Valutazione delle risposte delle foglie ai metaboliti secondari microbici utilizzando un formato ad alto rendimento

Sommario

Questo protocollo descrive un approccio ad alta produttività per valutare la perdita di ioni della pianta, l'attività della perossidasi e la produzione di callosi nello stesso campione.

Abstract

I microbi secernono metaboliti secondari strutturalmente diversi durante l'infezione delle piante, alcuni dei quali vengono rilevati dalle cellule vegetali, che scatenano risposte allo stress. In questo metodo, l'induzione della perdita di ioni, dell'attività della perossidasi e della produzione di callose viene misurata nello stesso campione di disco fogliare. Innanzitutto, Arabidopsis o dischi di foglie d'orzo sono infiltrati a vuoto in una piastra a 96 pozzi. Dopo 4-6 ore, viene misurata la conducibilità, seguita dall'attività della perossidasi e dalla deposizione di callosi a 24 ore. Il peptide FLG22 induce tutte e tre le risposte ed è un controllo positivo accessibile. I lipopeptidi ciclici di surfactina e gramillina inducono rispettivamente attività di perossidasi e fuga di ioni, mentre il tricotecene fitotossidico T-2 sopprime l'attività della perossidasi. Nel complesso, questo approccio consente confronti multipli sia tra genotipi vegetali sia tra trattamenti con metaboliti. Questo approccio può essere applicato alla genetica chimica o alla bioprotezione per identificare composti modulanti dello stress da studiare ulteriormente. Nella genetica vegetale, questo approccio può essere utilizzato per confrontare le risposte tra popolazioni vegetali per la mappatura genetica e per migliorare la nostra comprensione delle interazioni pianta-microrganismo.

Introduzione

Le piante rispondono a molecole microbiche diverse per attivare risposte allo stress cellulare, che possono portare a una resistenza alle malattie. I pattern molecolari associati ai microbi (MAMP), come il peptide flg22 della flagellina batterica, vengono rilevati dalle proteine recettrici vegetali per avviare una serie di risposte cellulari di segnalazione. Queste includono risposte precoci come cascate di chinasi, produzione di specie reattive di ossigeno (ROS), picchi di calcio, depolarizzazione della membrana e risposte tardive come la deposizione di callosi e l'induzione di attività^{perossidasi 1}. I metaboliti secondari microbici (MSM) sono piccoli (50-1.500 Dalton), molecole strutturalmente diverse che sono dispensabili per la crescita e lo sviluppo ma favoriscono la sopravvivenza del microbo. Alcuni MSM inducono risposte cellulari allo stress nelle piante, anche se i meccanismi coinvolti nell'avvio di queste risposte restano^{irrisolti 2,3}. I meccanismi proposti per il riconoscimento delle piante dell'MSM includono meccanosensi, modifiche proteiche indotte da redox o segnalazione a base di^{lipidi 4,5}. In alcuni casi, l'MSM induce risposte allo stress o causa danni cellulari a seconda della concentrazione. Ad esempio, la tossina T-2 induce la produzione di callosi e ROS a 1 μM e causa morte cellulare a 10 μM, ed è tipicamente descritta come^{fitossina 4}. Gli MSM influenzano la patogenesi in alcune interazioni pianta-microrganismo e possono innescare sia la suscettibilità che la resistenza delle piante. Ad esempio, il lipopeptide ciclico gramillina induce la produzione di ROS, perdite ioniche e produzione di callosi, aumentando al contempo la suscettibilità all'orzo a Fusarium^{graminearum 2}. I lipopeptidi ciclici siringomicina e siringopepitina inducono la produzione di ROS vegetale e promuovono la resistenza dell'ospite contro il batterio Pseudomonas fluorescens ³. Altri MSM, come surfactina e iturina, sono prodotti da microbi non patogeni e promuovono la resistenza contro le successive infezioni patogeniche inducendo risposte allo stress delle^{piante 6,7}. Questi MSM bioprotettivi inducono risposte cellulari, inclusi flussi ionici, produzione di ROS, cambiamenti trascrizionali e produzione di^{callosi 8}. Comprendere le interazioni tra MSM e piante potrebbe aiutare a determinare il ruolo dell'MSM nella resistenza alle malattie e a identificare geni ospiti che potrebbero essere sfruttati per migliorare la resistenza delle colture.

