Method Article

Analisi specifica del sottotipo cellulare del proteasoma della membrana neuronale nei neuroni somatosensoriali

DOI:

10.3791/69061

⸱

October 10th, 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Pharmacology and Neuroscience, Loyola University Chicago Stritch School of Medicine, 2Center for Translational Research and Education

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il proteasoma della membrana neuronale (NMP) è stato recentemente identificato in un sottogruppo di neuroni somatosensoriali come regolatore chiave della percezione del tatto, del dolore e del prurito. Questo articolo presenta un solido flusso di lavoro per l'analisi dell'espressione e della funzione NMP specifica del tipo di cellula utilizzando la selezione cellulare, la profilazione del trascrittoma e le analisi immunofluorescenti basate su colture.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La segnalazione dei neuroni sensoriali dipende dai proteosomi funzionali e la loro localizzazione subcellulare influenza la funzione. Un complesso proteasomico specializzato, il proteasoma della membrana neuronale (NMP), è stato recentemente identificato in una sottopopolazione di neuroni somatosensoriali periferici. L'NMP si localizza esclusivamente nella membrana plasmatica del soma e negli assoni prossimali e distali. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha rivelato che, in condizioni normali, l'NMP è espresso prevalentemente nei neuroni MrgprA3+ e Cysltr2+, che mediano la sensazione meccanica, pruriginosa e dolorosa. L'inibizione acuta e selettiva dell'NMP nella pelle della zampa dei topi ha ridotto la sensibilità meccanica e al dolore senza influire sulla sensazione termica. In particolare, a differenza dell'inibizione globale del proteasoma, l'inibizione selettiva dell'NMP non causa neuropatia. Studi in vitro suggeriscono che l'NMP facilita la comunicazione neurone-neurone, potenzialmente attraverso il rilascio di peptidi di segnalazione, ed è essenziale per le normali risposte neuronali alla stimolazione. Questi risultati identificano l'NMP come un regolatore chiave della diafonia dei neuroni sensoriali necessaria per il tatto normale, il dolore e la sensazione di prurito. Pertanto, l'NMP rappresenta un potenziale bersaglio per la gestione del dolore. Questo articolo presenta metodi per isolare popolazioni neuronali che esprimono NMP e non che esprimono NMP utilizzando l'alimentazione di anticorpi e la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Queste popolazioni sono adatte per la profilazione dell'espressione specifica del tipo di cellula tramite scRNA-seq o analisi basate su colture della dinamica dell'espressione di NMP. Insieme, questi metodi forniscono un solido flusso di lavoro per studiare le dinamiche di espressione di NMP e il suo contributo alle condizioni di malattia rilevanti per il dolore.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La funzione del proteasoma è essenziale per lo sviluppo e il mantenimento ottimali del sistema nervoso periferico (SNP)1,2,3,4,5,6. Sia gli studi in vitro che quelli in vivo che utilizzano inibitori del proteasoma dimostrano che l'attività del proteasoma è cruciale per il neurosviluppo, la mielinizzazione, l'eccitabilità e la funzione delle cellule gliali 7,8,9,10. Inoltre, la chemioterapia a base di inibitori del proteasoma induce neuropatie dolorose nel 30-60% dei pazienti, spesso caratterizzate da dolore cronico e alterazione della sensibilità alle estremità 8,9,11,12,13. È interessante notare che la somministrazione a basse dosi di questi stessi inibitori riduce la sensibilità agli stimoli dolorosi, suggerendo un ruolo complesso per il proteasoma nell'elaborazione sensoriale 6,14,15. Tuttavia, nonostante questi studi approfonditi, la funzione specifica dei proteasomi nel SNP è rimasta poco compresa.

I proteasomi sono il principale meccanismo di degradazione delle proteine in tutti i domini della vita e sono essenziali per il mantenimento dell'omeostasi proteica16. Il proteasoma centrale 20S è composto da quattro anelli eptamerici di subunità α, β, β α e media la degradazione proteica indipendente dall'ubiquitina17,18. L'associazione con le particelle regolatorie forma il proteasoma 26S e 30S capped proteasoma, che media la degradazione della proteina ubiquitina-dipendente 4,17. Nei neuroni, i proteasomi sono stati identificati in tutti i compartimenti cellulari e la loro localizzazione subcellulare è nota per influenzare la funzione19. Tuttavia, molti inibitori del proteasoma comunemente usati mancano della specificità per colpire selettivamente le popolazioni di proteasoma localizzate in modo differenziale.

