Definizione e valutazione di un modello murino indotto da estratto idrosolubile di Candida albicans di arterite coronarica associata alla malattia di Kawasaki

La malattia di Kawasaki (KD), una forma di sindrome dei linfonodi mucocutanei, è una malattia autoimmune che si verifica nei bambini di età inferiore ai 5 anni ed è accompagnata da vasculite febbrile ^1,2,3. Gli studi indicano che i cicli di trattamento non trattati o superiori a 10 giorni di KD grave sono inclini a indurre gravi complicanze cardiovascolari, tra cui principalmente aneurismi coronarici e stenosi dell'arteria coronarica ^4,5. La rottura degli aneurismi coronarici può portare a shock cardiogeno o addirittura alla morte improvvisa, che è la principale causa di cardiopatia acquisita nei bambini ^6,7. Sebbene l'applicazione di immunoglobuline per via endovenosa abbia migliorato significativamente la prognosi, la sua eziologia e patogenesi rimangono poco chiare, il che limita lo sviluppo di strategie terapeutiche mirate ^8,9. Pertanto, la creazione di modelli animali in grado di simulare accuratamente le caratteristiche delle malattie umane è diventata una necessità urgente per la ricerca attuale.

Attualmente, uno dei principali ostacoli nella ricerca sulla malattia di Kawasaki è l'assenza di modelli animali ben caratterizzati che ricapitolino completamente la patologia della malattia umana. Tra i vari modelli sviluppati ora, il modello di vasculite indotta dall'estratto della parete cellulare di Lactobacillus casei (LCWE) è un sistema relativamente maturo e questo modello può causare arterite coronarica. È ampiamente utilizzato per studiare il meccanismo della disregolazione immunitaria e le citochine specifiche nelle vasculite KD-like^10,11. Anche il modello di vasculite indotta dall'estratto idrosolubile di Candida albicans (CAWS) ha attirato molta attenzione a causa della sua elevata somiglianza con le caratteristiche patologiche della malattia di Kawasaki umana^12,13. Dopo l'ottimizzazione e il miglioramento sistematici da parte di diversi team di ricerca, il modello indotto da CAWS si è sviluppato in uno strumento importante per la ricerca sulla malattia di Kawasaki¹⁴. Sebbene la CAWS possa indurre l'infiammazione dell'arteria coronarica tramite iniezione intraperitoneale, ha dei limiti in quanto non può riprodurre completamente l'esatto processo patologico della vasculite KD umana. Ad esempio, non sono stati trovati neutrofili nella patologia tardiva della KD¹⁵ umana, ma l'infiltrazione dei neutrofili si è verificata ancora in questo modello fino a 16 settimane dopo l'iniezione di CAWS¹⁶. Inoltre, il meccanismo della vasculite causata dalla CAWS non è stato completamente chiarito al momento, il che limita la comprensione e l'applicazione approfondita del modello⁹. Questo studio mira a stabilire un modello animale standardizzato di KD ottimizzando il protocollo di induzione di CAWS, chiarendo il meccanismo della malattia e facilitando lo sviluppo di terapie mirate.

Questo studio ha utilizzato CAWS per stabilire un modello animale più standardizzato della malattia di Kawasaki. Attraverso esperimenti sistematici di ottimizzazione della dose, è stato determinato che l'iniezione intraperitoneale di 8 mg al giorno per cinque giorni consecutivi era il regime di somministrazione ottimale. Questo regime può indurre stabilmente lesioni coronariche mantenendo un alto tasso di sopravvivenza negli animali. Inoltre, abbiamo ulteriormente esplorato il ruolo della disfunzione mitocondriale nella formazione della fibrosi durante la fase cronica della KD, con particolare attenzione al possibile meccanismo del canale anionico voltaggio-dipendente 1 (VDAC1), una proteina chiave che regola l'apoptosi mitocondriale, durante la transizione dall'infiammazione alla fibrosi¹⁷. Vale la pena notare che, attraverso l'analisi di co-localizzazione autofagosoma/lisosoma in questo studio, in questo modello è stata osservata una funzione autofagica anormale. Questo modello ottimizzato fornisce uno strumento importante per studiare sistematicamente la patogenesi delle lesioni coronariche nella malattia di Kawasaki e valutare nuove strategie di trattamento.

