Articolo metodologico

Modellazione della riparazione alveolare polmonare displastica e funzionale dopo l'infezione influenzale

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DOI:

10.3791/69062

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19 settembre 2025

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1Cancer and Developmental Biology Laboratory, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce istruzioni per la somministrazione intranasale di IAV e l'analisi a valle del danno polmonare di topo e delle modifiche trascrizionali associate ai tipi di cellule polmonari.

Abstract

L'infezione virale provoca danni sia acuti che a lungo termine agli alveoli polmonari, la struttura tissutale specializzata responsabile dello scambio di gas tra il sistema cardiovascolare e l'ambiente esterno. L'infezione da virus dell'influenza A (IAV) nei topi rappresenta un modello traduzionale per la risposta del polmone umano all'infezione virale e induce cambiamenti di stato cellulare sia transitori che persistenti negli alveoli. In alcuni casi, gli stati cellulari aberranti indotti da lesioni virali che non si risolvono nel tempo possono compromettere in modo permanente la funzione critica di scambio gassoso del polmone. Questo articolo dimostra i metodi per l'infezione intranasale di topi con IAV A/PR/8/34 e la caratterizzazione di alterazioni transitorie e di lunga durata della composizione cellulare e della struttura tissutale dei polmoni danneggiati. Questo modello consente un'indagine dettagliata sui meccanismi molecolari e cellulari alla base della riparazione polmonare e della disfunzione cronica. Questo approccio offre anche una piattaforma per la valutazione di interventi terapeutici volti a promuovere un'efficace rigenerazione polmonare e ripristinare la funzione respiratoria dopo un danno virale.

Introduzione

I polmoni svolgono un ruolo cruciale nel fornire ossigeno e sostanze nutritive ai tessuti locali. Le cellule endoteliali (EC) che popolano i piccoli vasi sanguigni capillari dei polmoni sono essenziali per il corretto funzionamento del tessuto polmonare, mantenendo l'integrità vascolare e l'efficiente scambio gassoso1. Le EC formano la nicchia vascolare e interagiscono reciprocamente con altre cellule come le cellule epiteliali, le cellule immunitarie e le cellule mesenchimali. Ciò contribuisce alla regolazione dello sviluppo polmonare e della riparazione tissutale in risposta a lesioni o malattie2.

L'infezione da virus H1N1 dell'influenza A è un problema mondiale3. Ai pazienti con infezione da H1N1 viene spesso diagnosticato un danno alveolare diffuso essudativo (DAD)4. L'infezione da H1N1 può portare a gravi danni polmonari e gravi conseguenze, tra cui polmonite, grave danno polmonare acuto (ALI) e sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS)5. Il danno deriva principalmente dal virus che infetta le cellule epiteliali polmonari, il che provoca un'eccessiva risposta immunitaria con conseguente infiammazione, danno tissutale e accumulo di liquidi nei polmoni. Le cellule epiteliali che rivestono le vie aeree e gli alveoli, che sono responsabili dello scambio di gas, sono quindi direttamente danneggiate dal virus H1N1, portando alla rottura della normale struttura del polmone 6,7. È diventato chiaro che altri tipi di cellule, sebbene non direttamente infettate da IAV, possono essere danneggiati in risposta all'infezione 8,9. Il danno tissutale dopo l'infezione influenzale, quindi, colpisce tutti i compartimenti cellulari del polmone ed è stato recentemente dimostrato che l'infezione da IAV provoca cambiamenti sia transitori che persistenti dello stato cellulare in più compartimenti cellulari9. Questa plasticità cellulare in risposta alla malattia può essere utile o dannosa per il successo della riparazione dei tessuti e giustifica ulteriori studi.

Il modello sperimentale più adottato per lo studio dell'influenza e della sua patogenesi è l'infezione intranasale di topi con virus influenzale A/PR/8/3410. Si tratta di una tecnica importante che consente lo studio della gravità della malattia, della mortalità e dell'infettività virale. L'infezione intranasale dei topi imita la via naturale dell'infezione nell'uomo e consente lo studio delle risposte immunitarie adattative e innate contro il virus. Nel 1934, un ceppo specifico del virus dell'influenza A "A/PR/8/34" fu isolato da un paziente a Porto Rico11. Questo ceppo del virus dell'influenza è stato ora adattato al topo e non infetta più in modo produttivo gli esseri umani. A causa delle somiglianze nel sistema immunitario del topo e in quello umano, i topi sono il modello animale più popolare per la ricerca IAV12. In questo metodo, il ceppo A/PR/8/34 H1N1 viene somministrato direttamente ai topi attraverso le narici, imitando un'infezione naturale13. È un metodo semplice, economico e conveniente per studiare gli effetti dell'infezione virale sul tessuto polmonare dell'ospite in condizioni wild-type (WT) e knockout (KO). Le tecniche alternative presentano vantaggi e svantaggi rispetto al modello intranasale. L'inoculazione intratracheale (IT) consente una somministrazione accurata del virus nei polmoni, ma questa tecnica non imita completamente l'infezione per inalazione e non fornisce informazioni sulla tossicità nel tratto respiratorio superiore. L'inoculazione IT richiede anche una grande abilità per ridurre il rischio di lesioni tracheali13,14. L'inoculazione per inalazione di aerosol (AR) imita la via naturale dell'infezione e crea una patologia polmonare più uniforme rispetto all'infezione intranasale, ma può essere difficile mantenere una concentrazione uniforme del virus nell'aerosol e ottenere una somministrazione accurata di aerosol virale. Anche la sicurezza è una preoccupazione importante del metodo di inoculazione AR10. Pertanto, la tecnica di inoculazione intranasale della somministrazione di IAV è un approccio cruciale alla ricerca incentrata sulla pneumologia sugli effetti a valle dell'infezione virale nel danno e nella riparazione dei tessuti. A differenza dei modelli chimici o meccanici, fornisce un modo più realistico e meno invasivo per studiare il danno polmonare indotto dall'influenza e le interazioni ospite-patogeno.