Infatti, utilizzando inibitori del proteasoma impermeabili alla membrana e marcatura di anticorpi in cellule non permeabilizzate, è stato scoperto che un complesso di proteasoma neurone-specifico si localizza sulla membrana plasmatica in un sottogruppo di neuroni somatosensoriali20. L'analisi scRNA-seq dei neuroni primari del ganglio della radice dorsale (DRG), separati in popolazioni NMP+ e NMP- tramite alimentazione di anticorpi contro una subunità del proteasoma e smistamento FACS, ha portato a 20 cluster cellulari trascrizionalmente distinti20. Ulteriori analisi hanno rivelato che le cellule NMP+ si raggruppavano solo in 3 dei 20 cluster. Utilizzando set di marcatori genici per specifici sottotipi neuronali, sono stati identificati 13 diversi sottotipi di neuroni somatosensoriali20. La maggior parte dei neuroni NMP+ si raggruppa con i neuroni sensoriali MrgprA3+ e Cysltr2+ 20. Un numero minimo di cellule NMP+ si è raggruppato in un terzo cluster, in cui non sono stati identificati set di geni specifici, e questo cluster è stato quindi lasciato non assegnato20. I neuroni MrgprA3+ e Cysltr2+ sono nocicettori di tipo C, sensibili al calore, agli stimoli meccanici e pruritogeni, corrispondenti ai sottotipi neuronali CGRP-θ e SST, rispettivamente21,22. Dei 20 cluster cellulari identificati, 7 cluster NMP- esprimevano marcatori genici coerenti con le cellule non neuronali, tra cui le cellule di Schwann, la glia satellite e le cellule immunitarie, e sono stati anche lasciati non assegnati20. Queste popolazioni cellulari erano attese, poiché non è possibile separare le cellule non neuronali da quelle neuronali durante la coltura dei neuroni DRG20.

Studiando la sua funzione, l'inibizione in vitro dell'NMP ha alterato l'eccitabilità neuronale alla stimolazione di KCl, istamina e αβ-metileneadenosina 5'-trifosfato20. In vivo, l'inibizione dell'NMP ha ridotto la sensibilità agli stimoli meccanici e dolorifici senza effetti sulla sensazione termica20. Questi risultati rivelano che l'NMP è un regolatore chiave della sensazione meccanica, del dolore e del prurito e un potenziale bersaglio terapeutico per la gestione del dolore20. Tuttavia, i meccanismi specifici che collegano l'attività dell'NMP allo sviluppo del dolore in diversi contesti patologici rimangono poco compresi. Pertanto, sono necessarie ulteriori indagini sulla dinamica e la funzione dell'espressione di NMP in condizioni associate al dolore e alla neuropatia.

In questo articolo, questo articolo descrive un solido flusso di lavoro (Figura 1) per identificare e isolare le popolazioni neuronali NMP+ DRG. Questo approccio consente lo studio specifico del tipo di cellula delle dinamiche di espressione di NMP utilizzando il sorting FACS, scRNA-seq e l'immunocolorazione. Questi approcci consentono l'analisi ad alta risoluzione dell'espressione dell'NMP in modo specifico per tipo di cellula, che può essere utilizzata per studiare il ruolo dell'NMP in condizioni normali e varie associate al dolore.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti i metodi descritti utilizzando animali da esperimento sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Loyola University of Chicago Stritch School of Medicine.

