Articolo metodologico

Definizione e valutazione di un modello murino indotto da estratto idrosolubile di Candida albicans di arterite coronarica associata alla malattia di Kawasaki

DOI:

10.3791/69041

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7 novembre 2025

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1Department of Medical Laboratory, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 2Department of Anesthesiology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 3Department of Pathology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 44Department of Pediatrics, Huai'an First People's Hospital, Huai'an Clinical College of Xuzhou Medical University, 5Department of Pediatrics, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University

In questo articolo

Sommario

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Il modello murino indotto da CAWS simula efficacemente la progressione della malattia di Kawasaki dall'infiammazione acuta alla fibrosi cronica, rivelando caratteristiche patologiche e immunopatologiche chiave e può facilitare lo sviluppo di strategie terapeutiche mirate per la malattia di Kawasaki.

Abstract

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La malattia di Kawasaki (KD) è una vasculite sistemica che colpisce principalmente i bambini, con le lesioni coronariche che sono la complicanza più grave. In questo studio, è stato stabilito un modello di KD murino ottimizzato utilizzando l'estratto idrosolubile di Candida albicans (CAWS). L'infiammazione miocardica e le alterazioni patologiche correlate sono state valutate utilizzando la colorazione HE e la colorazione tricromica di Masson. La tecnica dell'immunofluorescenza ha rilevato l'infiltrazione di cellule immunitarie nel tessuto cardiaco. L'espressione e la localizzazione della proteina VDAC1 nel tessuto miocardico sono state rilevate mediante immunoistochimica. In vitro, è stato stabilito un modello fagocitario mediante co-coltura di macrofagi RAW264.7 con spore di Candida albicans e la formazione e la funzione degli autofagolisomi sono state valutate utilizzando la colorazione in immunofluorescenza LC3 e una sonda Lyso-Tracker Red. Attraverso lo screening della dose, è stato determinato che 8 mg era la dose di modellazione ottimale per indurre l'infiammazione dell'arteria coronarica, con un tasso di mortalità moderato a questa dose. La colorazione HE ha dimostrato che l'iniezione di CAWS induce stabilmente lesioni coronariche coerenti con le caratteristiche della malattia di Kawasaki umana nei topi. La colorazione di Masson ha confermato che c'era una significativa deposizione di fibre di collagene intorno alle arterie coronarie e all'aorta nel gruppo di topi CAWS, che coincideva strettamente con l'area infiammatoria, e una differenza statisticamente significativa è stata osservata dal gruppo di controllo a 14 giorni (p < 0,001). L'immunofluorescenza ha rivelato che, al 14° giorno di modellazione, l'infiltrazione di più cellule immunitarie nel tessuto cardiaco del gruppo CAWS era aumentata significativamente (p < 0,001). I risultati immunoistochimici hanno mostrato che, al 28° giorno di modellazione, l'espressione della proteina VDAC1 nel tessuto miocardico del gruppo CAWS era significativamente sovraregolata (p < 0,001). Esperimenti in vitro hanno dimostrato che nei macrofagi infettati con spore di Candida albicans , la formazione di autofagolisosomi aumenta nella fase iniziale, mentre il flusso autofagico è bloccato nella fase successiva, suggerendo un disturbo funzionale.

Introduzione

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La malattia di Kawasaki (KD), una forma di sindrome dei linfonodi mucocutanei, è una malattia autoimmune che si verifica nei bambini di età inferiore ai 5 anni ed è accompagnata da vasculite febbrile 1,2,3. Gli studi indicano che i cicli di trattamento non trattati o superiori a 10 giorni di KD grave sono inclini a indurre gravi complicanze cardiovascolari, tra cui principalmente aneurismi coronarici e stenosi dell'arteria coronarica 4,5. La rottura degli aneurismi coronarici può portare a shock cardiogeno o addirittura alla morte improvvisa, che è la principale causa di cardiopatia acquisita nei bambini 6,7. Sebbene l'applicazione di immunoglobuline per via endovenosa abbia migliorato significativamente la prognosi, la sua eziologia e patogenesi rimangono poco chiare, il che limita lo sviluppo di strategie terapeutiche mirate 8,9. Pertanto, la creazione di modelli animali in grado di simulare accuratamente le caratteristiche delle malattie umane è diventata una necessità urgente per la ricerca attuale.