Qui, stabiliamo un metodo riproducibile per l'infezione intranasale di topi con virus dell'influenza A (A/PR/8/34) e per caratterizzare i cambiamenti cellulari e strutturali a breve e lungo termine nell'alveolo polmonare che derivano dal danno virale. Gli studi che utilizzano questo metodo possono aiutare nella scoperta dei meccanismi di danno e riparazione del tessuto polmonare per identificare nuovi bersagli terapeutici per le malattie polmonari.

Protocollo

Lavorare con il virus dell'influenza A in un modello animale è considerato di livello di biosicurezza 2 (BSL2) e di biosicurezza animale di livello 2 (ABSL2). Tutte le procedure sugli animali utilizzate per generare questi dati sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health (Protocollo #24-452). Questo protocollo è approvato anche dal Comitato Istituzionale per la Biosicurezza del Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Prima di iniziare questo protocollo, si raccomanda agli utenti di richiedere l'approvazione del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e del comitato istituzionale per la biosicurezza.

1. Preparazione del materiale di lavoro

NOTA: Tutti i lavori con il virus dell'influenza devono essere eseguiti su ghiaccio in una cabina di biosicurezza. Espellere i puntali e qualsiasi altra cosa che entri in contatto con il virus in un contenitore di candeggina al 10%. I secchielli per il ghiaccio, le pipette e le scatole dei puntali devono essere spruzzati con una soluzione di candeggina al 10% piuttosto che immersi. Incubare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Smaltire i rifiuti solidi in un contenitore per rifiuti a rischio biologico e gettare i rifiuti liquidi nel lavandino, sciacquando con acqua.

  1. Scongelare il brodo congelato (0,5 ml) di virus sul ghiaccio in una cappa di biosicurezza.
  2. Prepara un contenitore per rifiuti contenente il 10% di candeggina nell'acqua del rubinetto. Posizionare due scatole di plastica o cartone per congelatore che possono contenere fino a 100 provette per campioni in un congelatore a -80 °C per il pre-raffreddamento.
  3. Pre-etichettare 160 provette da 1,5 mL per aliquote di virus. Le provette con tappo a vite sono preferibili alle provette con tappo ribaltabile per evitare la creazione di aerosol quando si aprono le provette per l'uso virale. Mettere le provette sul ghiaccio per pre-raffreddare prima di fare aliquote di virus.
  4. Preparare aliquote da 3 μL di virus utilizzando una pipetta P20 calibrata e puntali, inserendo il virus solo in provette preraffreddate e mantenendo sempre le aliquote sul ghiaccio.
  5. Dopo aver preparato le aliquote, conservarle in una scatola per congelatore prerefrigerata etichettata con "A/PR/8/34 Influenza Virus (IAV)", il numero di catalogo, il numero di lotto e la data di scadenza.
    NOTA: Diversi lotti di virus hanno un'infettività diversa e non devono essere mescolati.
  6. Mettere la scatola in un congelatore a -80 °C. Assicurati di mantenere tutto il più freddo possibile, poiché il titolo virale diminuirà ad ogni ciclo di congelamento/scongelamento.