Tutti gli esperimenti di ricerca che coinvolgono dati sugli animali sono stati approvati dal comitato etico dell'Ospedale del Popolo Affiliato Huai'an No.1 dell'Università di Medicina di Nanchino (KY-2024-250-01). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del CAWS

1. Inoculare la Candida albicans nel brodo di destrosio Sabouraud secondo il protocollo stabilito da Duong et ^al.18. Quindi, coltivare il brodo inoculato in modo anaerobico a 37 °C per 48 ore in una camera anaerobica sigillata con una miscela di gas.
   NOTA: Per garantire la sterilità del terreno di coltura, la condizione di coltura anaerobica a 37 °C deve essere rigorosamente controllata per evitare la contaminazione da batteri vari.
2. Sciacquare ripetutamente con un mezzo C-limitante e incubare a 37 °C per 48 ore a una velocità di rotazione di 4,5 x g.
3. Aggiungere un volume uguale di etanolo anidro e lasciare riposare per una notte a 4 °C.
4. Centrifugare a 4,5 x g per 15 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante, aggiungere un volume uguale di etanolo anidro al precipitato e lasciarlo per una notte a 4 °C.
5. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante, aggiungere 50 ml di acetone al precipitato, centrifugare e asciugare il precipitato. Sciogliere il precipitato in soluzione fisiologica sterile per un uso successivo.

2. Costruzione di un modello murino della malattia di Kawasaki

1. Seleziona ottanta topi maschi C57BL/6 di grado SPF di età compresa tra 4 e 6 settimane e ospitali in condizioni controllate con libero accesso a cibo e acqua.
   NOTA: Per ridurre al minimo la potenziale interferenza delle fluttuazioni del livello di estrogeni sulle risposte immunitarie e infiammatorie, in questo studio preliminare di definizione e caratterizzazione del modello sono stati utilizzati solo topi maschi¹⁹.
2. Dividi i topi in 4 gruppi in modo uniforme con il metodo della tabella dei numeri casuali, inclusi 3 gruppi di iniezione CAWS a dose diversa (4 mg, 8 mg, 12 mg) e 1 gruppo di controllo con soluzione salina normale, con 20 topi in ciascun gruppo.
3. Preparare la polvere di CAWS in tre concentrazioni di 40 mg/mL, 80 mg/mL e 120 mg/mL utilizzando soluzione fisiologica sterile (0,9% NaCl). Iniettare al gruppo sperimentale 0,1 mL di CAWS al mattino dal 1° al 5° giorno dell'esperimento e somministrare un volume uguale di soluzione fisiologica normale al gruppo di controllo secondo lo stesso programma.
   NOTA: L'iniezione intraperitoneale è stata eseguita utilizzando una siringa da insulina da 1 ml. Durante l'operazione, posizionare il topo con la testa più bassa e la coda più alta per evitare danni a organi come l'intestino crasso e tenue quando la siringa è inserita.
4. Utilizza una bilancia elettronica alle 9 del mattino di ogni giorno per pesare contemporaneamente il mangime rimanente nella mangiatoia e calcolare il consumo di cibo nelle 24 ore per ogni gabbia di topi.
5. Il 3°, 7°, 14° e 28° giorno dopo l'ultima iniezione, seleziona e sacrifica casualmente 3 topi da ciascun gruppo in ogni momento.
6. Metti i topi in una camera chiusa preriempita con aria ambiente. Introdurre CO₂ compressa a una velocità di flusso del 30% del volume della camera al minuto. Dopo 5 minuti, è stata eseguita la lussazione cervicale per confermare la morte.
7. Raccogli e pesa i campioni di cuore. Osservare le lesioni infiammatorie del cuore e dei vasi sanguigni mediante colorazione HE.