Attualmente, uno dei principali ostacoli nella ricerca sulla malattia di Kawasaki è l'assenza di modelli animali ben caratterizzati che ricapitolino completamente la patologia della malattia umana. Tra i vari modelli sviluppati ora, il modello di vasculite indotta dall'estratto della parete cellulare di Lactobacillus casei (LCWE) è un sistema relativamente maturo e questo modello può causare arterite coronarica. È ampiamente utilizzato per studiare il meccanismo della disregolazione immunitaria e le citochine specifiche nelle vasculite KD-like10,11. Anche il modello di vasculite indotta dall'estratto idrosolubile di Candida albicans (CAWS) ha attirato molta attenzione a causa della sua elevata somiglianza con le caratteristiche patologiche della malattia di Kawasaki umana12,13. Dopo l'ottimizzazione e il miglioramento sistematici da parte di diversi team di ricerca, il modello indotto da CAWS si è sviluppato in uno strumento importante per la ricerca sulla malattia di Kawasaki14. Sebbene la CAWS possa indurre l'infiammazione dell'arteria coronarica tramite iniezione intraperitoneale, ha dei limiti in quanto non può riprodurre completamente l'esatto processo patologico della vasculite KD umana. Ad esempio, non sono stati trovati neutrofili nella patologia tardiva della KD15 umana, ma l'infiltrazione dei neutrofili si è verificata ancora in questo modello fino a 16 settimane dopo l'iniezione di CAWS16. Inoltre, il meccanismo della vasculite causata dalla CAWS non è stato completamente chiarito al momento, il che limita la comprensione e l'applicazione approfondita del modello9. Questo studio mira a stabilire un modello animale standardizzato di KD ottimizzando il protocollo di induzione di CAWS, chiarendo il meccanismo della malattia e facilitando lo sviluppo di terapie mirate.

Questo studio ha utilizzato CAWS per stabilire un modello animale più standardizzato della malattia di Kawasaki. Attraverso esperimenti sistematici di ottimizzazione della dose, è stato determinato che l'iniezione intraperitoneale di 8 mg al giorno per cinque giorni consecutivi era il regime di somministrazione ottimale. Questo regime può indurre stabilmente lesioni coronariche mantenendo un alto tasso di sopravvivenza negli animali. Inoltre, abbiamo ulteriormente esplorato il ruolo della disfunzione mitocondriale nella formazione della fibrosi durante la fase cronica della KD, con particolare attenzione al possibile meccanismo del canale anionico voltaggio-dipendente 1 (VDAC1), una proteina chiave che regola l'apoptosi mitocondriale, durante la transizione dall'infiammazione alla fibrosi17. Vale la pena notare che, attraverso l'analisi di co-localizzazione autofagosoma/lisosoma in questo studio, in questo modello è stata osservata una funzione autofagica anormale. Questo modello ottimizzato fornisce uno strumento importante per studiare sistematicamente la patogenesi delle lesioni coronariche nella malattia di Kawasaki e valutare nuove strategie di trattamento.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti di ricerca che coinvolgono dati sugli animali sono stati approvati dal comitato etico dell'Ospedale del Popolo Affiliato Huai'an No.1 dell'Università di Medicina di Nanchino (KY-2024-250-01). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del CAWS

  1. Inoculare la Candida albicans nel brodo di destrosio Sabouraud secondo il protocollo stabilito da Duong et al.18. Quindi, coltivare il brodo inoculato in modo anaerobico a 37 °C per 48 ore in una camera anaerobica sigillata con una miscela di gas.
    NOTA: Per garantire la sterilità del terreno di coltura, la condizione di coltura anaerobica a 37 °C deve essere rigorosamente controllata per evitare la contaminazione da batteri vari.
  2. Sciacquare ripetutamente con un mezzo C-limitante e incubare a 37 °C per 48 ore a una velocità di rotazione di 4,5 x g.
  3. Aggiungere un volume uguale di etanolo anidro e lasciare riposare per una notte a 4 °C.
  4. Centrifugare a 4,5 x g per 15 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante, aggiungere un volume uguale di etanolo anidro al precipitato e lasciarlo per una notte a 4 °C.
  5. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante, aggiungere 50 ml di acetone al precipitato, centrifugare e asciugare il precipitato. Sciogliere il precipitato in soluzione fisiologica sterile per un uso successivo.