1. Preparazione di soluzioni di digestione, terreni DRG e terreni FACS

  1. Preparare una soluzione salina completa (CSS) contenente 137 mM di NaCl, 5,3 mM di KCl, 1 mM di MgCl2,6H 2O, 25 mM di sorbitolo, 10 mM di HEPES e 3 mM di CaCl2,2H 2O. Regolare il pH a 7,2 con NaOH e sterilizzare con filtro.
  2. Preparare la soluzione di lavoro della miscela di enzimi per la dissociazione tissutale (triturazione moderata) combinando 190 μL di stock (5 mg/mL in H2O), 84 μL di EDTA 50 mM e 6,5 mL di CSS. Preparare fresco e sterilizzare con filtro prima dell'uso.
  3. Preparare una miscela di enzimi di dissociazione tissutale (bassa triturazione)-soluzione di papaina contenente 190 μL di soluzione madre di miscela di enzimi, 150 μL di papaina, 84 μL di EDTA 50 mM e 6,5 mL di CSS. Preparare fresco e sterilizzare con filtro prima dell'uso.
  4. Preparare la soluzione BSA/TI/DMEM combinando 7,5 mg di inibitore della tripsina e 7,5 mg di BSA in 5 ml di terreno DMEM/F12. Preparare fresco e sterilizzare con filtro.
  5. Preparare i terreni neuronali DRG combinando il 10% di siero fetale bovino (FBS), l'1% di penicillina/streptomicina, l'1% di glutammina e il 2% di integratore 50x B27 in 430 ml di DMEM/F12.
  6. Preparare il tampone FACS combinando l'1% di FBS, 1x PBS, 25 mM di HEPES e l'1% di penicillina/streptomicina in acqua sterilizzata in autoclave. Preparare fresco e sterilizzare con filtro.
  7. Ventiquattro ore prima dell'inizio del protocollo, rivestire due provette a fondo tondo in polistirene da 5 mL riempiendole con tampone FACS e posizionandole a 4 °C.

2. Preparazione della sospensione di neuroni DRG a cellula singola

  1. Raccogliere tutti i DRG da 4-6 topi P20-P23 seguendo i metodi precedentemente descritti20,23.
  2. Trasferire i DRG in una provetta conica da 15 mL e aggiungere 7 mL di soluzione di lavoro della miscela di enzimi di dissociazione tissutale (triturazione moderata). Incubare con leggera agitazione (ruotando) a 37 °C per 20 min.
  3. Centrifugare i gangli a 120 × g per 2 min. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere i gangli in 7 mL di miscela di enzimi di dissociazione tissutale (bassa triturazione)-soluzione di lavoro di papaina. Incubare con leggera agitazione (ruotando) a 37 °C per 15 min.
  4. Centrifugare a 120 × g per 2 min. Rimuovere il surnatante e risospendere i gangli in 500 μl di soluzione BSA/TI/DMEM.
  5. Triturare i gangli 12-16 volte con una pipetta Pasteur in vetro lucidato a fuoco da 1 mL tappata.
  6. Filtrare i detriti cellulari facendo passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Lavare il colino con 1 mL di soluzione BSA/TI/DMEM per garantire la raccolta di tutti i neuroni DRG. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
  7. Centrifugare a 120 × g per 2 min. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in 1 mL di terreno DRG.
    NOTA: Questa è la sospensione neuronale DRG a cellula singola.

3. Alimentazione di anticorpi per marcare i neuroni NMP-positivi

  1. Dividere la sospensione di neuroni DRG in due provette da 1,5 mL, ciascuna contenente 500 μL, ed etichettare le due provette: "primarie" e "non primarie".
  2. Aggiungere 20 μl di anticorpo anti-proteasoma 20S subunità alfa 2 (PSMA2) di capra alla provetta marcata "primaria" (diluizione 1:25).
    1. Opzionale: per testare l'integrità della membrana e la specificità dell'anticorpo PSMA2, includere un campione aggiuntivo di DRG primari incubati con catena pesante anti-neurofilamento di pollo (NF-H) (1:1.000) seguito da secondario anti-pollo (ad es. 488-coniugato) (1:250) (passaggio 3.10).
      NOTA: Il controllo della marcatura anti-NF-H non dovrebbe portare a nessuna marcatura cellulare se la membrana neuronale è intatta.
  3. Incubare le cellule in leggera agitazione per 30 minuti a 37 °C.
  4. Filtrato a caldo, sterilizzato 1x PBS durante l'incubazione primaria degli anticorpi.
  5. Centrifugare le provette a 200 × g per 2 minuti e rimuovere il 90% del surnatante (scartare).
  6. Risospendere i neuroni in 500 μL di 1x PBS caldo. Incubare le provette agitando delicatamente per 3 minuti a 37 °C.
  7. Ripetere i passaggi 3.5-3.6 per un totale di tre lavaggi.
  8. Mentre sono in corso le fasi di lavaggio, preparare l'anticorpo secondario diluendo 4 μL di IgG anti-capra (fluoroforo a 555 nm) in 1.000 μL di terreno DRG caldo (diluizione 1:250).
  9. Dopo il terzo lavaggio, risospendere sia la provetta "primaria" che quella "non primaria" in 500 μl della soluzione di anticorpo secondario.
    NOTA: Da questo punto in poi, proteggere i tubi dalla luce avvolgendoli con un foglio di alluminio.
  10. Incubare le provette con una leggera agitazione per 40 minuti a 37 °C.
  11. Lavare le celle ripetendo i passaggi 3.5-3.6 per un totale di tre lavaggi.
  12. Dopo il terzo lavaggio, risospendere i neuroni in 300 μL di tampone FACS. Trasferire le cellule risospese in provette separate da 5 ml di polistirene a fondo tondo e metterle sul ghiaccio in un secchiello per il ghiaccio con coperchio per proteggerle dalla luce.
  13. Posizionare le provette a fondo tondo pretrattate contenenti il tampone FACS del giorno precedente nel secchiello del ghiaccio con le provette contenenti le cellule e procedere alla fase di selezione FACS.

