Misurazione dell'invecchiamento delle singole cellule con un biomarcatore basato sull'imaging della cromatina e dell'invecchiamento epigenetico

Sommario

Il protocollo presenta il flusso di lavoro di imaging e computazionale per estrarre e validare la cromatina basata sull'imaging e l'età epigenetica (ImAge).

Abstract

Per promuovere una cura sanitaria personalizzata e valutare potenziali strategie di ringiovanimento, sono fondamentali biomarcatori che riflettono l'età biologica. Abbiamo introdotto la cromatina e l'età epigenetica basate sull'imaging (ImAge), un biomarcatore basato sull'imaging derivato dall'organizzazione spaziale della cromatina e dei segni epigenetici all'interno di nuclei singoli, catturando i cambiamenti intrinseci legati all'età. ImAge cattura e quantifica efficacemente gli effetti degli interventi che modulano l'età biologica, mostrando sensibilità attraverso diminuzioni significative dopo strategie di ringiovanimento (come la restrizione calorica e la riprogrammazione parziale tramite espressione transitoria di Oct4, Sox2, Klf4 e Myc (OSKM)) e aumenti dopo trattamenti come la chemioterapia. Inoltre, una minore ImAge è correlata a un'attività locomotoria più elevata, suggerendo che cattura miglioramenti funzionali insieme all'inversione biologica dell'età, offrendo uno strumento promettente per una singola cellula per valutare gli interventi di longevità. Poiché ImAge è un metodo integrativo che richiede imaging di buona qualità e un'analisi computazionale meticolosa, miriamo a fornire una guida approfondita per estrarlo e validarlo. Questo protocollo completo dettaglierà il flusso di lavoro sia per le procedure di laboratorio umido (preparazione e imaging) sia per il corretto utilizzo della nostra pipeline computazionale open-source (configurazione dell'ambiente e elaborazione dei dati di imaging) per estrarre e validare ImAge.

Introduzione

L'aumento della durata media della vita e l'invecchiamento della popolazione globale sottolineano la necessità critica di biomarcatori efficaci di età ^{funzionale o biologica 1,2,3}. Questi biomarcatori sono essenziali per prevedere con precisione il rischio e la durata della malattia, il che può migliorare significativamente l'assistenza geriatrica e ridurre i costi associati. Sebbene gli orologi di metilazione del DNA (DNAm) abbiano fatto notevoli progressi nella quantificazione dell'invecchiamento ^{biologico 4,5,6}, spesso si basano su una regressione lineare e richiedono ampie coorti, potendo trascurare componenti biologici sfumati e dipendenti dal contesto specifici degli^{individui 7,8}. Inoltre, queste tecniche basate sul sequenziamento richiedono la lisi cellulare, la preparazione complessa del campione e reagenti costosi per ogni cellula, rendendole più costose e impegnative per studi ad alta produzione, su larga scala o longitudinali in cui la distruzione del campione è uno^{svantaggio 9}.

Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato cromatina e età epigenetica basate sull'imaging (ImAge), una tecnica innovativa progettata per quantificare l'invecchiamento e il ringiovanimento a risoluzione monocellulare. Questa tecnica è stata applicata e validata nel sangue periferico del topo e in vari organi solidi come descritto da Alvarez-Kuglen et ^al.1. Questa pubblicazione descrive in dettaglio i protocolli ottimizzati in modo che possano essere adattati e adottati da altri ricercatori per varie applicazioni.

Questo approccio differisce fondamentalmente dagli orologi tradizionali del DNAm catturando traiettorie intrinseche legate all'età basandosi sull'organizzazione spaziale della cromatina e dei segni epigenetici all'interno di singoli^{nuclei 1}. I metodi basati sull'imaging offrono vantaggi distinti: sono intrinsecamente non distruttivi, il che significa che le celle non vengono distrutte durante la lavorazione, a differenza dei metodi basati sul sequenziamento. Questa natura non distruttiva permette in modo cruciale la conservazione della struttura spaziale della cromatina e dei segni epigenetici a livello di singola cellula, mantenendo il contesto spaziale delle cellule all'interno dei tessuti — una prospettiva spesso perduta nei flussi di lavoro convenzionali di sequenziamento. Inoltre, le tecniche di imaging sono generalmente più convenienti per studi su larga scala o longitudinali, poiché non richiedono reagenti costosi o preparazione complessa di librerie per cellula, rendendole adatte a osservazioni ripetute nel^{tempo 10,11}.