2. Costruzione di un modello murino della malattia di Kawasaki

  1. Seleziona ottanta topi maschi C57BL/6 di grado SPF di età compresa tra 4 e 6 settimane e ospitali in condizioni controllate con libero accesso a cibo e acqua.
    NOTA: Per ridurre al minimo la potenziale interferenza delle fluttuazioni del livello di estrogeni sulle risposte immunitarie e infiammatorie, in questo studio preliminare di definizione e caratterizzazione del modello sono stati utilizzati solo topi maschi19.
  2. Dividi i topi in 4 gruppi in modo uniforme con il metodo della tabella dei numeri casuali, inclusi 3 gruppi di iniezione CAWS a dose diversa (4 mg, 8 mg, 12 mg) e 1 gruppo di controllo con soluzione salina normale, con 20 topi in ciascun gruppo.
  3. Preparare la polvere di CAWS in tre concentrazioni di 40 mg/mL, 80 mg/mL e 120 mg/mL utilizzando soluzione fisiologica sterile (0,9% NaCl). Iniettare al gruppo sperimentale 0,1 mL di CAWS al mattino dal 1° al 5° giorno dell'esperimento e somministrare un volume uguale di soluzione fisiologica normale al gruppo di controllo secondo lo stesso programma.
    NOTA: L'iniezione intraperitoneale è stata eseguita utilizzando una siringa da insulina da 1 ml. Durante l'operazione, posizionare il topo con la testa più bassa e la coda più alta per evitare danni a organi come l'intestino crasso e tenue quando la siringa è inserita.
  4. Utilizza una bilancia elettronica alle 9 del mattino di ogni giorno per pesare contemporaneamente il mangime rimanente nella mangiatoia e calcolare il consumo di cibo nelle 24 ore per ogni gabbia di topi.
  5. Il 3°, 7°, 14° e 28° giorno dopo l'ultima iniezione, seleziona e sacrifica casualmente 3 topi da ciascun gruppo in ogni momento.
  6. Metti i topi in una camera chiusa preriempita con aria ambiente. Introdurre CO2 compressa a una velocità di flusso del 30% del volume della camera al minuto. Dopo 5 minuti, è stata eseguita la lussazione cervicale per confermare la morte.
  7. Raccogli e pesa i campioni di cuore. Osservare le lesioni infiammatorie del cuore e dei vasi sanguigni mediante colorazione HE.

3. Standard di colorazione e classificazione HE

  1. Il cuore e l'arco aortico (circa 3 mm × 3 mm) sono stati rapidamente isolati. Eseguire una sternotomia mediana secondo il metodo descritto20. Separare rapidamente il cuore dall'arco aortico (circa 3 mm × 3 mm). I tessuti raccolti sono stati fissati in formalina tamponata neutra al 10% per 24 ore.
  2. Dopo la fissazione, disidratare i tessuti attraverso una serie di etanolo graduato (etanolo al 70% per 1 ora, etanolo all'80% per 1 ora, etanolo al 95% per 1 ora ed etanolo al 100% per 1 ora), limpido in xilene e incorporato in paraffina. Infine, sezionare i blocchi in fette continue di 5 μm.
  3. Per la colorazione H&E, colorare le sezioni con ematossilina per 5 minuti, sciacquare in acqua corrente per 10 minuti, controcolorare con eosina per 2 minuti, quindi procedere con la disidratazione e il montaggio21.
    NOTA: In base al grado di lesione intimale vascolare, è classificato in tre gradi: Il grado I è caratterizzato principalmente da gonfiore endoteliale e aggregazione di neutrofili; Il grado II si manifesta come degenerazione della muscolatura liscia, infiltrazione di cellule infiammatorie e danno agli organelli; Il grado III si presenta con lesioni gravi come necrosi endoteliale e deposizione di fibrina.