I metodi attuali per valutare le risposte allo stress delle piante indotte dagli MSM prevedono tipicamente di testare una risposta allo stress alla^{volta 8}. Dato che l'MSM secondario può essere difficile da estrarre e che una quantità limitata di metaboliti potrebbe essere disponibile, testare le risposte multiple all'interno dello stesso campione può rassicurare che l'MSM abbia un effetto sulle cellule vegetali. Un metodo ad alto rendimento per valutare le esplosioni ROS apoplastiche è il rilevamento della luminescenza generata dal luminolo ossidato in presenza di perossidasi^{di rafano 9}. Purtroppo, la luminescenza a base di luminolo viene spenta da cationi e alcuni solventi, limitando l'uso di questo saggio per estratti contenenti sali o per molecole non polari che devono essere sciolte in DMSO, rendendo necessario un metodo che funzioni con questi^{contaminanti 9}. Per affrontare questi problemi, abbiamo esteso i metodi attuali per valutare tre risposte allo stress (perdita ionica, attività della perossidasi e callosi) dallo stesso campione fogliare in un saggio ad alta produttività (Figura 1)10,11,12. Il nostro approccio prevede il trattamento dei dischi fogliari con MSM utilizzando infiltrazione in vuoto in una piastra a 96 pozzi. Successivamente, le misurazioni della conducibilità vengono effettuate 4-6 ore dopo il trattamento per valutare la perdita di ioni, seguite da misurazioni dell'attività della perossidasi e della deposizione di callosi a 24 ore. Il nostro approccio è stato ottimizzato per Arabidopsis e orzo, ma potrebbe essere esteso ad altre specie vegetali con validazione sperimentale. Ad esempio, l'attività indotta della perossidasi d'orzo non è rilevabile con questo metodo, ma si può rilevare la soppressione dell'attività da parte di composti tossici. Pertanto, le caratteristiche delle foglie o l'ampiezza della risposta indotta variano tra le specie, limitando l'applicabilità di questo approccio ad alcune specie vegetali.

Il disegno sperimentale con questo metodo dovrebbe tenere conto dei controlli, della replicazione e della concentrazione di MSM utilizzati per garantire i migliori risultati. Un controllo negativo è essenziale per identificare gli MSM che inducono livelli statisticamente diversi di risposta allo stress rispetto agli effetti delle ferite. Idealmente, il controllo negativo dovrebbe contenere lo stesso solvente del MSM ma privo del MSM. I solventi tipici per gli MSM idrofobici includono DMSO e metanolo, che inducono risposte cellulari come la produzione di ROS ad alte^{concentrazioni 13,14}. In questo saggio osserviamo un impatto sull'attività della perossidasi, dove il 10% o più di DMSO e metanolo bloccano l'attività della perossidasi indotta da FLG22 (Figura 2). Nel caso di estratti complessi, può essere difficile sviluppare un controllo negativo privo di MSM quando i metaboliti di interesse sono sconosciuti. Invece, frazionare gli estratti in base a dimensione, polarità o carica permetterebbe confronti relativi tra frazioni per identificare la frazione più stressante da un'analisi ulteriore. Inoltre, includere un controllo positivo, come la tossina Flg22 da 1 μM o la tossina T-2 da 10 μM, garantisce al ricercatore di valutare che il test funziona. Raccomandiamo di includere quattro repliche tecniche per trattamento e di includere controlli positivi e negativi in ciascuna placca quando vengono misurate più placche all'interno di un esperimento.

Nel complesso, questo approccio cattura tre risposte allo stress delle piante indotte dal MSM, offrendo un metodo accessibile ed economico per indagare le interazioni pianta-MSM. Il formato ad alta produttività consente ai ricercatori di catturare sottili differenze tra genotipi vegetali o estratti microbici all'interno della stessa unità sperimentale. Ciò consente approcci a livello di sistema per comprendere le famiglie geniche delle piante o per sondare le popolazioni vegetali per la mappatura genetica. Dal lato microbico, questo approccio potrebbe essere utilizzato per selezionare potenziali composti bioprotettivi o in genomica chimica per identificare composti che potenziano o sopprimono specifiche risposte allo stress.

Protocollo

1. Preparazione e trattamento del campione

NOTA: Tutte le adeguate precauzioni di sicurezza e le pratiche di smaltimento devono essere adottate per minimizzare il rischio per l'espertore e l'ambiente.