Un vantaggio chiave di ImAge è la sua capacità di rivelare traiettorie legate all'età come caratteristiche principali intrinseche dei dati stessi, senza richiedere una regressione sull'età cronologica. ImAge ha dimostrato una forte correlazione con l'età cronologica nel topo, nelle cellule mononucleari del sangue periferico e in vari organi^solidi. Fondamentale, ImAge cattura efficacemente le perturbazioni attese dell'età biologica, mostrando un aumento dopo il trattamento chemioterapico e una diminuzione della restrizione calorica e della parziale riprogrammazione tramite espressione transitoria di OSKM nel fegato e nel muscolo scheletrico. Inoltre, è stato osservato che i lettori ImAge sono correlati inversamente con l'attività locomotoria in topi cronologicamente identici, indicando la loro utilità nella misurazione di aspetti dell'età biologica e funzionale.

L'implementazione della metodologia ImAge richiede competenze sia nelle procedure sperimentali di laboratorio^{umido 12} sia nelle analisi computazionali¹ (Figura 1); Pertanto, questo articolo fornisce protocolli completi, passo dopo passo, per entrambi gli aspetti. Questo protocollo ottimizzato mira a facilitare l'adozione diffusa di ImAge, permettendo ai ricercatori di indagare i cambiamenti associati all'età nell'organizzazione della cromatina e dell'epigenetica a risoluzione cellulare singola su vari tipi cellulari e tessuti. In questo protocollo, H3K27ac e H3K27me3, due marcatori che forniscono contrasto e risoluzione sufficienti per determinare ImAge, sono stati selezionati come segni rappresentativi. I ricercatori possono replicare questo protocollo per quantificare l'invecchiamento biologico, valutare l'impatto degli interventi di longevità ed esplorare l'eterogeneità intrinseca nei processi di invecchiamento e rigenerazione a livello individuale dell'organismo.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono condotti secondo linee guida e protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Scripps Research Institute (Protocollo 09-0004-6). I dati presentati in questo manoscritto sono stati ottenuti utilizzando maschi i4F, con età compresa tra 2 e 14 mesi. Gli organi di interesse (fegato e muscolo scheletrico) sono stati prelevati da topi i4F di 13,8 mesi e da topi di controllo di cucciolate, trattati per 1 settimana con una bassa dose di doxiciclina (0,2 mg/ml⁾¹⁴. I nuclei sono stati isolati da campioni di giovani (3,2 mesi), di età (13,8 mesi) e anziani trattati con doxiciclina per sovraesprimere fattori OSKM (OSKM anziani).

