruzioni del produttore, a partire da 1 μg di DNA in ingresso.

5. Propagazione mutante, recupero delle modificazioni del DNA e prova

NOTA: Una volta identificato il mutante fagico desiderato, viene propagato in E. coli wild-type per ripristinare livelli di modificazione del DNA simili a quelli del fago WT. Ciò garantisce che il fago mutante possa essere utilizzato in successivi esperimenti biologici senza alcun compromesso, a parte la mutazione introdotta.

1. Preparare una coltura da 10 mL di Ceppo B di E. coli in terreno LB e incubare per una notte a 37 °C con agitazione a 160 giri/min.
2. Il giorno seguente, inoculare un terreno fresco da 50 mL LB con la coltura notturna per ottenere un OD_{iniziale di 600} di 0,1.
3. Lasciare crescere la coltura a 37 °C agitando a 160 giri/min fino a raggiungere un OD₆₀₀ di 0,8.
4. Aggiungere 50 μl del ceppo di fago mutante (4.2.2) alla coltura. Rimuovere la fase con cautela per evitare il trasferimento di CHCl₃.
5. Incubare la coltura infetta per una notte a temperatura ambiente con una leggera agitazione a 120 giri/min.
6. Dopo l'incubazione, centrifugare la coltura a 4000 × g per rimuovere le cellule batteriche. Filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,45 μm per raccogliere il fago.
7. Trasferire il fago mutante filtrato in un contenitore di vetro e conservare a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
   NOTA: (PUNTO DI PAUSA) I fagi filtrati sono stabili per diversi mesi a 4 °C, conservati in terreno LB in una bottiglia di vetro.
8. Come validazione opzionale della rigenerazione delle modificazioni del DNA, in particolare delle citosine glicosilate, eseguire un'analisi LC-MS come descritto nella fase 2.1.
   1. A tal fine, purificare il DNA dei fagi recuperato dalla progenie dei fagi come descritto nel passaggio 2.1.1, isolarlo come nel passaggio 2.1.2 e successivamente prepararsi per l'analisi LC-MS come descritto nel passaggio 2.1.3.
   2. Analizza i cromatogrammi ionici e calcola l'abbondanza relativa di ciascuna modifica normalizzando l'area di picco di ciascun segnale con l'area di picco dG all'interno del campione, utilizzando dG come standard interno specifico del campione, come descritto nei passaggi 2.1.3.
      NOTA: Si raccomanda di includere come controlli il fago T4 wild-type, il fago T4 trattato con NgTET e il fago T4 trattato con la variante inattiva NgTET D234A, al fine di convalidare e confrontare direttamente l'abbondanza di 5ghmdC¹⁰.

Risultati

Identificazione della banda fagica nel gradiente.
La visibilità della banda dei fagi nel gradiente dipende dalla concentrazione di fagi nel campione iniziale caricato sul gradiente. Quando il fago è sufficientemente concentrato (~>1 × 10¹¹ PFU/mL), la banda può essere vista chiaramente illuminando il gradiente dal basso con una sorgente luminosa (vedi Figura 3).

Tuttavia, a basse concentrazioni di fagi, la banda potrebbe non esser...