3. Standard di colorazione e classificazione HE

1. Il cuore e l'arco aortico (circa 3 mm × 3 mm) sono stati rapidamente isolati. Eseguire una sternotomia mediana secondo il metodo descritto²⁰. Separare rapidamente il cuore dall'arco aortico (circa 3 mm × 3 mm). I tessuti raccolti sono stati fissati in formalina tamponata neutra al 10% per 24 ore.
2. Dopo la fissazione, disidratare i tessuti attraverso una serie di etanolo graduato (etanolo al 70% per 1 ora, etanolo all'80% per 1 ora, etanolo al 95% per 1 ora ed etanolo al 100% per 1 ora), limpido in xilene e incorporato in paraffina. Infine, sezionare i blocchi in fette continue di 5 μm.
3. Per la colorazione H&E, colorare le sezioni con ematossilina per 5 minuti, sciacquare in acqua corrente per 10 minuti, controcolorare con eosina per 2 minuti, quindi procedere con la disidratazione e il montaggio²¹.
   NOTA: In base al grado di lesione intimale vascolare, è classificato in tre gradi: Il grado I è caratterizzato principalmente da gonfiore endoteliale e aggregazione di neutrofili; Il grado II si manifesta come degenerazione della muscolatura liscia, infiltrazione di cellule infiammatorie e danno agli organelli; Il grado III si presenta con lesioni gravi come necrosi endoteliale e deposizione di fibrina.

4. Colorazione tricromica Masson

1. Dopo la fissazione, disidratare i campioni di tessuto attraverso una serie di etanolo graduato, limpido in xilene e incorporato in paraffina.
2. Dopo la deceratura, idratare le sezioni attraverso una serie di etanolo graduato in acqua distillata in preparazione per la colorazione.
3. Colorare i nuclei con l'ematossilina di ferro di Weigert per 5 minuti, sciacquare abbondantemente sotto l'acqua corrente, quindi colorare il citoplasma con Lichun Red acid fuchsin per 5 minuti.
4. Differenziare con acido fosfomolibdico all'1% per 1 minuto, quindi colorare direttamente le fibre di collagene con blu anilina per 3 minuti. Risciacquare rapidamente con acido acetico glaciale all'1%.
   NOTA: Controllare rigorosamente i tempi della fase di differenziazione per garantire la specificità della colorazione.
5. Dopo la disidratazione con etanolo e xilene, diventando trasparente, sigillare il film neutro.
6. Sciacquare le sezioni macchiate sotto l'acqua corrente per rimuovere la tintura in eccesso.
7. Disidratare le sezioni attraverso una serie di etanolo graduato, limpido in xilene, e montare con gomma neutra.
8. Osservare le sezioni al microscopio ottico con un ingrandimento costante. Le fibre di collagene dovrebbero apparire blu, le fibre muscolari e il citoplasma rossi e i nuclei blu intenso.

5. Colorazione in immunofluorescenza

1. Fissare sezioni cellulari o di tessuto e bloccare con il 5% di BSA per 1 ora per ridurre il legame aspecifico.
2. Utilizzare un siero normale della stessa specie di origine dell'anticorpo secondario, diluirlo con PBS in un rapporto di 1:10 e lasciarlo cadere sul campione. Sigillare a temperatura ambiente per 30 min. Dopo la sigillatura, risciacquare delicatamente due volte con PBS.
3. Incubare le sezioni con l'anticorpo primario per una notte a 4 °C. Dopo il lavaggio con PBS, aggiungere l'anticorpo secondario fluorescente e incubare al buio per 1 ora.
4. Colorazione del nucleo con DAPI, sigillatura con agente di montaggio anti-quenching e osservazione al microscopio confocale.

6. Immunoistochimica

1. Dopo la deceratura e l'idratazione delle sezioni di paraffina, eseguire la riparazione dell'antigene e bloccare la perossidasi endogena.
2. Incubazione degli anticorpi e sviluppo del colore: in primo luogo, bloccare con il siero normale, quindi incubare in sequenza l'anticorpo primario e l'anticorpo secondario marcato con HRP e, infine, lo sviluppo del colore DAB. Controllare il grado di reazione al microscopio.
3. Colorare nuovamente i nuclei cellulari con ematossilina. Dopo la disidratazione e la trasparenza, sigillare le piastre e osservare al microscopio il segnale positivo giallo-brunastro.
   NOTA: L'esperimento deve impostare dei controlli e controllare rigorosamente le condizioni per il restauro e lo sviluppo del colore.