1. Imaging dei campioni

1. Preparazione del campione
   1. Raccogliere organi di interesse (fegato e muscoli scheletrici) da topi appena dissezionati (o altre specie di interesse) e congelare improvvisamente con azoto liquido. Conserva i campioni a -80 °C fino a quando non sono pronti all'uso.
   2. Trasferire organi e tessuti su una malta pre-raffreddata e stendere sopra il ghiaccio secco. Versare azoto liquido sul tessuto congelato e macinare con un pestello pre-raffreddato. Polverizza il campione usando mortai e pestello pre-raffreddati finché non si ottiene una polvere uniformemente fine.
   3. Aliquot macina il tessuto utilizzando una spatola metallica pre-raffreddata in più tubi e conserva i campioni inutilizzati a -80 °C.
      NOTA: I campioni di tessuto macinati nei tubi possono essere conservati a -80 °C oppure procedere con l'isolamento dei nuclei.
   4. Estrarre i nuclei da aliquote congelate, utilizzando un kit Nuclei Lysis Buffer disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore.
   5. Conta i nuclei usando Trippan Blue. Mescola nuclei e Trippan Blue in un rapporto uguale in un tubo separato. Trasferire 10 μl della soluzione del nucleo-Trypan Blue a un emocitometro o a un contatore cellulare automatizzato.
   6. Diluire campioni in PBS + 0,5% di BSA in modo che 10.000 nuclei possano essere placcati in un volume di 20-30 μL/pozzo.
2. Preparazione della piastratura
   1. Inserisci tutti i metadati rilevanti per la preparazione della placca e l'analisi computazionale nella Mappa (fornita nel File Supplementare 1). Registra gli identificatori del campione (ad esempio, numeri o caratteri) nella stessa disposizione della vera piastra del pozzo nella scheda SampleID. Registrare le condizioni sperimentali, inclusa l'età del campione, nello stesso layout della piastra effettiva del pozzo nella scheda condizioni.
      NOTA: Le informazioni fornite nella scheda delle condizioni saranno utilizzate per identificare il gruppo d'età di ciascun campione (ad esempio, giovane o anziano). Questi gruppi di età identificati serviranno successivamente come riferimenti per costruire il modello di previsione dell'invecchiamento (ImAge). Pertanto, la scheda delle condizioni deve contenere dati che possono essere associati all'età, insieme ad altre condizioni sperimentali rilevanti quando necessario.
   2. Registra i biomarcatori target (ad esempio, H3K27me3) nella stessa disposizione della vera piastra del pozzo nel canale# (# viene sostituito da un numero). Verifica che tutte le combinazioni di metadati corrispondano e siano correttamente riflesse in un formato di tabella consecutivo nella scheda platemap.
      NOTA: Ogni colonna della tabella dovrebbe corrispondere a un nome di scheda designato (ad esempio, "sampleID"). Viene fornita una scheda aggiuntiva denominata "metadati" per documentare gli obiettivi del progetto e colorare i dettagli; Queste informazioni non verranno utilizzate nell'analisi dei dati. Utilizza questa scheda quando ritenuto necessario.
   3. Esporta la mappa a schede come formato file csv con il nome breve e descrittivo del progetto (ad esempio, project.csv).
      NOTA: La scheda metadati fornisce un modello per riassumere gli obiettivi del progetto e le informazioni sull'immunocolorazione. L'uso della scheda metadati nel modello Platemap è opzionale per il processo di impiccatura stesso. Tuttavia, altre schede, tra cui sampleID, channel# (# è sostituito da un numero), sono necessarie per l'analisi computazionale.
3. Placca 10.000 nuclei/pozzo in un volume di 20 - 30 μL in una piastra di pozzo (ad esempio, piastre da 384 pozzi). Ruota la piastra a 1.000 x g (accelerazione nove, decelerazione 4) per 10 minuti a 4 °C.
4. Correggi con un volume 1:1 di paraformaldeide (PFA) all'8% in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
   ATTENZIONE: Eseguire i passaggi PFA in una cappa e smaltire i rifiuti secondo le procedure di sicurezza istituzionale.
5. Rimuovi la soluzione. Aggiungi 30 μL di glicina 0,1 M in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovi la soluzione. Lavare con 100 μL di PBS 2x e aggiungere 30 μL di PBS per la conservazione.
   NOTA: Le cellule possono essere conservate a 4 °C o procedere immediatamente con l'immunomarcatura.
6. Immunomarcatura
   1. Rimuovi PBS. Aggiungere 30 μL di soluzione bloccante (2% BSA e 0,5% Triton X-100 in PBS) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Rimuovi la soluzione bloccante.
   2. Aggiungere 25 μL di anticorpi primari: anti-H3K27ac per topi (1:250) e anti-H3K27me3 (1:250) diluiti in buffer bloccante (0,4 - 2 μg/mL). Incubare durante la notte a 4 °C.
   3. Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi. Lava con 100 μL di PBS 3 volte per 3 minuti a temperatura ambiente.
   4. Aggiungere 25 μL di anticorpi secondari: Alexa 488 Donkey Anti-Mouse (1:250) e Alexa 555 Donkey Anti-Rabbit (1:250) diluiti in buffer di blocco (1 - 10 μg/mL). Incubare per 2 ore a 4 °C o 1 ora a temperatura ambiente.
   5. Lava con 100 μL di PBS 3 volte per 3 minuti a temperatura ambiente. Tingere con DAPI/Hoechst a 30 μL con concentrazione di 0,01 mg/mL. Lavare con 100 μL di PBS.
      NOTA: conserva il piatto a 4 °C nella carta stagnola o procedi immediatamente con l'imaging (imagining). DAPI/Hoechst è necessario per la fase di segmentazione dei nuclei.
7. Imaging
   1. Celle immagine su un imager ad alto contenuto per la massima risoluzione (per questo set di dati è stato usato 20x, ma si raccomanda 63x).
      NOTA: Sebbene l'imaging possa essere eseguito con qualsiasi imager ad alto contenuto, questo protocollo assume una struttura di cartelle piatta di immagini acquisite e un formato generico (ad esempio, .tiff) come output dell'immagine acquisita (Figura 2).
   2. Raccogli più campi per pozzo e più z-stack, idealmente coprendo dalla parte superiore verso la base dei nuclei cellulari. Una copertura di 10 μm insieme all'asse z (ad esempio, 20 fette z a un passo z di 0,5 μm) tipicamente copre la maggior parte dei nuclei delle cellule del muro. La dimensione e la copertura richiesta dipendono dalla specie e dai tipi cellulari di interesse. L'imaging rappresentativo è mostrato nella Figura 3.
   3. Trasferire i dati di imaging al computer dove verrà eseguita l'analisi computazionale, seguendo la struttura delle cartelle presentata nella Figura 2.
   4. Aggiungi il prefisso annotato a parentesi quadrate del nome del progetto definito nel passo 1.2.2 sopra alla cartella dati immagine (ad esempio, [progetto]original_folder_name)