2. Diluizione di aliquote di virus per l'uso in esperimenti di infezione intranasale

  1. Scongelare un'aliquota da 3 μL di stock virale su ghiaccio nella cabina di biosicurezza.
  2. Effettuare una diluizione 1:100 (diluizione A) trasferendo 2 μl dell'aliquota da 3 μl in una provetta prerefrigerata da 1,5 mL contenente 198 μl di D-PBS freddo.
  3. Continuare a diluire il ceppo virale fino a raggiungere la concentrazione appropriata per 0,5-1 LD50 nel background di ceppo dei topi utilizzati. Tieni tutto in ghiaccio e usa tubi prerefrigerati per evitare di surriscaldare il virus.
    NOTA: Ad esempio, per VR-95PQ, lotto 70063082, infettare i topi con 12.600-31.500 virus CEID50/μL (scalato in base al peso corporeo) a una diluizione di 1:500.000.
  4. Dalla diluizione A (1:100), effettuare una diluizione 1:50.000 (diluizione B) aggiungendo 10 μl di diluizione A a 4990 μl di D-PBS freddo in una provetta prerefrigerata da 15 mL. Mescolare bene pipettando su e giù con una pipetta sierologica da 5 ml.
  5. Dalla diluizione B, effettuare una diluizione 1:500.000 (diluizione C) aggiungendo 200 μl di diluizione B a 1,8 mL di D-PBS in una provetta prerefrigerata da 5 mL. Mescolare bene pipettando su e giù.
    NOTA: Per determinare la diluizione ideale del virus da utilizzare nell'infezione degli animali al momento dell'acquisto di un nuovo lotto, è possibile effettuare una stima utilizzando il titolo del virus indicato nella scheda prodotto e rettificando la diluizione in base al titolo del lotto precedente. Il modo migliore per determinare la diluizione ideale è quello di titolare empiricamente il nuovo lotto di virus utilizzando topi C57BL/6 wild-type. Pianifica una gamma di diluizioni che va da 1:50.000 a 1:500.000 e ordina 1-2 gabbie di topi femmina C57BL/6 per diluizione da testare. Infettare i topi a diverse concentrazioni e monitorare la loro perdita di peso. Per testare i titoli virali, lo studio propone di utilizzare solo topi femmine per ridurre la variabilità che può essere causata da differenze di sesso o peso tra i topi. Le femmine di topo spesso si ammalano più dei maschi, probabilmente a causa delle loro dimensioni più piccole o a causa di differenze specifiche del sesso in risposta all'infezione influenzale, come accade in altre forme di lesioni polmonari di topo15. Sebbene questo non sia stato studiato in dettaglio, negli esperimenti sul titolo sono stati utilizzati topi femmina perché se il titolo è stato determinato utilizzando topi maschi, i topi femmine potrebbero morire alla dose determinata. Tuttavia, è stato riscontrato che i topi maschi si ammalano in modo apprezzabile e hanno lesioni polmonari evidenti quando vengono infettati con un titolo virale, che è stato determinato utilizzando solo topi femmine. Una diluizione ideale se si utilizzano topi di sfondo misto o outbred sarà "1 LD50", la diluizione alla quale muore il 50% dei topi C57BL/6 wild-type. I topi di razza sono più resistenti all'infezione16 e saranno feriti e si riprenderanno bene con questa diluizione. Se i topi per l'esperimento saranno su uno sfondo consanguineo C57BL/6, la dose ideale sarà la metà di questo "0,5 LD50". Poiché l'obiettivo di questi esperimenti è studiare le lesioni e la riparazione, è ideale definire una dose alla quale i topi si ammalano e perdono il 20-25% del loro peso corporeo, ma la maggior parte dei topi alla fine guarisce (Figura 1). Se tutti i topi nello studio hanno approssimativamente lo stesso peso (~25 g), è possibile somministrare il virus dell'influenza a 50 μL della diluizione appropriata a ciascun topo. Tuttavia, i topi hanno un peso compreso tra 15 e 35 g. Pertanto, somministrare 2 μL di diluizione virale per grammo di peso corporeo (ad esempio, un topo di 15 g riceverebbe 30 μL di influenza, mentre un topo di 35 g riceverebbe 70 μL). Ciò si traduce in un livello più coerente di infezione e danno tissutale tra animali di dimensioni diverse. Queste informazioni sono necessarie per pianificare il volume di diluizione C.

3. Trasporto di aliquote virali verso strutture per animali

  1. Posizionare la provetta da 5 ml con la diluizione virale finale nel ghiaccio ed etichettare il contenitore con un adesivo a rischio biologico. Rivesti una scatola di plastica per campioni con carta assorbente per assorbire eventuali fuoriuscite.
  2. Posizionare i materiali necessari per l'infezione intranasale all'interno della scatola etichettata con il rischio biologico: una pipetta P200, una scatola non aperta di puntali per pipette P200 filtrati, una penna e una provetta conica da 50 ml riempita con candeggina fresca al 10% per i rifiuti virali. Per il controllo delle infezioni, riempire una provetta da 1,5 ml con lo stesso D-PBS freddo utilizzato per diluire l'IAV.

4. Somministrazione di IAV ai topi

NOTA: Lavorare con il virus dell'influenza nella struttura per animali richiede un livello di sicurezza ABSL2. I DPI standard includono camici, un camice monouso, due cuffiette per capelli, doppi guanti in nitrile, doppi copriscarpe, occhiali protettivi (occhiali di sicurezza) e una maschera. Il virus dell'influenza diluito deve essere tenuto in ghiaccio per tutta la durata del protocollo di somministrazione per evitare la perdita di infettività.