4. Separazione dei neuroni NMP-positivi (NMP+) e NMP-negativi (NMP-) tramite smistamento FACS

  1. Immediatamente dopo l'alimentazione degli anticorpi e la marcatura dei neuroni DRG, portare le cellule e le provette rivestite a un selezionatore FACS.
  2. Aggiungere 7-amminoactinomicina D (7-AAD) (1:1.000) sia alla provetta "primaria" che a quella "non primaria". Incubare per 10-30 minuti con ghiaccio.
    NOTA: 7-AAD viene utilizzato per escludere le celle morte dal processo di ordinamento.
  3. Rimuovere il tampone FACS dalle provette rivestite durante la notte e sostituirlo con 1 mL di tampone FACS fresco. Questi tubi fungono da tubi di raccolta per i neuroni ordinati.
  4. Utilizzare la provetta etichettata "no primary" per impostare i parametri e il gating per i neuroni non marcati.
  5. Applicare il gating a dispersione diretta (FSC) per isolare le cellule in modo coerente con le dimensioni dei neuroni sensoriali. I diametri dei neuroni sensoriali variano da 10 a 50 μm.
  6. Applicare il gating a dispersione laterale (SSC) per escludere cellule morte e detriti (dispersione laterale inferiore) e per isolare eventi coerenti con la granularità dei neuroni DRG (dispersione laterale più grande).
  7. Caricare la provetta "primaria" e impostare i parametri di gating come stabilito con il campione "non primario" per rilevare le popolazioni neuronali non marcate (NMP-) e 555-positive (NMP+).
  8. Utilizzando un ugello da 100 μm e una pressione di selezione di 15-20 psi, ordina i neuroni in 555+ e 555-.
  9. Procedere all'analisi a valle dei neuroni ordinati.

5. Sequenziamento dell'RNA a singola cellula dei neuroni NMP+ e NMP-

  1. Trasferire le cellule selezionate in provette da 1,5 mL e metterle sul ghiaccio. Trasporta le cellule in un nucleo di sequenziamento a singola cellula.
  2. Esegui il sequenziamento dell'RNA di una singola cellula sui neuroni NMP+ e NMP-ordinati a una profondità compresa tra 30.000 e 100.000 letture per cellula.
  3. Analizzare i dati scRNA-seq utilizzando vari programmi software disponibili gratuitamente per generare cluster cellulari in base a specifici profili di espressione genica. Per maggiori dettagli sulle fasi di analisi e sui programmi utilizzati in precedenza, fare riferimento a Villalón Landeros et al.20.
  4. Costruire un elenco di marcatori genici specifici per identificare le singole popolazioni neuronali utilizzando i database disponibili come https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ o https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all
  5. Utilizzare l'elenco di marcatori genetici specifici per identificare i cluster cellulari risultanti.
    NOTA: L'analisi scRNA-seq precedentemente eseguita è stata condotta da una società di consulenza indipendente (www.cmcherryconsulting.com).