2. Analisi computazionale dei dati di imaging

1. Preparazione dei requisiti software di sistema (Richiesta solo per la configurazione iniziale)
   1. Installa Windows Subsystem for Linux (WSL) se operi su un computer Windows seguendo le istruzioni al https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install. Installa Anaconda o Miniconda seguendo le istruzioni a https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main
2. Preparazione dell'ambiente computazionale (Richiesto solo per l'installazione iniziale)
   1. Scarica gli script di workflow dal repository di github https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow. Scomprimi il file scaricato.
      NOTA: La posizione di archiviazione dei dati può essere designata arbitrariamente; tuttavia, si consiglia selezionare una directory distinta dalla posizione di archiviazione file di sistema (ad esempio, il disco C su Windows).
   2. Organizza il repository ImAge clonato per corrispondere alla struttura di cartelle assunta per una corretta esecuzione degli script (Figura 2).
   3. Apri l'app terminale se usi Linux o macOS. Apri l'app WSL se usi Windows.
   4. Cambia cartella nel file del repository clonato. Da quel momento in poi, il termine Comando: indica un'istruzione per copiare e incollare il codice successivo nell'applicazione terminale, seguita dalla pressione del tasto Invio .
      Comando: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      NOTA: Sostituisci "/PATH_TO_CLONED_REPOSITORY" con l'impostazione specifica per l'utente. Ad esempio, quando il repository viene scompresso nella cartella "analysis" del disco D e accessibile da WSL, questo sarà "/mnt/d/analysis".
   5. Crea un nuovo ambiente computazionale con Python versione 3.10 usando conda (applicazione a riga di comando installata con Anaconda/miniconda).
      Comando: conda create -n ImAge_workflow python=3.10
   6. Attiva l'ambiente appena creato.
      Comando: conda attiva ImAge_workflow
   7. Installa poetry (un gestore di pacchetti Python) usando pip installer (installatore di pacchetti python installato durante la creazione dell'ambiente ImAge_workflow).
      Comando: installazione di pip poesia
   8. Installa i pacchetti python prerequisiti usando Poetry.
      Comando: installazione di poesia
      ATTENZIONE: Assicurati che la cartella corrente sia la cartella ImAge_workflow, che può essere verificata eseguendo un comando: pwd.
   9. Configura CUDA all'interno dell'ambiente Conda per abilitare la funzionalità di unità di elaborazione grafica (GPU) nella fase di segmentazione per un calcolo più veloce (applicabile solo per Linux o PC Windows con GPU Nvidia).
      Comando: mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d
      echo 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(dirname $(python -c "import nvidia; print(nvidia.__file__)"))' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      echo 'for dir in $NVIDIA_PACKAGE_DIR/*; fare se [ -d "$dir/lib" ]; poi esporta LD_LIBRARY_PATH="$dir/lib:$LD_LIBRARY_PATH"; fi fatto' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      NOTA: Gli script rilevano automaticamente la disponibilità della GPU sul server. Se non sono disponibili GPU, il sistema verrà eseguito di default sulla CPU.
3. Esegui i calcoli come descritto di seguito.
   NOTA: L'analisi computazionale consiste in quattro fasi: segmentazione dei nuclei, estrazione delle caratteristiche dell'immagine, costruzione dell'asse di invecchiamento (ImAge) e previsione dell'ImAge. Ogni processo viene eseguito utilizzando script python; o1_illumination_correction, o2_segmentation, o3_extract_features e o4_ImAge_validation. Tutti questi passaggi sono inclusi in un unico script Python, main.py. Le letture ImAge estratte possono essere visualizzate usando un grafico a scatola e violino come presentato in Figura 4. La lettura ImAge può anche essere estratta in un formato semplice di tabella (formato standard .csv file), con campioni rappresentati come righe e le relative letture e metadati come colonne. Gli utenti hanno la flessibilità di eseguire ulteriori analisi numeriche sulle letture ImAge secondo necessità. Questi grafici e il file CSV possono essere ottenuti utilizzando uno script Python, visualization.py. Il processo di previsione ImAge utilizza segnali bootstrappati ottenuti da singole cellule all'interno dello stesso tessuto. Questi segnali bootstrapati sono segnali mediati derivati da campionamenti casuali e iterazioni ripetute. Questo approccio mira a garantire che l'analisi catturi le letture più affidabili e rappresentative, con l'incertezza dell'analisi proporzionale all'eterogeneità intrinseca del tessuto.