  1. Tutti i lavori con i virus devono avvenire all'interno di una cabina di biosicurezza. Sebbene il virus dell'influenza A/PR/8/34 sia un ceppo adattato al topo, i virus influenzali sono inclini alla mutazione e, pertanto, trattano il virus come se fosse potenzialmente infettivo per l'uomo.
  2. Somministrare l'anestesia con isoflurano agli animali uno alla volta a una velocità di flusso del 2,5-3% sulla macchina vaporizzatrice. Spostare gli animali da una scatola per anestesia a un cono nasale prima di somministrare l'influenza.
  3. Quando un topo è sotto anestesia, controlla la sua respirazione e fai un pizzicotto con le dita dei piedi per vedere se reagisce. I topi sono pronti per l'infezione da IAV quando reagiscono a un pizzicotto del dito del piede con una piccola convulsione o "salto", ma non se sono abbastanza svegli da muovere la testa.
  4. Utilizzando una pipetta P200 impostata su 50 μl (o 2 μl/g di peso corporeo; vedere la NOTA al punto 2.5) in basso, aspirare l'IAV diluito (o il controllo PBS) dal flaconcino sul ghiaccio e appoggiare la pipetta sulla scatola del puntale o sul tovagliolo di carta in modo che il puntale non entri in contatto con i guanti o la superficie della cabina di biosicurezza.
  5. Sollevare il mouse anestetizzato con la collottola e tenerlo rivolto verso l'alto con un angolo di 45°. Posiziona il topo abbastanza forte da allungare la trachea per una migliore inspirazione, ma non così forte da ostruire la respirazione. Assicurati che il respiro del topo sia superficiale ma costante, senza ansimare.
  6. Pipettare lentamente la diluizione di IAV nelle narici del topo. Questa operazione può essere eseguita correttamente utilizzando uno dei due metodi, come descritto nei passaggi 4.6.1 e 4.6.2.
    1. Far cadere la diluizione virale nelle narici goccia a goccia, alternando le narici in modo che il virus entri in entrambi i lati del naso.
    2. Creare una "bolla" di virus che si estende su entrambe le narici, mantenuta mediante pipettaggio costante e lento mentre il topo inala il liquido.
      NOTA: Questo studio ha utilizzato costantemente il metodo di instillazione delle bolle, che era più controllato e riproducibile. Questo metodo consente una facile somministrazione della sospensione virale alle narici in anestesia e facilita la respirazione naturale. Il metodo dropwise è altrettanto valido, ma qualunque sia il metodo utilizzato, la coerenza del metodo dovrebbe essere applicata a tutti gli esperimenti per garantire una minore variabilità nei risultati.
  7. Tenere la punta della pipetta vicino al naso, ma non toccare il naso. Se il topo si sta svegliando, somministrare metà della dose e riportare il topo nel cono nasale dell'isoflurano prima di somministrare la seconda metà della dose.
  8. Se il topo è abbastanza sveglio da scuotere la testa, tossire o sputare il virus, è necessaria più anestesia per evitare di causare il virus aerosol e per garantire una buona infezione. Se il topo non è sveglio, somministrare l'intera dose. Se il mouse è stato riposizionato sul cono del naso, ripetere il passaggio 4.6 per somministrare l'IAV rimanente.
  9. Espellere l'ugello in un contenitore per rifiuti contenente candeggina fresca al 10%. Usa una punta fresca per ogni gabbia di topi.
  10. Dopo ogni somministrazione di IAV, tenere il mouse in posizione verticale per 1-2 minuti per mantenere aperte le vie aeree e assicurarsi che l'influenza sia stata adeguatamente trasmessa ai polmoni. Se il virus dell'influenza è stato consegnato con successo ai polmoni del topo, i crepitii possono essere avvertiti posizionando un dito su ciascun lato del torace del topo.
  11. Dopo che il mouse ha iniziato a riprendersi, riposizionalo nella gabbia per riprendersi completamente. I topi si riprenderanno rapidamente dall'isoflurano, ma devono essere monitorati fino a quando non saranno deambulanti.
  12. Registra eventi come crepitii nel torace e respirazione profonda che indicano che l'IAV è stato inalato bene, o bolle e spruzzi nasali che indicano che una parte di esso è stata espulsa dalle narici del topo. Tieni traccia di queste informazioni in un foglio di calcolo del registro degli infortuni (File supplementare 1) e in un quaderno di laboratorio.
  13. Ripetere i passaggi 4.2-4.12 per ogni topo da infettare.

5. Trasporto di ritorno al laboratorio

  1. Riposizionare 50 ml di candeggina conica e puntali nella scatola di plastica del portacampioni, insieme alla diluizione IAV residua (se presente) e agli articoli di laboratorio utilizzati per l'infezione influenzale.
  2. Una volta tornato in laboratorio, incuba tutto ciò che è entrato in contatto con il virus con il 10% di candeggina. Spruzza secchielli per il ghiaccio, pipette e scatole di puntali con una soluzione di candeggina al 10% piuttosto che immergerla. Incubare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Smaltire i rifiuti solidi nell'apposito contenitore per rifiuti a rischio biologico e gettare i rifiuti liquidi nel lavandino, sciacquando con acqua.

6. Monitoraggio dei topi e ulteriori procedure sperimentali

  1. Monitorare quotidianamente il punteggio della condizione corporea (BCS)17 e il peso corporeo di tutti i topi di controllo (PBS) e con infezione da IAV dopo l'infezione influenzale, a partire dal giorno dopo l'infezione (giorno 1) o 3 giorni dopo l'infezione (giorno 4). È improbabile che i topi infetti da IAV perdano peso sostanziale fino al giorno 4 successivo all'infezione (Figura 1).
    NOTA: I topi che perdono più del 30% del loro peso corporeo o raggiungono un punteggio di condizione corporea di 1 dovrebbero essere soppressi.
  2. Se lo si desidera, somministrare EdU ai topi mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) o nell'acqua potabile per monitorare la proliferazione cellulare dopo l'infezione influenzale.
    NOTA: Molti tipi di cellule nel polmone di topo proliferano dopo il danno indotto da IAV9. E' possibile somministrare altri farmaci, alimenti speciali o acqua speciale a piacere per specifici scopi sperimentali. Tieni presente che i topi non mangiano o bevono tanto quanto al solito durante il loro recupero dall'influenza, quindi un metodo di somministrazione basato sull'iniezione potrebbe essere più desiderabile; d'altra parte, può essere difficile iniettare nei topi un BCS di 2-2,5.