Discussione

Questo studio presenta una strategia robusta e adattabile per introdurre mutazioni puntiformi precise nei genomi dei batteriofagi, comprese le modifiche a singolo nucleotide. Un elemento centrale del flusso di lavoro è l'integrazione di rigorose fasi di convalida in ogni fase, che è essenziale per garantire sia l'accuratezza che l'efficienza dell'editing genomico. Ciò è particolarmente critico data la natura a più fasi del flusso di lavoro e le interazioni dinamiche tra i fagi e i loro o...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette di reazione da 1,5 mL	Sarstedt	72.690.001
Provette canociali da 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Provette in polipropilene a parete sottile open-top da 15 mL	Beckman Coulter Scienze della vita	361706	16 mm x 95 mm (per ultracentrifugazione)
Provette canoniche da 50 mL	Sarstedt	62.547.254
5x buffer GC	Thermo Fisher Scientific	F519L
6x Colorante TriTrack DNA Caricamento	Thermo Fisher Scientific	R1161
Agarosio	Meridiano BIOSCIENZE	BIO-41025	Grado molecolare
Centrifuga Avanti J-30I	Beckman Coulter Scienze della vita	nessun catalogo  numero	Serien-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe
Acido borico	Merck	10043-35-3
BsaI-HF v2	NEB	R3733S
cloruro di calcio esaidrata	ACROS ORGANICS	7774-34-7	97 %, extra puro
Densimetro di celle	Harvard Biochrom	80211630
ChemiDoc MP	Biorad	12003154
Cloroformio	VWR	650498
Cuvette	Sarstedt	67.742
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma Aldrich	D4540
Fosfato acido di sodio	neoFroxx GmbH	7558-79-4	Grado farmaceutico
Pipette Pasteur in vetro usa e getta	VWR	612-1702	230 millimetri
DNase I	Roche	4716728001	10 U/µ L
Miscela dNTP (10 mM per dNTP)	Sigma-Aldrich	72004
DS_SPcas_ModA	Prodotto interno.	https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps	Costrutto plasmidico che contiene sgRNA CRISPR-Cas12/ModA
DS-spCas (sistema CRISPR-Cas9)	Addgene	48645 (numero accessorio addgene)	Plasmide per la costruzione di plasmidi CRISPR-Cas contenenti spaziatori (sistema CRISPR-Cas9) per la mutagenesi dei fagi (passaggio 3.2)
Ceppo B di E. coli Il ceppo è stato utilizzato per l'infezione da T4	DSMZ	nessun catalogo  numero	Escherichia coli (Migula 1895) Castellani e Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)
Ceppo di espressione di E. coli BL21 (DE3), cellula competente	Invitrogen	C600003	Ceppo di espressione, cellule competenti.
E. coli DH5&alfa; Ceppo di clonazione, cellule competenti	Invitrogen	18265017	Ceppo di clonazione, cellule competenti.
EDTA	Roth	8043.2
Etanolo (assoluto)	VWR	200-578-6
Cella a flusso Flongle	Tecnologie Oxford Nanopore	nessun catalogo  numero	R10.4.1. chimica, https://nanoporetech.com/document/flongle
Kit di miniprep plasmidico Gene JET	Thermo Fisher Scientific	10242490
GeneRuler 1 kb Plus Scala del DNA	Thermo Fisher Scientific	SM1331
Scala del DNA GeneRuler ULR	Thermo Fisher Scientific	SM1213
Maestro del gradiente 108	BIOCOMP	nessun catalogo  numero	https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming
Centrifuga Heraeus Pico 17	Termo Scientifico	75002410
Infors HT Incubatore Minitron	Infors AG	nessun catalogo  numero	https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs
Isopropil-beta;-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	367-93-1
Kanamicina	Carl Roth	T832.1
LB-Agar	Carl-Roth	X969.1
LB-medium (Luria/Miller)	Carl-Roth	X968.1
Cloruro di magnesio esaidrato	Sigma-Aldrich	7791-18-6
Solfato di magnesio	Sigma-Aldrich	7487-88-9
Dispositivo MinION	Tecnologie Oxfrod Nanopore	nessun catalogo  numero	https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html