   1. Apri l'app terminale se usi Linux o macOS. Apri l'app WSL se usi Windows.
      Comando: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      ATTENZIONE: Assicurati che la cartella corrente sia la cartella ImAge_workflow, che può essere verificata eseguendo un comando: pwd.
   2. Attiva l'ambiente.
      Comando: conda attiva ImAge_workflow
   3. Configura i parametri di analisi sul file di lavoro/main.py nell'editor di codice o testo (ad esempio, app Notepad, Microsoft Visual Studio Code, ecc.).
      1. Imposta il nome del progetto nella variabile p a un identificatore breve e sicuro per il file system usato per organizzare gli output (ad esempio, p = brain_3ages_k27me3).
      2. Imposta la lista dei canali per l'estrazione delle funzionalità in chs. Includere il canale di segmentazione se sono richieste caratteristiche di quel canale per l'analisi (chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac']).
      3. Mappare gli identificatori dei canali immagine dai nomi dei file alle colonne della mappa delle lastre usando imageIndex. Determina il formato dell'etichetta del canale utilizzato dal sistema di imaging per acquisire i dati dell'immagine e usa quell'etichetta come chiave. Mappare ogni etichetta all'intestazione esatta della colonna con sensibilità a minuscole nella mappa salvata nel passaggio 1.2.2 (ad esempio, imageIndex = {'1': 'Channel1', '2': 'Channel2', '3': 'Channel3'}).
         ATTENZIONE: I nomi delle colonne sono sensibili alla mastruzzeria e devono corrispondere al file della mappa della targa.
      4. Imposta le posizioni dei dati: orgDataLoadPath alla radice del dataset, orgDataSubFolder alla sottocartella immagine se necessario, e resultsSavePath alla radice di output.
      5. Conferma l'estensione del nome file in imageFileFormat e modifica imageFileRegEx per usare gruppi di cattura nominati in Python per tutte le parti richieste: row, col, field, zposition e channel. Usa la seguente sintassi: (? P\d+), dove GROUP viene sostituito da riga, col, campo, posizione o canale.
         NOTA: Aggiorna il regex se i nomi dei file differiscono; tutti i gruppi nominati devono parlargizzare correttamente. Ad esempio, il nome del file r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiff dovrebbe essere convertito nel seguente: r(? P\d+)c(? P\d+)f(? P\d+)p(? P\d+)-ch(? P\d+)sk1fk1fl1\.tiff.
      6. Imposta il canale di segmentazione in segmentation_ch al canale nucleare usato per il rilevamento degli oggetti (ad esempio, segmentation_ch = 'DAPI').
      7. Decidi se usare la correzione dell'illuminazione impostando illumiCorrection. Impostato su True per calcolare e applicare modelli BaSiC; impostato su Falso per elaborare le immagini raw.
         NOTA: Per le lastre con ≥ 25 pozzi, si raccomanda la correzione dell'illuminazione per ridurre il bias sistematico.
      8. Imposta la dimensione fisica del voxel in micrometri in voxel_dim come [z, y, x]. Utilizzare i metadati del microscopio per determinare la distanza (ad esempio, voxel_dim = [1,0, 0,6, 0,6]). Salva il file e chiudi l'editor dopo aver verificato ogni parametro
   4. Esegui script per ottenere letture ImAge ed eseguire la validazione. Durante l'esecuzione dello script, non chiudere né il terminale né l'app WSL.
      Comando: Workflow/main.py Python
      NOTA: Lo script (main.py) comprende tutti i passaggi, inclusa segmentazione, estrazione delle caratteristiche, costruzione dell'asse ImAge e previsione di default. Lo script genererà un tempo di completamento stimato per ogni passaggio (ad esempio, segmentazione dei nuclei). Ogni processo (ad esempio, o1_illumination_correction) genererà file intermedi in formato .pickle che contengono i risultati di ciascun processo. Tuttavia, questo è destinato esclusivamente al trasferimento dati tra processi per garantire un trattamento standardizzato e non è destinato alla manipolazione da parte degli utenti in questo articolo. Tuttavia, se gli utenti devono manipolare o adottare questi file, consulta la documentazione inclusa in ogni funzione Python per la forma e i tipi di dati¹³.
   5. Visualizza i risultati ed esporta le letture grezze ImAge per ulteriori analisi su software esterno. Comando: Workflow/visualization.py Python
      NOTA: Questo passaggio produce figure e tabelle delle letture ImAge, e i file si trovano rispettivamente a fig_o4_ImAge_validation_VIOLIN e export_o4_ImAge_validation (Figura 2).