1. Coltivazione delle piante
   1. Coltiva Arabidopsis fino allo stadio di 4-5 settimane su miscela di terreno Cornell (300 torba: 630 vermiculite: 1 fertilizzante a rilascio lento: 4,2 calce) con due piante per vaso in 24 vasi per vassoio. Annaffia le piante quando serve dal basso aggiungendo acqua al vassoio. Imposta le condizioni della camera di crescita a 21 °C in modo continuo, con 16 ore di luce e 8 ore di buio, mantenendo circa il 30-50% di umidità. Usa le foglie completamente dilatate da 5 a 9 per sperimentare e raccogliere al mattino.
   2. Coltiva orzo finché la prima e la seconda vera foglie non sono completamente espanse in 75 terriccio: 24 terra nera: 1 miscela di calce. Pianta un seme per vaso in 24 appezzamenti per vassoio, annaffiando al bisogno. Imposta le condizioni della camera di crescita a 21 ^°C con 16 ore di luce e 8 ore di buio a circa il 30-50% di umidità. Campiona la prima e la seconda foglie completamente espanse e raccogli la mattina.
2. Raccogli tre dischi fogliari per pianta usando un trivellatore di sughero di 4 mm di diametro, evitando la vena centrale. Evita di macerare il tessuto usando un forno affilato con un movimento di torsione (forer).
3. Posizionare immediatamente e delicatamente i dischi foglari in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a 196 μL di sterile Milli-Q_{H 2}O. Continuare a raccogliere i dischi fino a raggiungere il numero richiesto di campioni.
4. Aggiungere metaboliti secondari o trattamenti con solvente alla concentrazione desiderata a un volume finale di 200 μL nei singoli pozzi.
5. Metti la piastra a 96 pozzi con il coperchio scoperto in un barattolo a campana con un ugello a vuoto.
6. Collega il tubo del vuoto all'ugello del bell jar e attiva la pressione del vuoto finché il vuoto non raggiunge 9,8 libbre/pollice quadrato (tipicamente 10 secondi). Ripeti questo processo ancora una volta.
7. Posizionare il coperchio sulla piastra e incubare su uno shaker orbitale (55 rpm) sotto luce (13 W, 50 μmol∙^m-2∙^s-1) posizionata 23 cm sopra lo shaker per 4 ore.

2. Misurazioni della perdita ionica

1. Lava la sonda con acqua Milli-Q e tampona leggermente Kimwipe per asciugare. Nota la lettura della conducibilità dell'acqua come riferimento.
2. A 4-6 ore dal trattamento, campionare e registrare la conducibilità dai singoli pozzi immergendo la sonda nel liquido che circonda il disco fogliare. Tieni la piastra a un angolo di 45° per assicurarti che la sonda sia completamente emersa.
3. Risciacquare la sonda tra i campioni immergendola in acqua Milli-Q e asciugando la sonda con un Kimwipe. Occasionalmente, si verifica la conducibilità dell'acqua per assicurarsi che le letture della sonda rimangano stabili.
4. Posizionare una pellicola di plastica sigillante sulla piastra e riportarla allo shaker orbitale per l'incubazione durante la notte.

3. Misurazioni dell'attività della perossidasi

1. Prepara il substrato di perossidasi fresco ogni giorno come soluzione da 50 mL. Riscalda 40 mL di acqua sterile distillata a 70 ^°C in un becher con una barra di mescolamento e sciogli 50 mg di acido 5-aminosalicilico (1 mg/mL) nell'acqua riscaldata. Aggiungi acqua fino a 50 mL e regola il pH a 6 usando NaOH. La soluzione è fotosensibile, quindi copri con carta stagnola o usa un tubo ambrato.
2. In un tubo conico ambrato da 50 mL, si prepara una soluzione all'1%_{H 2O2} aggiungendo 1,7 mL di 30%_{H 2}O₂ a 48,3 mL di Milli-Q H₂O.
3. Immediatamente prima del saggio, si aggiungono 10 μL della soluzione 1%_H2O2 per millilitro di soluzione 5-aminosalicilica necessaria affinché il saggio generi il mezzo del saggio.
4. Per campionare i dischi foglari trattati, preleva 50 μL da ciascun pozzo nel momento desiderato. Trasferire su una piastra trasparente e a fondo piatto da 96 pozzi e aggiungere 50 μL del mezzo per il saggio, mescolando tramite pipettaggio 5 volte.
5. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 3 minuti e fermare la reazione aggiungendo 20 μL di 2 N NaOH, picchiettando delicatamente per mescolare.
6. Misura l'assorbenza dei pozzi a 595 nm in un lettore di placche.