4. Colorazione tricromica Masson

  1. Dopo la fissazione, disidratare i campioni di tessuto attraverso una serie di etanolo graduato, limpido in xilene e incorporato in paraffina.
  2. Dopo la deceratura, idratare le sezioni attraverso una serie di etanolo graduato in acqua distillata in preparazione per la colorazione.
  3. Colorare i nuclei con l'ematossilina di ferro di Weigert per 5 minuti, sciacquare abbondantemente sotto l'acqua corrente, quindi colorare il citoplasma con Lichun Red acid fuchsin per 5 minuti.
  4. Differenziare con acido fosfomolibdico all'1% per 1 minuto, quindi colorare direttamente le fibre di collagene con blu anilina per 3 minuti. Risciacquare rapidamente con acido acetico glaciale all'1%.
    NOTA: Controllare rigorosamente i tempi della fase di differenziazione per garantire la specificità della colorazione.
  5. Dopo la disidratazione con etanolo e xilene, diventando trasparente, sigillare il film neutro.
  6. Sciacquare le sezioni macchiate sotto l'acqua corrente per rimuovere la tintura in eccesso.
  7. Disidratare le sezioni attraverso una serie di etanolo graduato, limpido in xilene, e montare con gomma neutra.
  8. Osservare le sezioni al microscopio ottico con un ingrandimento costante. Le fibre di collagene dovrebbero apparire blu, le fibre muscolari e il citoplasma rossi e i nuclei blu intenso.

5. Colorazione in immunofluorescenza

  1. Fissare sezioni cellulari o di tessuto e bloccare con il 5% di BSA per 1 ora per ridurre il legame aspecifico.
  2. Utilizzare un siero normale della stessa specie di origine dell'anticorpo secondario, diluirlo con PBS in un rapporto di 1:10 e lasciarlo cadere sul campione. Sigillare a temperatura ambiente per 30 min. Dopo la sigillatura, risciacquare delicatamente due volte con PBS.
  3. Incubare le sezioni con l'anticorpo primario per una notte a 4 °C. Dopo il lavaggio con PBS, aggiungere l'anticorpo secondario fluorescente e incubare al buio per 1 ora.
  4. Colorazione del nucleo con DAPI, sigillatura con agente di montaggio anti-quenching e osservazione al microscopio confocale.

6. Immunoistochimica

  1. Dopo la deceratura e l'idratazione delle sezioni di paraffina, eseguire la riparazione dell'antigene e bloccare la perossidasi endogena.
  2. Incubazione degli anticorpi e sviluppo del colore: in primo luogo, bloccare con il siero normale, quindi incubare in sequenza l'anticorpo primario e l'anticorpo secondario marcato con HRP e, infine, lo sviluppo del colore DAB. Controllare il grado di reazione al microscopio.
  3. Colorare nuovamente i nuclei cellulari con ematossilina. Dopo la disidratazione e la trasparenza, sigillare le piastre e osservare al microscopio il segnale positivo giallo-brunastro.
    NOTA: L'esperimento deve impostare dei controlli e controllare rigorosamente le condizioni per il restauro e lo sviluppo del colore.

7. Rilevamento dell'autolisosoma

  1. Co-coltura di macrofagi RAW264.7 con spore di Candida albicans in una proporzione appropriata (10:1) e incubazione a 37 °C e 5% di CO2 per 4 ore, 8 ore, 12 ore, 16 ore, 20 ore, 24 ore, 28 ore, 32 ore, 36 ore, 40 ore, 44 ore e 48 ore per stabilire un modello fagocitico.
  2. Lavare tre volte con PBS pre-raffreddato per rimuovere le spore non fagocitarie.
  3. Innanzitutto, bloccare i campioni con il 5% di BSA per 30 minuti. Quindi, incubare successivamente con l'anticorpo primario contro LC3 (diluizione 1:200) a temperatura ambiente per 1 ora, seguito dall'anticorpo secondario marcato con Alexa Fluor 488 a temperatura ambiente per 30 minuti.
  4. Aggiungere la sonda lisosomiale Lyso-Tracker Red direttamente alle cellule per visualizzare la localizzazione lisosomiale. Infine, controcolorare i nuclei con DAPI (1 μg/mL) per 5 min.
    NOTA: L'intero processo operativo deve essere eseguito al buio per garantire che il tempo di incubazione e la concentrazione dell'anticorpo siano accuratamente controllati.