7. Prelievo di tessuto polmonare per approcci a valle

  1. Raccogli tessuto polmonare per applicazioni a valle, tra cui l'analisi in immunofluorescenza, la citometria a flusso o il sequenziamento dell'RNA a singola cellula nella struttura per topi o in laboratorio in una cabina di biosicurezza.
  2. Sopprimere i topi uno alla volta usando CO2. Non lussare cervicamente per evitare la lussazione della trachea. La toracotomia bilaterale è solitamente un metodo di eutanasia secondaria approvato.
    NOTA: Questo studio segue le linee guida approvate dall'istituto per la cura degli animali e il protocollo di eutanasia CO2 e ha costantemente utilizzato questo metodo in precedenti studi sull'influenza senza introdurre una variabilità significativa nel danno polmonare o negli esiti istopatologici. La ketamina/xilazina può anche essere utilizzata per l'eutanasia dei topi per evitare danni causati dall'inalazione di CO2 . Tuttavia, l'inalazione di CO2 è un metodo accettabile se l'acquisizione di ketamina/xilazina è troppo costosa o se ottenere una licenza DEA è troppo difficile.
  3. Sezionare la cavità toracica ed esporre la gabbia toracica e la trachea.
  4. Tagliare il diaframma e sezionarlo con cura lontano dalla gabbia toracica in modo da non perforare i polmoni. Tagliare lungo i lati della gabbia toracica e rimuovere la gabbia toracica nella parte superiore. Tagliare le clavicole e sezionare l'osso e i tessuti molli lontano dalla parte anteriore della trachea.
  5. Sezionare il muscolo e il tessuto che circonda la trachea fino a quando gli anelli della cartilagine sono visibili, ma non perforare la trachea. Usando una pinza curva, spingere l'esofago fuori da dietro la trachea e sezionarlo lontano dalla trachea.
  6. Infilare un pezzo di sutura dietro la trachea e fare un nodo di sutura sciolto (avvolgere due volte un'estremità attorno a una pinza con un'altra, afferrare l'estremità libera della sutura e tirare l'estremità libera attraverso gli anelli).
  7. Perfondere il sistema circolatorio con D-PBS. Agganciare un vaso di grandi dimensioni (sotto l'arto anteriore o nella parte inferiore del diaframma) e perfondere la D-PBS attraverso il ventricolo destro (parte inferiore del cuore, rivolta verso l'alto) spingendo lentamente sull'estremità della siringa. Se l'ago non è visibile attraverso la parete cardiaca, è probabile che si trovi nel ventricolo sinistro. Questo rimuove il sangue dai polmoni.
    NOTA: Non spingere le bolle. Se ci sono bolle nella linea, espellerle prima di spingere D-PBS con la siringa. Se la morte delle cellule endoteliali è un problema, è più delicato usare la perfusione gravitazionale piuttosto che spingere la PBS a mano.
  8. Se si raccoglie il tessuto solo per l'istologia o l'immunofluorescenza, procedere al passaggio 7.9; se si raccoglie solo per la sospensione unicellulare, tagliare tutti i lobi polmonari e metterli in PBS su ghiaccio, quindi procedere al passaggio 7.11.
  9. Inflazione polmonare per immunofluorescenza o istologia a valle:
    1. Gonfiare i polmoni in paraformaldeide al 2% (PFA) e disidratare attraverso l'etanolo per l'inclusione di paraffina o gonfiare in PFA al 2% e disidratare attraverso il saccarosio per la criosezione.
    2. Per le tecniche di rilevamento dell'RNA come l'RNAscope o la reazione a catena di ibridazione (HCR), fissare i polmoni al 4% di PFA. Per una migliore fissazione, gonfiare i polmoni in agarosio a bassissimo punto di fusione al 2% e sezionare immediatamente un microtomo vibrante in PFA al 2% o al 4% in una piastra di coltura tissutale per l'immunofluorescenza a valle.
  10. Gonfiaggio polmonare a mano:
    1. Gonfiare i polmoni a mano con una siringa e un ago da 21-23 G con o senza tubo o usando la gravità fissando un tubo di PFA a un supporto ad anello a 30 cm sopra la superficie del banco.
    2. Dopo aver isolato la trachea, inserire l'ago nella parte superiore della trachea, smussare verso l'alto, senza perforare la parte inferiore della trachea, e stringere la sutura attorno alla trachea e all'ago prima di inserire il liquido.
      NOTA: L'uso di un ago affilato comporta un leggero rischio di puntura tracheale rispetto a un ago a punta smussata e i ricercatori devono prestare molta attenzione durante la procedura per evitare danni. Se un ago affilato perfora la trachea, è necessario utilizzare un ago a punta smussata.
  11. Per creare una sospensione a singola cellula per la citometria a flusso a valle o l'analisi di sequenziamento di singole cellule, rimuovere il tessuto polmonare dal D-PBS e tritare il tessuto polmonare con le forbici, quindi tritare con una lama di rasoio per 2-3 minuti per ottenere pezzi di tessuto ancora più fini.
  12. Dissociare nel tampone digestato contenente 480 U/mL di collagenasi I, 100 μL/mL di dispasi e 2 μL/mL di DNasi in D-PBS, a 37 °C per 30-35 minuti. Filtrare attraverso filtri da 100 μm e 40 μm, lisare i globuli rossi rimanenti utilizzando il tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio (ACK) e risospendere in BSA all'1% in PBS per l'elaborazione e l'analisi a valle.
    NOTA: Per rilevare l'infezione virale e la clearance dopo l'infezione nei polmoni, è possibile valutare la carica virale utilizzando il test qRT-PCR o TCID50 in omogeneizzati polmonari per misurare la replicazione virale. La neuraminidasi e la colorazione del capside possono anche essere utilizzate per rilevare l'infezione virale. La clearance virale dovrebbe avvenire entro i giorni 8-9 successivi all'infezione18,19, mentre la riparazione e la rigenerazione del tessuto polmonare continuano per diverse settimane9.