4. Imaging calloso e analisi delle immagini

1. Dopo aver campionato i pozzi per il saggio con perossidasi, rimuovere il liquido residuo dai pozzi e aggiungere 100 μL di una soluzione di acido acetico:etanolo (1:3) per fissazione e decolorazione. Metti un coperchio sul piatto e incuba il piatto su uno shaker (60 giri/min) in una cappa per 24 ore a temperatura ambiente.
2. Sostituisci la soluzione di decolorazione con una soluzione fresca e incuba per altre 24 ore a temperatura ambiente.
3. Scavare la soluzione anticolorante e aggiungere 100 μL di 150 mM_{K 2HPO 4} in ciascun pozzo. Metti il piatto sullo shaker e incuba per 30 minuti a temperatura ambiente.
4. Rimuovere la soluzione di lavaggio K_{2HPO 4} e aggiungere 100 μL di 150 mM K₂HPO₄ con 0,1 mg/mL blu di anilina. Copri la piastra a 96 pozzi con un coperchio e carta stagnola e incuba su uno shaker per almeno 2 ore (Arabidopsis) o per tutta la notte (orzo).
   NOTA: Il blu anilina è sensibile alla luce e dovrebbe essere reprodotto fresco per ogni replica tecnica.
5. Rimuovi la soluzione blu di anilina e sostituisci con glicerolo al 50%. Copri le piastre da 96 pozzi con carta stagnola di alluminio e conserva a 4 °C fino a quando non sono pronte per l'immagine.
6. Metti una goccia di soluzione al 50% di glicerolo su un vetrino di vetro pulito. Prendi delicatamente un disco fogliare con una pinzetta e posizionalo con il lato abaxiale verso l'alto sul vetrino. Copri con una copertura da 1,5, minimizzando le bolle d'aria, e aggiungi ulteriore glicerolo al 50% se necessario per riempire sotto la copertura.
7. Porta a fuoco il materiale fogliare usando luce bianca trasmessa (campo luminoso) sotto un obiettivo a 20x asciutto.
8. Seleziona la lunghezza d'onda di eccitazione a 370 nm e quella di emissione a 509 nm per l'imaging blu di anilina e imposta un tempo di esposizione. Ottimizza il tempo di esposizione per consentire un segnale sufficiente ma evitare la sovrasaturazione dei pixel. Per il confronto quantitativo delle immagini, assicurarsi che l'intensità del laser e il tempo di esposizione siano coerenti per tutte le repliche biologiche, trattamenti e repliche tecniche.
9. Per ogni disco foglia, seleziona tre diversi campi visivi e acquisisci immagini per ciascuno utilizzando i parametri impostati nel passo 4.8. Acquisire tutte le immagini con materiale vegetale che riempie completamente il campo visivo con regioni minime di sfondo (materiale non vegetale). Acquisire immagini su un singolo piano Z sulla superficie della foglia.
   NOTA: Avere un po' di sfondo potrebbe essere inevitabile e può essere corretto nei passaggi successivi di quantificazione dell'immagine. In questo esempio, le immagini vengono scattate utilizzando un microscopio a epifluorescenza verticale con una lampada al mercurio e il cubo filtro DAPI (eccitazione 360/40 nm, emissione 460/50 nm). Nei casi in cui non è disponibile una lampada al mercurio, si può utilizzare una sorgente luminosa LED multi-lunghezza d'onda.
10. Per quantificare le macchie di calcolo dalle immagini, scarica e installa il software di elaborazione immagini FIJI disponibile gratuitamente utilizzando le istruzioni online su https://imagej.net/Fiji/Downloads. Apri FIJI e importa le immagini blu di anilina per l'analisi. Per questa analisi, utilizzare .tiff file con risoluzione di almeno 300 dpi. Esporta i file immagine in formato .tiff utilizzando il software del microscopio prima dell'analisi, oppure lascia che FIJI apra i file.
    NOTA: Fiji può aprire la maggior parte dei tipi di file proprietari (ad esempio, .czi, .nd2, .lif, .vsi).
11. Imposta la scala sull'immagine ( clicca su Analizza | Imposta Scala), utilizzando i valori di distanza del sistema del microscopio.
12. Converti l'immagine in un'immagine in scala di grigi a 32 bit (clicca su Immagine | Tipo | 32 bit).
13. Regola la soglia (clicca su Immagine | Modifica | Soglia) per includere solo il segnale di fluorescenza che rappresenta la colorazione blu dell'anilina cliccando su Auto e poi regolando manualmente i valori minimi e massimi sulla curva soglia. Una volta definita la soglia, clicca su Applica | Converti in Maschera. Utilizzando un software di fogli di calcolo, scrivi i parametri di soglia selezionati per ogni immagine.
    NOTA: A causa dell'autofluorescenza intrinseca dei campioni vegetali e della pulizia del tessuto vegetale, la soglia può variare tra i campioni. Per la riproducibilità, è essenziale registrare la soglia di ogni immagine ed essere coerenti nell'adattare i valori delle soglie tra i campioni.
14. Quantifica il numero e la dimensione dei punti blu di anilina usando Analizza le particelle (clicca su Analizza | Analizza le particelle) usando le impostazioni predefinite. Per i valori medi di tutti i punti nell'immagine, seleziona Riassumi nella finestra pop-up, poi clicca OK.
15. Copia e incolla questi risultati dalla casella Riepilogo nel foglio di calcolo con i parametri soglia per ulteriori analisi. I valori inclusi in questa quantificazione includono il Count (numero di punti blu di anilina), l'area totale (area totale in^{unità 2} di punti blu di anilina), la dimensione media (dimensione media nelle unitಠdi punti blu di anilina), %Area (percentuale di copertura media nelle unitಠdi fluorescenza blu di anilina rispetto all'area totale), Perimetro (perimetro medio dei punti) e IntDen (indicazione dell'intensità di fluorescenza della colorazione blu di anilina).
16. Ripeti i passaggi 4.11-4.15 per tutte le immagini acquisite durante l'esperimento. Quando chiudi un'immagine con soglia da FIJI, seleziona Non salvare per evitare di cambiare l'immagine dei dati grezzi con la maschera soglia.
17. Se qualche immagine contiene area con sfondo non vegetale, misura l'area del tessuto vegetale delineando manualmente la regione del tessuto vegetale usando gli strumenti di selezione Polygon o a mano libera e misurando l'Area (clicca su Analizza | Misura). Copia questo valore nel foglio di calcolo per ogni immagine.
18. In un foglio di calcolo, si mediano i valori delle tre immagini a campo visivo di una replica biologica. Se alcune immagini dell'esperimento contengono area non vegetale (vedi passo 4.17), correggere tutti i valori in base all'area del tessuto vegetale in ciascuna immagine. Ad esempio, dividere il valore di conteggio per l'area del tessuto vegetale per ogni immagine prima di tracciare grafici e confronti statistici.