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Risultati

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Inizialmente, abbiamo valutato sistematicamente i cambiamenti patologici miocardici indotti da diverse dosi di CAWS nei topi. Non sono stati osservati decessi nel gruppo di controllo PBS, nel gruppo CAWS da 4 mg e nel gruppo CAWS da 8 mg (n=20 in ciascun gruppo). Al contrario, la risposta infiammatoria nel gruppo da 4 mg è stata lieve e non ha soddisfatto i requisiti del modello. Il tasso di mortalità è stato più alto nel gruppo CAWS da 12 mg (9/20, 45%) ...

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Discussione

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Gli aneurismi dell'arteria coronarica (CAA) e la fibrosi miocardica nella KD sono le principali cause di eventi cardiovascolari a lungo termine. Nonostante i progressi compiuti nel trattamento in fase acuta, circa il 5% dei pazienti sviluppa ancora CAA persistente28,29. Il meccanismo di questo cambiamento patologico ritardato non è ancora chiaro e c'è un urgente bisogno di modelli animali per rivelare il suo processo dinamico

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Grazie ai membri del team per il loro sostegno e contributo a questo esperimento. La ricerca è stata supportata dai seguenti progetti: Progetto generale del Fondo di sviluppo dell'ospedale affiliato all'Università medica di Xuzhou (XYFM202234) e Progetto Soft specializzato in scienze naturali sulla vita e la salute della città di Huai'an (2023KX0006).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
un anticorpo secondario di capra contro Rabbit IgG Alexa Fluor 488abcamab15081un anticorpo secondario di capra contro Rabbit IgG Alexa Fluor 488
Camera anaerobicaThermo ScientificThermo ScientificCamera anaerobica
Blu anilinaSolarbioG3668Blu anilina
anti-LC3abcamab192890l'anticorpo primario contro LC3
Cabinet di sicurezza biologicaThermo Scientific1500Cabinet di sicurezza biologica
BSASolarbioA8020BSA
Candida albicans (ceppo)NBRC1385Candida albicans (ceppo)
CD3eBD in Biologia561827FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11)
CD86BD in Biologia105013CD86
CD8aBD in Biologia100713CD8a
Incubatore per colture cellulariThermo Scientific311Incubatore per colture cellulari
CentrifugaThermo ScientificST4R PlusCentrifuga
Microscopio confocaleOlimpoIX73Microscopio confocale
DAPIBeyotime Biotechnology P0131-25mlDAPI
DMEMGibco11965126DMEM
Macchina di incorporamentoP.S.J MEDICALBM450AMacchina di incorporamento
EosinaSolarbio  G1100Eosina
F4/80BD in Biologia123109F4/80
FBSGibco16000044FBS
FormaldeideSolarbio  P1110Formaldeide
Disidratatore di tessuti completamente automaticoLeica BiosystemsASP3005Disidratatore di tessuti completamente automatico
Vetri per microscopio in vetroCitotest250124A1Vetri per microscopio in vetro
H& Tinta EBeyotime Biotechnology C0105MH& Tinta E
IHC KitBiotecnologia dell'Assinoabs996-5mlIHC Kit
Sonda LC3Beyotime Biotechnology C3018MSonda LC3
Lame microtomi a profilo bassoThermo Fisher3052835Lame microtomi a profilo basso
Sonda lisosomicaBeyotime Biotechnology C1046Sonda lisosomica
MarcatoreDeliSK109Marcatore
Colorante MassonBeyotime Biotechnology C0189MColorante Masson
MicrotomoLeica BiosystemsHistoCore BIOCUTMicrotomo
Gomma neutraSolarbi  G8590Gomma neutra
NK1.1BD in Biologia561117NK1.1
Microscopio otticoNikonNikonMicroscopio ottico
ParaffinaSolarbio  YA0012Paraffina
ParaffinaSolarbioYA0012Paraffina
PBSSolarbioP1020PBS
Acido fosfomolibdicoSolarbioG3472Acido fosfomolibdico
VDAC1Abcamab34726Anti-VDAC1

Riferimenti

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