Risultati

Rispetto ai topi non infetti, trattati con PBS, i topi infetti da IAV mostreranno un danno tissutale eterogeneo (Figura 1A). Il danno tissutale può essere quantificato utilizzando un algoritmo di clustering k-means in MATLAB20 (Figura 1B). I topi infetti da IAV inizieranno a perdere peso tra 3-4 giorni dopo l'infezione. A un titolo ideale, i topi perderanno tra il 20-30% del loro peso corporeo iniziale, con la massima perdita di peso che si verifica a 8-10 giorni dopo l'infezione (dpi) (Figura 1C). Entro 11-12 dpi, i topi dovrebbero aver iniziato ad aumentare di peso e dovrebbero tornare entro il 10-15% del loro peso corporeo iniziale di 14 dpi. Per gli studi sulla rigenerazione, è utile che la maggior parte dei topi nell'esperimento perda peso e subisca danni ai tessuti, ma non muoia. Tuttavia, a causa dell'eterogeneità del danno tissutale (Figura 1A, B) e della possibile variabilità nella somministrazione intranasale, è normale che diversi topi in un esperimento non perdano peso o subiscano danni ai tessuti e che diversi topi perdano il >30% del peso corporeo, con conseguente eutanasia (Figura 1D). Gli esperimenti che tentano di determinare una differenza nella sopravvivenza e nella perdita di peso tra, ad esempio, topi con KO di un particolare gene e i loro controlli WT potrebbero dover regolare il titolo e il dosaggio di IAV e dovranno eseguire un calcolo della potenza per determinare la dimensione del campione necessaria per rilevare tale differenza in questi due parametri.

Oltre ai cambiamenti nella struttura generale dei tessuti e nella salute del topo, i cambiamenti trascrizionali in tutti i compartimenti cellulari polmonari si verificano nel corso della risposta del tessuto al danno. Ciò include sia gli stati cellulari transitori che alla fine si risolvono quando il tessuto viene riparato, inclusi gli stati delle cellule epiteliali transizionali o intermedie e gli stati delle cellule immunitarie mieloidi, sia gli stati cellulari persistenti che non contribuiscono alla riparazione funzionale, comprese le cellule epiteliali Krt5+ e le cellule endoteliali TrkB+9. Ad esempio, nell'endotelio capillare del polmone di topo, a 6 dpi si verifica uno stato di cellula endoteliale transitoria stimolata dall'interferone, caratterizzato da un'elevata espressione di geni stimolati dall'interferone (Figura 2A). Questo stato si risolve di 11-19 dpi (Figura 2A). Uno stato endoteliale capillare indotto da lesione (iCAP) si verifica a 11 dpi, caratterizzato da un'elevata espressione di Ntrk2 (TRKB), Sparcl1 e Bnip3 (Figura 2B). A differenza dello stato di cellule endoteliali stimolato dall'interferone, lo stato di cellule endoteliali iCAP persiste nelle regioni di tessuto gravemente danneggiato ed è ancora presente un anno dopo l'infezione (Figura 2C). Dopo l'infezione insorgono anche stati transitori di cellule epiteliali alveolari, comprese le cellule di transizione alveolare e gli stati di cellule epiteliali alveolari immature di tipo I (AT1) (Figura 2D). Infine, l'infezione provoca la perdita di molti macrofagi alveolari endogeni (aMAC_a) e la loro ricostituzione sia dai monociti infiammatori (iMON) che dagli aMAC endogeni. I macrofagi alveolari a 1 anno dall'infezione hanno stati trascrizionali diversi (aMAC_a e aMAC_b) a seconda della loro origine (Figura 2E)9. Gli stati cellulari transitori e persistenti che insorgono a seguito di danno polmonare acuto meritano ulteriori studi, poiché il loro comportamento anomalo all'interno della nicchia può contribuire in modo produttivo o negativo al successo della riparazione dei tessuti e alla successiva funzione dei tessuti. I dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula sono stati precedentemente pubblicati9 e sono depositati nel Gene Expression Omnibus come GEO: GSE262927.