5. Analisi dei dati

1. Valuta la qualità dell'esperimento confrontando i controlli positivi con quelli negativi all'interno della stessa placca utilizzando un test t. Se i controlli positivi non hanno prodotto cambiamenti significativi nelle risposte allo stress, si rivalutano condizioni sperimentali come la salute delle piante, il tempismo del trattamento, il controllo negativo e il potenziale deterioramento degli MSM.
2. Test di rilevanza
   1. Se tutte le repliche tecniche di un trattamento vengono valutate all'interno della stessa placca, si analizzano le differenze tra i singoli trattamenti e il controllo negativo utilizzando approcci statistici standard come un ANOVA unidirezionale con test di Tukey.
   2. Se le repliche tecniche di un trattamento sono state valutate su più lastre, si normalizza ogni campione rispetto al controllo negativo per minimizzare l'influenza dell'errore tra placche. Dividere ogni valore per la media dei campioni di controllo negativi provenienti dalla stessa placca. Sottoporre i valori normalizzati a metodi statistici standard.

Risultati

Utilizzando questo metodo, si può determinare se un MSM attiva un sottoinsieme delle risposte allo stress cellulare delle piante. I risultati di questo saggio forniscono la quantificazione dell'attività della perossidasi, della perdita ionica e della produzione di callosi per determinare se un MSM induce risposte differenziali rispetto a un controllo negativo. Un risultato positivo per un composto sarebbe indicato da una differenza significativa rispetto al controllo negativo, come mostrato per l'ionofero gramillina, che induce perdita ionica e produzione di callosi (Figura 3)². Includere un controllo positivo, come 1 μM flg22, che induce tutte e tre le risposte, garantisce prestazioni intatte dell'impianto e condizioni sperimentali (Figura 3)^11,15. Gramillin e FLG22 sono disciolti in acqua, mentre la surfactina idrofobica e la tossina T-2 sono disciolte in DMSO. Per preparare molecole idrofobe, prepariamo prima uno stock da 10 mM in DMSO. Questo materiale viene utilizzato per creare una concentrazione finale di 10 μM in acqua Milli-Q per il trattamento delle foglie, che contiene lo 0,1% di DMSO. La surfactina (10 μM) induce attività di perossidasi e callosi, mentre la tossina T-2 (10 μM) sopprime l'attività della perossidasi e induce la produzione di callosi, probabilmente dovuta alla morte^{cellulare 2,6,16}. Utilizzare acqua o DMSO allo 0,1% come controlli negativi è appropriato per i trattamenti indicati, poiché entrambi i controlli producono risultati simili (Figura 2).