6. Colture primarie di neuroni NMP+ e NMP- arricchiti

  1. Il giorno prima dell'esperimento, posizionare i vetrini coprioggetti rotondi da 12 mm in una piastra di coltura a 24 pozzetti (1 vetrino coprioggetti/pozzetto) e lavare con etanolo al 70% per 15 minuti. Quindi, sciacquare con acqua sterile 3 volte e asciugare all'aria in una cappa di coltura tissutale sterile.
  2. Una volta che i vetrini coprioggetti sono asciutti, ricoprirli con 0,1 mg/mL di popoli-L-lisina bromidrato (PLL) e porre a 4 °C per una notte.
  3. Il giorno dell'esperimento, rimuovere il PLL, sciacquare i vetrini coprioggetti con acqua sterile 3 volte e lasciarli asciugare in una cappa di coltura tissutale.
    NOTA: Il PLL può essere salvato e riutilizzato.
  4. Diluire 10 μL di 1 mg/mL di laminina in 125 μL di terreno DRG e posizionare 20-30 μL al centro di ciascun vetrino coprioggetti.
  5. Rivestire i vetrini coprioggetti con laminina per almeno 40 minuti prima dell'uso.
  6. Trasferire le cellule selezionate FACS in una provetta da 1,5 mL e centrifugare a 200 × g per 5 minuti per raccogliere le cellule. Rimuovere il surnatante e risospendere i neuroni in 50 μL di terreno DRG caldo.
  7. Aspirare la laminina dal vetrino coprioggetti e lasciare asciugare il vetrino coprioggetti.
  8. Seminare 15-20 μL di neuroni risospesi su ciascun vetrino coprioggetti. Spostare con cautela la piastra con i vetrini coprioggetti seminati in un incubatore per colture tissutali e incubare per almeno 30 minuti (non più di 1 ora) per consentire alle cellule di aderire.
  9. Spostare nuovamente la piastra in una cappa di coltura tissutale e aggiungere 1 mL di terreno DRG caldo sterile a ciascun pozzetto contenente le cellule sui vetrini.
    NOTA: Abbassare la punta della pipetta nell'angolo inferiore del pozzetto ed erogare lentamente per evitare di toccare il vetrino coprioggetti e distruggere le cellule. L'aggiunta di terreni troppo velocemente può creare turbolenze e spostare le cellule.
  10. Mantenere le colture a 37 °C con il 5% di CO2/95% di umidità con il 75% di cambi di terreno ogni 2-3 giorni.