7. Rilevamento dell'autolisosoma

1. Co-coltura di macrofagi RAW264.7 con spore di Candida albicans in una proporzione appropriata (10:1) e incubazione a 37 °C e 5% di CO₂ per 4 ore, 8 ore, 12 ore, 16 ore, 20 ore, 24 ore, 28 ore, 32 ore, 36 ore, 40 ore, 44 ore e 48 ore per stabilire un modello fagocitico.
2. Lavare tre volte con PBS pre-raffreddato per rimuovere le spore non fagocitarie.
3. Innanzitutto, bloccare i campioni con il 5% di BSA per 30 minuti. Quindi, incubare successivamente con l'anticorpo primario contro LC3 (diluizione 1:200) a temperatura ambiente per 1 ora, seguito dall'anticorpo secondario marcato con Alexa Fluor 488 a temperatura ambiente per 30 minuti.
4. Aggiungere la sonda lisosomiale Lyso-Tracker Red direttamente alle cellule per visualizzare la localizzazione lisosomiale. Infine, controcolorare i nuclei con DAPI (1 μg/mL) per 5 min.
   NOTA: L'intero processo operativo deve essere eseguito al buio per garantire che il tempo di incubazione e la concentrazione dell'anticorpo siano accuratamente controllati.

Inizialmente, abbiamo valutato sistematicamente i cambiamenti patologici miocardici indotti da diverse dosi di CAWS nei topi. Non sono stati osservati decessi nel gruppo di controllo PBS, nel gruppo CAWS da 4 mg e nel gruppo CAWS da 8 mg (n=20 in ciascun gruppo). Al contrario, la risposta infiammatoria nel gruppo da 4 mg è stata lieve e non ha soddisfatto i requisiti del modello. Il tasso di mortalità è stato più alto nel gruppo CAWS da 12 mg (9/20, 45%) e i decessi si sono verificati dal 3° al 10° giorno dopo l'iniezione. Questi risultati suggeriscono che una dose di 12 mg può causare un danno infiammatorio locale eccessivo e tossicità sistemica. Pertanto, questa dose è stata esclusa dagli studi successivi. La dose da 8 mg è stata infine selezionata come regime posologico ottimale perché potrebbe indurre efficacemente un'arterite coronarica significativa mantenendo un tasso di sopravvivenza accettabile e reazioni avverse locali minime. (Figura 1A). Alla fine, è stato determinato che l'iniezione intraperitoneale di 8 mg di CAWS era la dose ottimale per il modello. I risultati della colorazione HE del gruppo sperimentale hanno mostrato un tipico processo dinamico di infiammazione e fibrosi. Il terzo giorno si è verificata un'infiltrazione infiammatoria focale, composta principalmente da neutrofili perivascolari e monociti. Entro il settimo giorno, il range infiammatorio si è espanso all'interstizio miocardico, accompagnato da un significativo gonfiore delle cellule miocardiche ed edema interstiziale. Il 14 ° giorno, l'infiammazione ha raggiunto il suo picco e si sono verificati disturbi della disposizione delle fibre miocardiche e necrosi focale. Il 28° giorno, sebbene l'infiammazione fosse alleviata, si era formata una fibrosi precoce (Figura 1B e Figura 2A). Al contrario, la struttura miocardica è rimasta normale in tutti i punti temporali nel gruppo di controllo. Tutti i risultati sono stati confermati attraverso una valutazione in doppio cieco, che ha verificato che una dose di CAWS di 8 mg potrebbe indurre stabilmente un modello di danno miocardico coerente con le caratteristiche della malattia di Kawasaki.