Nei nostri screening preliminari di 100 MSM disponibili in commercio, vediamo l'induzione callosa per la maggior parte dei composti che abbiamo esaminato (>70%), mentre la perdita di ioni e l'attività della perossidasi sono innescate da un numero minore di composti (30% e 35%). La maggior parte di questi composti è prodotta da specie di Fusarium , inclusi sette diversi tricoteceni come il desossinivalenole (DON) e la tossina T-2. Sebbene ulteriori replicazioni siano in corso per confermare questi risultati, indicano tendenze simili a quelle osservate nei nostri controlli positivi (Figura 3), dove la callosia è stata indotta da tutti i trattamenti e la perdita di ioni o perossidasi è stata innescata da alcuni ma non da tutti i trattamenti.

Figura 1: Panoramica della procedura per valutare le risposte cellulari indotte dall'MSM nelle foglie. I dischi fogliari vengono posizionati in una piastra a 96 pozzi contenente i trattamenti di interesse, e i dischi sono infiltrati nel vuoto. Ogni piastra contiene quattro repliche di un controllo negativo (acqua con solvente) e un controllo positivo (tossina FLG22 o T-2). Dopo 4-6 ore, la conducibilità del liquido che circonda il disco fogliare viene misurata come quantificazione della perdita ionica. Dopo 24 ore, l'attività della perossidasi viene quantificata tramite un saggio colorimetrico utilizzando il liquido che circonda il disco fogliare, e il disco fogliare viene decolorato e processato per la quantificazione del callosio. Abbreviazione: MSM = metabolita secondario microbico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: L'effetto del solvente sulla perdita di ioni indotta da FLG22 o sull'attività della perossidasi. Quattro campioni replicati di Arabidopsis sono stati trattati con 1 μM flg22 combinato con DMSO o metanolo (0, 0,01, 0,1, 1, 10%). I grafici a barre mostrano la conducibilità media del campione dopo 4 ore o l'attività della perossidasi (OD₆₀₀) a 24 ore dopo il trattamento da un singolo esperimento (n = 4, SD). L'esperimento è stato ripetuto due volte con risultati simili. La differenza significativa rispetto al controllo dell'acqua è stata determinata dal test t e indicata da un asterisco (p < 0,05). Abbreviazioni: DMSO = dimetilsolfosdo; MeOH = metanolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Induzione di perdite ioniche, attività di perossidasi o deposizione callosa nei dischi fogliari di Arabidopsis da parte di molecole di origine microbica. I trattamenti includevano il peptide immunogenico e non tossico flg22 (1 μM), i lipopeptidi ciclici gramillina e surfactina (10 μM) e la tossina T-2 (10 μM^)2,6. Tutti i dati sono stati normalizzati all'acqua + 0,1% di DMSO controllo. I grafici a scatola e baffo mostrano la conducibilità del campione dopo 4 ore, l'attività di perossidasi (OD₆₀₀) dopo 24 ore, o il numero di depositi callosi dopo 24 ore da un singolo esperimento (n = 4-16 piante). I box plot indicano una 'x' per indicare il valore della media, mentre le casse indicano il primo quartile, la mediana e il terzo quartile del trattamento. Le osservazioni più alte e più basse che non sono outlier sono indicate dai baffi (intervallo interquartile >1,5x, indicato da cerchi). La differenza significativa rispetto al controllo dell'acqua è indicata da un asterisco ed è stata determinata tramite ANOVA unidirezionale con un test di Tukey (p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Le comunità microbiche colonizzatrici delle piante secernono diversi MSM per facilitare la formazione di biofilm, sopprimere i microbi concorrenti e influenzare l'ospite^{vegetale 17}. Mentre alcuni MSM non hanno impatto sulla pianta, altri inducono una rapida morte cellulare, sopprimono la funzione cellulare o inducono resistenza delle^{piante 17}. Alcuni MSM influenzano la resistenza delle piante al microbio produttore di MSM, e i genotipi resistenti possono essere selezionati in base all'insensibilità^{agli MSM 2,3,18}. Altri MSM inducono resistenza sistemica e offrono protezione contro patogeni microbici, che è stata utilizzata in agricoltura per sviluppare prodotti bioprotettivi per sopprimere la^{malattia 8}. Per sviluppare strategie efficaci e sostenibili di miglioramento delle colture, è essenziale identificare gli MSM benefici e i geni delle piante che consentono una risposta ottimale agli MSM.

Trovare MSM benefici è complicato dal fatto che questi composti sono prodotti enzimaticamente, dove per il prodotto finito sono necessari più^{enzimi 2}. Questo rende difficile determinare quale gene puntare per abolire la produzione di MSM per studi genetici. La biosintesi enzimatica produce molteplici variazioni strutturali dello stesso MSM con potenzialmente diverse bioattività¹⁹. Separare e purificare questi MSM per trovare le molecole bioattive può richiedere tempo o impossibile. In alcuni casi, solo basse concentrazioni di singoli MSM possono essere purificate, richiedendo più cicli di^{purificazione 2}. Una volta ottenuto un composto o un estratto bioattivo, si possono adottare diversi approcci per capire come il microrganismo possa influenzare la pianta.