Risultati

Le immagini rappresentative dovrebbero essere ben popolate per ottenere singole cellule, ma i singoli nuclei non dovrebbero toccarsi, poiché ciò degraderebbe la qualità della segmentazione dei nuclei cellulari. La Figura 3 mostra l'imaging rappresentativo per ottenere risultati robusti dell'analisi computazionale.

I risultati delineati nel manoscritto di questo metodo sono adattati dal manoscritto ImAge di Alvarez-Kuglen et

Discussione

Preparazione del campione
Per la preparazione del campione, preleva prontamente i tessuti di interesse e congelali immediatamente in azoto liquido. Quando si macina il tessuto con un mortaio e un pestello, si può utilizzare una copertura in silicone per evitare la perdita del campione. Aggiungi più azoto liquido se il tessuto è difficile da polverizzare. Per tessuti più fragili, i campioni possono anche essere processati freschi (anziché congelati) per ridurre le inte...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Albumina Sirica Bovina	Sigma-Aldrich	A9647
Anti-IgG Anti-Topo Donkey (H+L) Anticorpo Secondario Altamente Adsorbito Incrociatato, Alexa 488	Invitrogen	A-21202
Anti-Coniglio IgG (H+L) Anticorpo Secondario Altamente Adsorbito Incrociato Donkey, Alexa 555	Invitrogen	A-31572
Glicina	Bio-Rad	161-0718
Anticorpi Histone H3K27ac (mAb)	Motivo attivo	39685
Anticorpi Histone H3K27me3 (pAb)	Motivo attivo	39155
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep	Sigma-Aldrich	NUC101
Operetta CLS High Content Imager	Revvity	https://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020
Paraformaldeide 16% Soluzione Acquosa di Grado EM	Scienze della microscopia elettronica	15710-S
PBS	Thermo Fisher	AM9624
Micropiastra a 384 pozzi PhenoPlate	Revvity	6057302
Triton-X	Sigma	T8787
Soluzione Trippan Blue, 0,4%	Gibco & nbsp;	15250061