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Figura 1: Monitoraggio del danno polmonare e della salute degli animali. (A) Colorazione con ematossilina ed eosina (HE) di sezioni di tessuto polmonare da un polmone fintamente infetto (trattato con PBS) a sinistra e da un polmone infetto da IAV a destra. Rispetto al polmone illeso, il polmone infetto da IAV mostra un danno tissutale eterogeneo. Barre di scala, 1 mm. (B) Utilizzando un algoritmo di clustering k-means in MATLAB20, il danno tissutale può essere caratterizzato come grave (rosso), danneggiato (verde) o normale (blu). È importante notare che nel lobo polmonare trattato con PBS a sinistra, le strutture delle vie aeree sono classificate come "gravi" a causa della densità e dell'intensità di colorazione delle cellule epiteliali delle vie aeree. Tuttavia, è ancora possibile discernere facilmente la differenza tra polmoni trattati con PBS e polmoni infetti da influenza, data questa linea di base. Barre della scala, 1 mm. (C) Esempio di curva di perdita di peso da un esperimento rappresentativo di infezione da IAV in cui i polmoni di topo sono stati raccolti a 13 giorni dopo l'infezione (dpi). La curva contiene i dati di sei topi wild-type e i punti rappresentano la media, mentre le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. (D) Esempio di curva di sopravvivenza da un esperimento rappresentativo di infezione da IAV in cui i polmoni di topo sono stati raccolti a 14 giorni dopo l'infezione (dpi). La curva contiene i dati di sette topi wild-type. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Monitoraggio dei cambiamenti di stato delle cellule endoteliali capillari dopo l'infezione da IAV. (A) Uno stato EC stimolato dall'interferone si verifica a 6 dpi che si risolve tra 11-19 dpi. La rianalisi dei dati pubblicati sul sequenziamento dell'RNA a singola cellula dai polmoni di topo in diversi momenti dopo l'infezione influenzale mostra che il punteggio del modulo dell'interferone in tutti i tipi di cellule endoteliali capillari è più alto a 6 dpi. I dati sono stati rianalizzati utilizzando R e il punteggio del modulo dell'interferone si basa sull'espressione di 87 geni stimolati con interferone all'interno di ciascun tipo di cellula. CAP1, cellula endoteliale capillare di tipo 1; iCAP, cellula endoteliale indotta da lesione; CAP2, cellula endoteliale capillare di tipo 2; EC, cellula endoteliale. (B) Al contrario, uno stato EC indotto da lesione caratterizzato dall'espressione di Ntrk2 (TRKB) insorge a 11 dpi e persiste fino a un anno dopo l'infezione. Barra della scala, 500 μm. (C) I dati trascrizionali del sequenziamento dell'RNA a singola cellula delle cellule endoteliali capillari polmonari dopo l'infezione influenzale dimostrano la natura dinamica dello stato delle cellule endoteliali capillari durante la riparazione dei tessuti. (D) Le cellule epiteliali alveolari sperimentano anche plasticità cellulare dopo l'infezione influenzale. Un tipo di cellula di transizione alveolare si verifica tra 6-11 dpi e si risolve di 19 dpi. Uno stato di cella AT1 immaturo (AT1_c) si verifica a 11 dpi e persiste fino a 90 dpi. (E) Dopo l'infezione, molti macrofagi alveolari (aMAC_a) esistenti vengono persi e si osserva un afflusso di monociti infiammatori (iMON) a 6 dpi. La popolazione di macrofagi alveolari è ricostituita sia da aMAC esistenti per rigenerare la popolazione aMAC_a, sia da monociti infiammatori, generando la popolazione aMAC_b. Sebbene entrambi rappresentino uno stato macrofagico alveolare, gli aMAC risultanti possono essere distinti trascrizionalmente. I grafici in (C-E) indicano la percentuale di cellule in ciascuna popolazione in ogni punto temporale nel set di dati longitudinale sull'infezione influenzale e sono stati generati utilizzando R. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Esempio di registro delle lesioni, registro del peso e registro del punteggio della condizione corporea (BCS) per il monitoraggio degli animali dopo l'infezione influenzale. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Qui, abbiamo riportato un metodo conveniente per trasferire il virus dell'influenza nei topi per avviare un danno rapido ed efficace ai polmoni dei topi e studiare meccanismi di rigenerazione e riparazione displastica. Dimostriamo che l'inoculazione intranasale di A/PR/8/34 IAV può essere una tecnica senza stress. Ci vogliono meno di 2 minuti per topo per completare l'inoculazione dopo l'anestesia con isoflurano. Si tratta di una tecnica semplice e non invasiva di inoculazione virale che segue la via naturale dell'infezione e consente di studiare la risposta sia del tessuto che del sistema immunitario in modo più fisiologicamente rilevante. Il virus inoculato attraverso le narici del topo può indurre sia l'immunità mucosale che quella sistemica21. Ancora più importante, il danno causato dall'infezione virale è chiaramente visibile nelle fette di tessuto polmonare colorate con ematossilina e colorazione con eosina (HE)22 (Figura 1). Una cronologia completa dei cambiamenti trascrizionali attesi nei tipi di cellule polmonari in ciascun compartimento del polmone è stata precedentemente pubblicata9. Qui, abbiamo rianalizzato un sottoinsieme di questi dati per dimostrare che nei compartimenti endoteliale capillare, epiteliale alveolare e immunitario mieloide dei polmoni di topo, si verificano cambiamenti trascrizionali transitori e persistenti nel corso della risposta all'infezione influenzale da topi non infetti fino a un anno dopo l'infezione (Figura 2).