Gli sforzi passati si sono concentrati sul monitoraggio dell'impatto degli MSM sulla riprogrammazione trascrizionale o sulla bioprotezione nelle piante^{modello 20}. Per valutare le risposte degli MSM oltre le piante modello, sono potenzialmente utili saggi ad alto rendimento che catturano risposte a diversi MSM e richiedono un minimo di MSM. Studi recenti indicano che gli scoppi ROS sono una risposta precoce comune agli MSM, tra cui gramillina, surfactina, siringomicina e siringopeptin ^2,3,7. Un saggio a base di luminolo rileva lo scoppio ROS apoplastico generato da perossidasi e NADPH ossidasi ed è adatto a test ad alta^{produttività 21}. Purtroppo, le ROS intracellulari indotte dagli MSM, come la surfactina, non sono rilevabili con questo^{metodo 7}. La quantificazione dell'attività della perossidasi offre un'alternativa più sensibile rispetto al saggio basato sul luminolo per rilevare l'attivazione transitoria degli enzimi produttori di ROS durante lo stress¹¹. La nostra osservazione che la surfactina induce l'attività della perossidasi è in linea con studi recenti che mostrano che l'attività della peroxidasi è innescata da surfactina e beauvericina in Arabidopsis (Figura 3)². Inoltre, abbiamo dimostrato che flg22 e l'ionoforo gramillin indurrono perdite ioniche, e tutti i composti testati, inclusi flg22, tossina T-2, surfactina e gramillina, inducono callosio come previsto (Figura 3)^2,4,7.

Valutando risposte multiple all'interno dello stesso campione, minimizziamo la variazione sperimentale nella valutazione separata di ciascuno di questi tratti e consentiamo correlazioni tra i tratti per studi a livello di sistema sulle risposte allo stress delle piante. La valutazione di più trattamenti o genotipi all'interno della stessa unità sperimentale consente anche la fenotipizzazione a livello di popolazione per la genetica delle popolazioni. Ad esempio, un approccio simile è stato utilizzato per identificare un QTL sottostante alla produzione di ROS indotta da FLG22^{nell'orzo 22}. Questo saggio può essere utilizzato anche per screening di genetica chimica per individuare modulatori delle risposte allo stress delle piante o per identificare potenziali MSM bioprotettivi da estratti microbici.

Per garantire che il metodo sperimentale funzioni all'interno del sistema di interesse, i ricercatori dovrebbero considerare i seguenti fattori e limitazioni:

Qualità del tessuto fogliare
Assicurati che il tessuto fogliare delle piante non sia stressato prima della raccolta. I segni che le piante sono stressate variano tra specie e specie, ma generalmente includono appassimento, ingiallimento, rossore, macchie, eccessiva arricciatura o rotolamento delle foglie. Il campionamento del tessuto fogliare causa ferite, quindi evitare una macerazione eccessiva del tessuto ridurrà l'errore di fondo dovuto alla manipolazione.

Specie vegetali
Questo protocollo è ottimizzato per l'uso con foglie di orzo e Arabidopsis. Le foglie d'orzo richiedono un tempo di colorazione più lungo per la callosità rispetto a Arabidopsis, probabilmente a causa della cera cuticulare più spessa delle erbe, che aumenta l'idrofobia e limita la diffusione dei trattamenti nella^{foglia 23}. Questo potrebbe anche spiegare parzialmente la mancanza di induzione dell'attività della perossidasi con il nostro metodo, anche se siamo riusciti a osservare la soppressione dell'attività della perossidasi da parte di composti tossici simile a quanto presentato in Arabidopsis (Figura 3). Abbiamo provato ad aumentare il numero di dischi fogliari per campione a 5, regolando il pH a 5, 6 o 7, aumentando il numero di infiltrazioni nel vuoto a 10 e modificando la concentrazione del substrato o cambiando il substrato in guaiacol²⁴. Sebbene abbiamo osservato un aumento dell'attività della perossidasi con più dischi fogliari e cicli di infiltrazione, le differenze tra il controllo negativo e il flg22 sono rimaste piccole (aumento del 10% con flg22) o non significative tra gli esperimenti. Sappiamo che l'orzo risponde a FLG22 inducendo la produzione di ROS, la produzione di callosi e l'espressione^{di perossidasi 25,26}. Nelle radici di mais, gli estratti proteici mostravano attività di perossidasi indotta da MAMP, suggerendo che potrebbe essere necessario estrarre proteine per vedere l'induzione, invece di rilevare l'attività proteica che si risucchia dai dischi fogliari, come avviene nel nostro saggio²⁴. Nel nostro saggio, la ferita induce chiaramente attività di perossidasi nel campione di controllo negativo, perché questa attività scompare quando le cellule muoiono a causa dell'esposizione alla tossina. È possibile che il trattamento FLG22 possa indurre le stesse perossidasi della ferita, così da sembrare che non sia avvenuta alcuna induzione. In alternativa, il nostro saggio potrebbe non essere abbastanza sensibile da rilevare cambiamenti sottili, oppure le perossidasi potrebbero non diffondersi bene nella soluzione.