7. Analisi dell'espressione NMP specifica del tipo di cellula

  1. Preparare una piastra di coltura da 140 mm o un vassoio per la colorazione in immunofluorescenza rivestendolo con un grosso pezzo di parafilm.
  2. Utilizzando una pinza sterile da 5/45, trasferire i vetrini coprioggetti dalla piastra di coltura tissutale al parafilm sul vassoio di colorazione, assicurandosi che il lato contenente i neuroni DRG sia rivolto verso l'alto.
  3. Aggiungere 100 μl di terreno DRG a ciascun vetrino coprioggetti sul parafilm per evitare che le celle si secchino.
    NOTA: Aggiungere i liquidi pipettando lentamente appena oltre il bordo del vetrino coprioggetti.
  4. Diluire l'anticorpo primario anti-PSMA2 di capra in terreno DRG caldo a una diluizione di 1:20.
  5. Utilizzando un aspiratore dotato di punta P10 non filtrata, rimuovere lentamente il materiale dal vetrino aspirando dal bordo. Aggiungere 100 μL di soluzione di anticorpi anti-PSMA2 di capra ai vetrini coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 40 minuti.
  6. Aspirare con cautela la soluzione di anticorpi primari dai vetrini. Aggiungere 100 μL di PBS (a temperatura ambiente) e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente per lavare.
  7. Aspirare il PBS dal vetrino coprioggetti e ripetere l'aggiunta e l'aspirazione del PBS per un totale di tre lavaggi.
  8. Preparare un anticorpo secondario anti-capra (ad es. 555-coniugato) in terreni DRG caldi a una diluizione di 1:250.
  9. Dopo il terzo lavaggio, aggiungere 100 μl dell'anticorpo secondario diluito al vetrino coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 40 minuti.
    NOTA: Da questo passaggio in avanti, proteggere le celle dalla luce.
  10. Aspirare la soluzione di anticorpi secondari dal vetrino coprioggetti e lavare 3 volte come descritto nei passaggi 7.6-7.7.
  11. Rimuovere l'ultimo lavaggio PBS e fissare le cellule aggiungendo 100 μL di soluzione fissativa contenente il 4% di paraformaldeide (PFA), il 4% di saccarosio in 1x PBS. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
  12. Aspirare il fissativo e lavare 3 volte ripetendo i passaggi 7.6-7.7.
  13. Permeabilizzare le cellule aggiungendo 100 μl di detergente non ionico allo 0,1% (ad es. Triton X-100) in 1x PBS e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
  14. Aspirare la soluzione permeabilizzante e lavare 3 volte ripetendo i passaggi 7.6-7.7.
  15. Aggiungere 100 μL di soluzione bloccante composta da 5% FBS, 5% siero d'asina in 1x PBS e incubare a temperatura ambiente per 40 minuti.
  16. Preparare una miscela di anticorpi primari specifici per tipo di cellula neuronale DRG secondo le seguenti diluizioni in soluzione bloccante: peptide correlato al gene della calcitonina di coniglio (CGRP) (1:500); isolectina B4, coniugato di biotina (IB4) (1:50); pollo anti-NF-H (1:1000).
    NOTA: Questi anticorpi non interferiscono tra loro e possono essere sommati nella stessa soluzione.
  17. Rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere la miscela di anticorpi primari al vetrino coprioggetti. Incubare a temperatura ambiente per 45 min.
  18. Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare 3 volte ripetendo i passaggi 7.6-7.7.
  19. Preparare la soluzione di miscela di anticorpi secondari diluendo la streptavidina (ad es. 647-coniugata), l'anti-coniglio d'asino (ad es. coniugato 488) e l'anti-pollo d'asino (ad es. coniugato 405) a 1:500 ciascuno.
  20. Rimuovere l'ultimo lavaggio PBS e aggiungere 100 μL di soluzione di anticorpi secondari ai vetrini. Incubare a temperatura ambiente per 45 min.
  21. Lavare 3 volte ripetendo i passaggi 7.6-7.7.
  22. Opzionale: preparare la colorazione nucleare a 1-10 μg/mL. Aggiungere 100 μL di soluzione di colorante nucleare, incubare per 30 s a temperatura ambiente e lavare 2 volte con acqua deionizzata (diH2O) ripetendo i passaggi 7.6-7.7.
  23. Aspirare l'ultimo lavaggio del vetrino coprioggetti e, utilizzando una pinza a punta fine, sollevare il vetrino coprioggetti dal parafilm. Asciugare il liquido in eccesso toccando delicatamente il bordo del vetrino coprioggetti su un fazzoletto privo di lanugine.
  24. Posizionare una goccia da 7 μl di terreno di montaggio su un vetrino da microscopio. Posizionare delicatamente il vetrino coprioggetti sulla gocciolina del mezzo di montaggio, assicurandosi che le celle siano rivolte verso il basso e siano a contatto con il fluido.