Successivamente, è stato impiegato il metodo di colorazione tricolore di Masson per studiare se la vasculite simile alla malattia di Kawasaki indotta da CAWS provocasse una fibrosi persistente che circonda le arterie coronarie (CA). I risultati sperimentali hanno mostrato che nel gruppo di topi con iniezione CAWS, evidenti depositi di fibre di collagene sono stati rilevati intorno alle pareti delle arterie coronarie infiammate e dell'aorta, e queste aree fibrotiche coincidevano altamente con le posizioni di distribuzione dell'infiltrazione delle cellule infiammatorie. Al contrario, i topi nel gruppo di controllo PBS hanno mostrato solo una debole colorazione del collagene, che era confinata all'interno del normale intervallo strutturale della parete vascolare (Figura 2A). L'analisi quantitativa ha mostrato che la deposizione significativa di fibre di collagene si è verificata a 14 giorni e il grado di fibrosi era statisticamente diverso da quello del gruppo di controllo (Figura 2C).

Dato che il cambiamento patologico centrale nella malattia di Kawasaki è la risposta immuno-infiammatoria della parete vascolare, che coinvolge l'azione coordinata di più cellule immunitarie22,23, abbiamo successivamente esplorato i cambiamenti caratteristici del microambiente immunitario nel modello CAWS attraverso la colorazione in immunofluorescenza (IF). Il 14° giorno dopo l'iniezione di CAWS, è stata eseguita la colorazione IF dei marcatori delle cellule immunitarie sui tessuti cardiaci dei topi iniettati con CAWS. I risultati sperimentali hanno mostrato che al 14° giorno di modellazione per i topi nel gruppo di trattamento CAWS, l'infiltrazione di cellule T CD3+, cellule T citotossiche CD8+, macrofagi di tipo M1 CD86+, macrofagi F4/80+ e cellule natural killer NK1.1+ nelle arterie coronarie e nei tessuti miocardici è stata significativamente aumentata rispetto al gruppo di controllo PBS (Figura 2B,D). Analizzando sistematicamente i cambiamenti di espressione di questi marcatori immunitari, non solo ha verificato che il modello CAWS poteva simulare accuratamente le caratteristiche immunologiche della malattia di Kawasaki umana, ma soprattutto, ha rivelato il possibile meccanismo di diversi sottogruppi di cellule immunitarie nell'insorgenza e nello sviluppo della malattia, fornendo una base teorica per il successivo sviluppo di strategie di intervento immunitario mirate.

La ricerca ha stabilito che la disfunzione mitocondriale è un meccanismo chiave alla base della fibrosi miocardica 24,25,26. È noto che in condizioni di stress infiammatorio, il canale anionico voltaggio-dipendente 1 (VDAC1), una proteina critica per il controllo della qualità mitocondriale, può innescare un'apertura anomala dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTP) quando la sua espressione è sovraregolata. Questo, a sua volta, induce l'apoptosi e attiva i fibroblasti17,27. Per esplorare questo meccanismo, abbiamo valutato l'espressione di VDAC1 nella fase cronica utilizzando l'immunoistochimica. I nostri risultati hanno rivelato che, rispetto al gruppo di controllo PBS, l'espressione della proteina VDAC1 nel tessuto miocardico dei topi nel gruppo trattato con CAWS era significativamente elevata 28 giorni dopo la modellazione (Figura 3). I segnali positivi erano prevalentemente localizzati nelle aree fibrotiche e intorno ai vasi sanguigni, indicando che la disfunzione mitocondriale mediata da VDAC1 può contribuire alla fibrosi miocardica nel modello di malattia di Kawasaki. Questi dati forniscono prove sperimentali riguardo ai meccanismi molecolari del danno miocardico indotto da CAWS.