Per applicare questo protocollo ad altre specie vegetali, suggeriremmo di utilizzare il metodo descritto e includere Arabidopsis come controllo per garantire che il protocollo funzioni. Se l'attività della perossidasi sembra bassa, allora aumentare il numero di dischi fogliari per campione, aumentare il numero di infiltrazioni nel vuoto a 5 o 10 e provare diversi trattamenti, inclusi altri MAMP, ionofori o la tossina T-2, potrebbe ottenere un risultato positivo.

Trattamenti di controllo negativo
Questo metodo dipende da un controllo negativo efficace e appropriato per i confronti. Idealmente, un controllo negativo dovrebbe contenere lo stesso solvente di fondo del trattamento MSM di interesse ma senza MSM. Il solvente di fondo sarebbe acqua o avrebbe lo stesso impatto sull'aria misurata delle tensioni dell'acqua. Questo è un approccio pratico nei casi in cui il MSM è già purificato e può essere sciolto in un solvente preferito. Nel confronto degli estratti microbici, un controllo negativo potrebbe essere il sottoprodotto della purificazione parziale dell'MSM, contenente lo stesso mezzo di fondo ma con una concentrazione ridotta di MSM dopo la frazionazione. Oppure lo sperimentatore potrebbe utilizzare il mezzo di coltura utilizzato per generare l'estratto contenente MSM come controllo negativo. In questi campioni più complessi, il controllo negativo potrebbe contenere sali che gonfiano la misurazione della conducibilità, oppure i solventi possono sopprimere l'attività della perossidasi (Figura 2). Per determinare se i sali influenzano i risultati delle perdite ioniche, l'espertore potrebbe testare la conducibilità del controllo negativo e del campione in assenza di un disco fogliare per determinare se il campione o la foglia stiano generando cambiamenti nella conducibilità. Per determinare se i solventi stanno influenzando le risposte alla perossidasi, l'espertore può aggiungere FLG22 al controllo negativo e confrontare il risultato con FLG22 disciolto in acqua per determinare se c'è differenza. È possibile che solventi, composti colorati o sali in eccesso in un controllo negativo possano oscurare gli effetti dell'MSM sulle risposte allo stress delle piante descritte, e quindi questo approccio non sarà adatto in tutti gli scenari.

Tempo di campionamento
È importante iniziare i trattamenti al mattino, poiché le risposte di difesa indutibili seguono un ciclo circadiano e hanno l'ampiezza più alta nelle prime ore del^{mattino 27}. Secondo la nostra esperienza, Arabidopsis produce perdite ioniche in risposta alla gramillina più velocemente (4 h) rispetto all'orzo e al mais (4-7 h), e quindi potrebbe essere necessario un percorso temporale per stabilire i parametri^{sperimentali 2,28}. La risposta cellulare diminuisce nel tempo e non consiglieremmo di testare le risposte allo stress oltre 30+ ore dopo il trattamento.

Concentrazione
La concentrazione di MSM può avere un impatto non lineare nell'indurre le risposte allo stress delle piante, fenomeno chiamato ormesi²⁰. A seconda della disponibilità e solubilità dell'MSM, idealmente gli sperimentatori testerebbero le risposte allo stress delle piante su una gamma di concentrazioni di MSM. Le concentrazioni tipiche variano tra 100 nM e 1.000 μM come punto di^{partenza 2,11,20}.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido 5-aminosalicilico	Millipore Sigma	A79809
Pompa a vuoto Barnart	Gruppo Artigiano Tecnologico	400-3910
Sonda di microconduttività COND-905	Lazar Research Laboratories Inc.
Peptide FLG22	AnaSpec	AS-62633
Infinite 200PRO F	TeCan Group Ltd.	30190086
Tensiotina	Sigma-Aldrich	S3523
Tossina T-2	Cayman Chemical Company Inc	20433