  25. Posizionare i vetrini del microscopio con i vetrini coprioggetti in un cassetto o in una scatola buia e asciutta per almeno 1 ora per asciugare e sigillare il bordo del vetrino coprioggetti. Termina di sigillare il bordo dei vetrini coprioggetti con smalto ad asciugatura rapida e attendi 10-15 minuti prima dell'imaging.
  26. Vetrini di immagini utilizzando un microscopio confocale fluorescente o a disco rotante dotato di filtri di luce appropriati per visualizzare la fluorescenza blu, verde, rossa e rosso lontano.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacità di distinguere tra NMP e proteasomi intracellulari si basa su approcci di marcatura impermeabili alla membrana. L'alimentazione degli anticorpi consente l'uso di anticorpi specifici per le subunità del proteasoma sui neuroni vivi per marcare i proteasomi accessibili solo dall'esterno della cellula. A causa delle loro dimensioni e idrofilia, gli anticorpi non sono in grado di attraversare le membrane cellulari intatte24. I neuroni vivi mantengono l'integ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I proteasomi sono essenziali in tutte le cellule e possono essere trovati in tutti i compartimenti della cellula19. La recente scoperta di un complesso specializzato di proteasoma, l'NMP, nei neuroni del sistema nervoso centrale 25,26,27 e periferico 20 ha cambiato la nostra attuale comprensione della funzione dei proteasomi. Lavori precedenti hann...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E.V.L è stato supportato da fondi di avvio della Loyola University Chicago Stritch School of Medicine. Ringraziamo Robert Ladd per i suoi consigli e la sua assistenza con FACS.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Soluzione tampone HEPES 1 M, pH 7,3Qualità Biologica118-089-721Tampone FACS
10x PBSThermo Fisher Scientifico70011-044Tampone FACS
Soluzione madre di paraformaldeide (PFA) al 16%; Grado EMEMS15710soluzione fissativa
1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Fisher Scientifico10-010-023Lavaggi FACS
Provetta da 5 mL in polistirene a fondo tondoFisher Scientifico14-959-6Tubi FACS
7-amminoattinomicina D (7-AAD)InvitrogenCodice: A1310Etichetta le celle morte
Supplemento B27Thermo Fisher Scientifico17504044terreno di coltura
Albumina sierica bovinaMilliporeSigmaA9647; CAS: 9048-46-8BSA/TI/DMEM
Il cloruro di calcio diidrato (CaCl?-2H? O)MilliporeSigmaVisualizzazione del materiale C7902Soluzione salina completa
Catena pesante anti-neurofilamento di pollo (NF-H)MilliporeSigmaAB5539anticorpo
DMEM/F12 1:1Thermo Fisher Scientifico11320033terreno di coltura; BSA/TI/DMEM
Asino anti-capra IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 555Thermo Fisher ScientificoCodice: A32816anticorpo
Asino anti-coniglio IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificoA32790anticorpo
DyLight 405 asino anti-polloJackson ImmunoResearch703-475-155anticorpo
EDTAMilliporeSigmaE5134; CAS: 6381-92-6Soluzioni di lavoro Liberase TM/Liberase TL-papain
Siero fetale bovino (FBS)MilliporeSigmaCodice: A9647terreno di coltura/tampone FACS/soluzione bloccante
Pipetta pasteur in vetro, 9 polliciFisher ScientificoCodice 1367820DTitolazione
Capra anti-PSMA2Fatto in casaNAanticorpo
HEPES in polvereMilliporeSigmaH4034Soluzione salina completa
HoechstThermo Fisher ScientificoH21492colorante nucleare
Siero per cavalliThermo Fisher Scientifico26050070soluzione bloccante
IB4, coniugato di biotinaMilliporeSigmaL2140anticorpo
LamininaSigma-AldrichL2020-1MGpiatto di coltura
L-glutamminaThermo Fisher Scientifico25030081terreno di coltura
Triturazione di Liberase bassa (TL)MilliporeSigma54010200001Soluzione stock Liberase TL
Liberase triturazione moderata (TM)MilliporeSigma5401119001Soluzione stock Liberase TM
Il cloruro di magnesio esaidrato (MgCl?-6H? O)MilliporeSigmaCodice: M2393Soluzione salina completa
Supporti di montaggioBiotecnologie meridionali0100-01Fluoromount-G
PapainaWorthingtonGatto#: 9001-73-4Soluzione di lavoro Liberate TL-papain
Penicillina/streptomicinaMilliporeSigma15140122terreno di coltura/tampone FACS
Bromidrato di poli-L-lisina (PLL)MilliporeSigmaP4707piatto di coltura
Cloruro di potassio (KCl)MilliporeSigmaP5405Soluzione salina completa
Coniglio anti-CGRPImmunostar24112anticorpo
cloruro di sodio (NaCl)MilliporeSigmaS9888; CAS: 7647-14-5Soluzione salina completa
SorbitoloMilliporeSigma56755-MSoluzione salina completa
Streptavidina Alexa Fluor 647 coniugatoThermo Fisher ScientificoS21374anticorpo
SaccarosioSigma-AldrichS0389-500Gsoluzione fissativa
Inibitore della tripsinaMilliporeSigmaT9253; CAS: 9035-91-8BSA/TI/DMEM

References

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