Studi precedenti hanno scoperto che la disfunzione mitocondriale mediata da VDAC1 è coinvolta nel processo di fibrosi miocardica della malattia di Kawasaki, ma il suo meccanismo specifico non è stato ancora chiarito. Premesso che il mantenimento dell'omeostasi mitocondriale dipende dalla normale funzione del sistema autofagia-lisosomiale. Ipotizziamo che VDAC1 possa esacerbare la fibrosi influenzando la formazione o la funzione degli autofagolisomi, portando a un accumulo mitocondriale anormale. Per verificare questa ipotesi, abbiamo prima stabilito un modello di infezione da spore di Candida albicans nei macrofagi (RAW264.7) (Figura 4) e abbiamo rilevato i cambiamenti dinamici del flusso autofagico e dell'attività lisosomiale nel modello. I risultati sperimentali mostrano che la formazione di lisosomi autofagici aumenta nella fase iniziale (entro 2-3 ore dall'infezione cellulare), mentre il flusso autofagico viene bloccato nella fase successiva (3-4 ore dopo l'infezione cellulare). Il cambiamento del flusso autofagico può essere valutato dal cambiamento della colorazione di fusione dopo la co-localizzazione di autofagosomi e lisosomi. Questo risultato conferma che la disfunzione degli autofagolisosomi può effettivamente portare a una ridotta clearance cellulare.

Figura 1: Analisi istopatologica del cuore e delle arterie coronarie. (A) Curve di sopravvivenza di topi a cui è stato iniettato PBS o diverse dosi di CAWS (4 mg, 8 mg e 12 mg; n = 20 per gruppo). (B) Sono stati presentati i risultati della colorazione HE del cuore nel gruppo di trattamento CAWS (8 mg) in diversi punti temporali (3 giorni, 7 giorni, 14 giorni, 28 giorni). Barre della scala: 1500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi della fibrosi del collagene e dell'infiltrazione delle cellule immunitarie. (A) I risultati della colorazione di Masson del gruppo CAWS 8 mg e del gruppo di controllo. Le fibre di collagene presentano un caratteristico colore blu, le fibre muscolari e il citoplasma sono rossi e il nucleo cellulare è blu scuro. Le frecce indicano spore fungine. Barre della scala: 1500 μm. (B) Risultati della colorazione in immunofluorescenza del gruppo CAWS 8 mg e del gruppo di controllo (cellule T CD3+ marcate con CD3, cellule T citotossiche CD8+ marcate con CD8, macrofagi di tipo M1 CD86+ marcati con CD86, macrofagi F4/80+ marcati con F4/80 e cellule natural killer NK1.1+ marcate con NK1.1). Barre della scala: 200 μm. (C) Valutare il grado di fibrosi cardiaca. Il grado di fibrosi cardiaca è stato valutato in base alla percentuale di area di colorazione tricromatica nel tessuto cardiaco del campo visivo con un ingrandimento di 800x. Il metodo specifico è il seguente: poiché le fibre di collagene sono tinte di verde brillante con coloranti anionici macromolecolari, sono stati osservati 100 campi visivi a un ingrandimento di 800 volte (tutte le fette con uno spessore di 5 μm) e il grado di fibrosi cardiaca è stato determinato dalla percentuale di area verde nell'area totale. Più alta è la percentuale, più grave è la fibrosi. (D) La percentuale di cellule immunitarie è stata analizzata statisticamente in base ai risultati della colorazione in immunofluorescenza,***p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi immunoistochimica dell'espressione di VDAC1 nel gruppo PBS e nel gruppo CAWS il giorno 28. (A) Analisi immunoistochimica dell'espressione di VDAC1. Barra di scala: 800 μm. Le particelle marroni e nere sono risultati positivi. (B) Analisi statistica della percentuale di cellule VDAC1 immunoistochimicamente positive, p < 0,001. (C) Analisi statistica dell'H-score dell'immunoistochimica VDAC1. I dati sono stati derivati da più repliche biologiche (n = 20 topi per gruppo) e i risultati sono stati espressi come media ± deviazione standard e analizzati statisticamente (***p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Rilevamento di autolisosoma dopo la fagocitosi di Candida albicans da parte di cellule RAW264.7 di topo. (A) Le frecce indicano spore fungine. Barre di scala: 25 μm. Il cambiamento del flusso autofagico può essere valutato dal cambiamento della colorazione di fusione dopo la co-localizzazione di autofagosomi e lisosomi. (B) Un'analisi dell'andamento temporale del tasso di formazione degli autolisosomi quantifica i parametri rilevanti. I risultati sono stati espressi come media ± deviazione standard e analizzati statisticamente (***p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.