Esistono diversi passaggi critici in questo protocollo e un'appropriata risoluzione dei problemi di questi passaggi produrrà un esperimento di successo. Il virus dell'influenza A/PR/8/34 è un ceppo di influenza adattato al topo che non infetta in modo produttivo l'uomo23, ma è sempre importante seguire tutte le procedure di sicurezza indicate durante l'esperimento per evitare qualsiasi possibilità di infezione del personale di laboratorio. La somministrazione dell'anestesia con isoflurano è un passaggio fondamentale per garantire il successo della somministrazione del virus, poiché i topi non inalano bene il virus quando sono svegli. Controllare la respirazione e monitorare il movimento della testa del topo durante la procedura per assicurarsi che il virus venga inoculato in entrambe le narici. Se i topi non sono completamente anestetizzati, possono essere generate bolle che limitano l'inalazione del virus e generano aerosol. Entrambi gli esiti dovrebbero essere evitati e i topi dovrebbero essere riposizionati sul cono nasale dell'isoflurano se si osservano starnuti o bolle alle narici. Anche il monitoraggio post-infezione, come la misurazione della perdita di peso, del punteggio della condizione corporea e dello stato di salute, oltre a fornire un integratore alimentare per il recupero, è una componente importante di questo esperimento. Se si osserva che i topi non perdono peso adeguato o non hanno la quantità prevista di danno tissutale (Figura 1), è possibile che la dose sia troppo bassa; D'altra parte, se molti topi raggiungono l'endpoint di perdita di peso corporeo del 30%, è possibile che la dose sia troppo alta. In entrambi i casi, è meglio determinare la dose corretta attraverso un titolo empirico del lotto di virus utilizzando una coorte di topi C57BL/6 come descriviamo qui.

Poiché l'infezione influenzale continua ad essere prevalente in tutto il mondo, causa gravi malattie respiratorie e può essere fatale, comprendere il processo di infettività virale e la risposta cellulare all'infezione e al danno tissutale nel polmone è di primaria importanza. Il metodo di infezione intranasale descritto in questo studio può quindi aiutare nell'identificazione di importanti meccanismi regolatori e nello sviluppo di nuovi approcci terapeutici per le malattie polmonari. Inoltre, le future applicazioni della tecnica potrebbero utilizzare un diverso ceppo di virus dell'influenza adattato al topo, come l'X31, per determinare gli effetti sulla struttura e sulla funzione del tessuto polmonare in caso di infezioni respiratorie ripetute. Poiché molte persone sono soggette a più infezioni respiratorie nel corso della loro vita, una tale estensione di questo modello potrebbe avere importanti implicazioni per lo studio della rigenerazione del tessuto polmonare e, quindi, per la salute pubblica.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata dal Programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti, dal National Cancer Institute, dal Center for Cancer Research.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,5 mL tubo  Fisher Scientific02-682-557
100 & micro; Filtro per cellule MFalcone352360
Valvola conica da 15 mLFalcone352196
1x PBSGibc010010-023
40 & micro; Filtro per cellule MFalcone352340
Tubo da 5 mLGlobe6101C
Tubo conico da 50 mLFalcone352098
Stock A/PR/8/34 Virus InfluenzaleATCC VR-95PQLotti diversi hanno titoli virali differenti
Buffer di lisi ACKQualità Biologica118-156-101
Anticorpo anti-TRKBR& Sistemi DAF1494
CandegginaCloroxCandeggina al 10%
Albumina Sirica BovinaSigma AldrichA8022
Camera di induzione per anestesia CO2QualsiasiN/A
Collagenasi di tipo IGibco17100017
DAPIMilipore Sigma28718-90-3
DispasiCorningCB-40235
Strumenti per la dissezione: forbici, pinze curve, pinze dritteQualsiasiN/A
DnaseSigma Aldrich4716728001
D-PBSCorning21-031-CM
EtanoloPharmco111000200
Fiale di vetroDWK Scienze della Vita986562
Secchio di ghiaccioQualsiasiN/A
IsofluranoCovetrus29404
Aghi, 21 e sigillo; 23 GQualsiasiN/A
P20/P200 pipetta  PipetmanF144056M/F144058M,
Punte per pipette P20/P200Thomas Scientific1159M43/1159M40
Paraformaldeide (PFA) Thermo ScientificJ19943-k22%PFA
PipetmanQualsiasiN/A
Scatole per congelatori in plastica o cartoneQualsiasiN/A
Lametta di rasoioQualsiasiN/A
Ring StandQualsiasiN/A
Pipete sierologiche, 5 mLFalcone357543
Camera di isoflurano per topo a induzione a scorrimentoSomni Scientific
SuturaFisher ScientificNC9422522
Tubi a siringa e luer-lockQualsiasiN/A
Siringa, 10 mLQualsiasiN/A
Macchina per anestesia da tavolo IsofluranoOhmedaOhmeda Isotec- 4La portata dovrebbe essere 2,5 e il tanello; 3%
Agarosio a fusione ultra-bassaSigma AldrichA5030-1G
Bilancia di pesaturaOHAUSCS200

Riferimenti

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