ModA E165A_fw	IDT	GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT	Primer diretto per l'introduzione della mutazione puntiforme per ModA E165A e per l'introduzione di estremità appiccicose per la clonazione Golden Gate (Passaggio 3.1)
ModA E165A_rev	IDT	CATATTACGATAACGA TGACTATCCGGAAAC	Primer inverso per l'introduzione di mutazioni puntiformi per ModA E165A e per l'introduzione di estremità appiccicose per la clonazione Golden Gate (Passaggio 3.1)
ModA_sgRNA_Cas12_fw	IDT	TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTTAAA GTTCTTAGACCCG	Primer diretto per la generazione di spaziatori per sistemi CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 per mutagenesi e controselezione dei fagi (fase 3.2 e fase 4.1)
ModA_sgRNA_Cas12_rev	IDT	AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC	Primer inverso per la generazione di spaziatori per sistemi CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 per mutagenesi e controselezione dei fagi (fase 3.2 e fase 4.1)
Spettrofotometro NanoDrop ND-1000	Thermo Fisher Scientifico	AZY2019944
Kit NucleoMag	Machery Nagel	RIFERIMENTO 744970.50
Miscela di digestione nucleosidica	Biolaboratori del New England	Codice: M0649S
pBA560 (sistema CRISPR-Cas13)	Addgene	186236 (numero accessorio addgene)	Sistema CRISPR-Cas13 codificante plasmidi per la controselezione (passo 4.1)
Plasmide pCpfl-sp (sistema CRISPR-Cas12)	Addgene	122186
Plasmide pCpfl-sp (sistema CRISPR-Cas12)	Addgene	122186 (numero accessorio addgene)	Plasmide per la costruzione di plasmidi CRISPR-Cas contenenti spaziatori (sistema CRISPR-Cas12) per la mutagenesi dei fagi (fase 3.2)
Recipienti di reazione per PCR	Sarstedt	72.991.002
PeqVERDE	VWR	732-3196
pET28a_NgTET	Prodotto interno.	nessun catalogo  numero	Il plasmide è disponibile su richiesta, la mappa plasmidica è reperibile al seguente https://zenodo.org/records/10615143
pET28a_NgTET	Prodotto interno.	nessun catalogo  numero	Plasmide per la costruzione di DNA pET28a_NgTET_donor tramite Golden Gate Cloning (fase 3.1), plasmide è disponibile su richiesta, la mappa plasmidica è reperibile al seguente https://zenodo.org/records/10615143
Piastre di Petri	Sarstedt	82.1473.001	92 x 16 mm con camme
Phusion DNA polimerasi	Thermo Fisher Scientific	F-530XL	2 U/µ L
Fosfato di potassio	Sigma Aldrich	7778-77-0	Monobasico
Alimentatore universale PowerPac	Rabbia bio	1645070
Proteinasi K	Carl Roth	7528.1	100 mg/mL
Kit di purificazione QIAquick PCR	QIAGEN	28506
Fluormetro Quantus, sistema QuantiFluor dsDNA	Promega	E2670
RNasi A/T1	Thermo Fisher Scientifico	EN0551	miscela 2 mg/mL di RNasi A 5000 U/mL di RNasi T1
Roti-Aqua P/C/I per l'estrazione del DNA	Carl Roth	X985.1
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	127-09-3
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Kit di sequenziamento della legatura SQK-LSK109	Tecnologie Oxford Nanopore	nessun catalogo  numero	https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109
Filtri Steritop, 0,22 & micro; m Dimensione dei pori	Millipore	S2GPT05RE	250 mL e 500 mL
Streptomicina 50 mg/L	Carl Roth	HP66.1
Succrose	NeoFroxx GmbH	57-50-1	per biologia molecolare
Rotore in alluminio con benna oscillante	Beckman Coulter Scienze della vita	JS[1]24.15
T4 DNA ligasi 5 U/µ L	Thermo Fisher Scientific	EL0011
Tampone DNA ligasi T4	Thermo Fisher Scientific	B69
Provette a parete pesante senza bordo	Karl Hecht GmbH	42775054	100 mm x 18 mm
Termociclatore, T100	Biorad	1861096
Thermomixer comfort	Eppendorf	5382000015
Trizma Base	Sigma Aldrich	77-86-1
Bagno d'acqua, VWB2	VWR	462-0557	Volume 12 L