Articolo di ricerca
CD44 facilita la patogenesi della malattia orchestrando le cascate infiammatorie e la differenziazione osteoclastica attraverso l'attivazione della via PI3K/Akt. La gliciteina esercita effetti terapeutici sulle manifestazioni di comorbidità tra osteoporosi (OP) e parodontite (PD) attraverso l'attenuazione mirata della segnalazione mediata da CD44.
Questa indagine chiarisce i determinanti molecolari critici associati alla comorbilità dell'osteoporosi (OP) e della parodontite (PD) attraverso il profilo proteomico, delineando al contempo la funzione regolatoria di CD44 nella parodontite sperimentale in un modello murino OP. La fase I ha comportato la raccolta di campioni di siero da pazienti con OP+PD (n = 3) e controlli sani (n = 6) sottoposti a valutazioni sanitarie di routine presso il nostro istituto per l'analisi proteomica comparativa. La successiva validazione traduzionale dei geni differenzialmente espressi (DEG) e delle cascate di segnalazione associate è stata condotta su campioni clinici e modelli murini OP+PD. Per caratterizzare meccanicamente il ruolo di CD44 nella progressione della PD in condizioni osteoporotiche, è stato generato un modello murino OP attraverso l'ovariectomia bilaterale, seguita dall'induzione sperimentale della PD tramite il posizionamento della legatura. Le valutazioni complete hanno incluso alterazioni istomorfometriche tramite colorazione ematossilina-eosina, analisi microarchitettoniche dell'osso nella regione del primo molare mascellare mediante micro-CT e valutazione dell'immunoblotting dei componenti della via fosfoinositide-3-chinasi (PI3K)/Akt. È stato eseguito uno screening farmacologico in rete parallela accoppiato a simulazioni di docking molecolare per identificare costituenti bioattivi di Angelica sinensis con potenziale terapeutico. L'interrogazione proteomica ha identificato CST3, A2M, CD44, CDH13, CETP e VWF come mediatori patogeni candidati nella patogenesi OP+PD. Nelle nostre mani, l'analisi dell'arricchimento del set genico ha rivelato che la segnalazione PI3K/Akt funziona come principale mediatore della progressione della malattia OP+PD. La validazione quantitativa basata sulla PCR a trascrizione inversa ha confermato una significativa sovraregolazione di CD44 sia nelle coorti cliniche che sperimentali OP+PD. La modulazione in vivo tramite soppressione di CD44 ha ripristinato significativamente l'integrità del tessuto parodontale, ridotto l'infiltrazione di cellule infiammatorie e rafforzato la microarchitettura ossea alveolare nei topi OP, in concomitanza con l'inibizione della via PI3K/Akt. La farmacologia di rete ha rivelato che la gliciteina è il principale fitochimico bioattivo nell'Angelica sinensis, con il CD44 identificato come bersaglio molecolare centrale. La gliciteina ha migliorato la struttura ossea alveolare nei topi OP+PD, aumentando la frazione di volume osseo (BV/TV), lo spessore trabecolare (Tb.Th), la densità minerale ossea (BMD) e riducendo il numero di trabecolari (Tb.N), il rapporto superficie-volume osseo (BS/BV), indicando una qualità ossea più sana, meccanicamente attribuito all'attenuazione dell'asse di segnalazione CD44.
La parodontite (PD) è una malattia microbica complessa e mista causata dalla deposizione di biofilm patologici nel solco gengivale1. È caratterizzato da uno squilibrio nell'ambiente microecologico che innesca una cascata infiammatoria patologica all'interno dell'ospite, portando infine a un danno progressivo irreversibile al cemento, al legamento parodontale e all'osso alveolare, che sono componenti del sistema di attacco parodontale. Ciò può causare l'allentamento o addirittura la perdita dei denti2. La quantità è stata standardizzata per la comparabilità e i dati epidemiologici più recenti3 indicano che oltre 1,066 miliardi di individui a livello globale soffrono di parodontite grave, con una prevalenza standardizzata per età di circa il 12,5%, evidenziando una notevole variazione tra le popolazioni internazionali.
L'osteoporosi (OP), una malattia ossea sistemica, è caratterizzata da un sostanziale degrado della microstruttura ossea e da una perdita sistematica di massa ossea 4,5. Il rischio di fratture è notevolmente aumentato da questa debolezza strutturale, soprattutto nelle persone anziane. In particolare, le persone di età pari o superiore a 65 anni in Giappone avevano una prevalenza più elevata di malattia parodontale rispetto agli adulti di età compresa tra 30 e 64 anni. Le donne in postmenopausa hanno una maggiore incidenza di malattia parodontale e spesso sperimentano altri problemi di salute 6,7. Lo studio prevede che dal 2005 al 2025 il carico della malattia aumenterà di oltre il 50%, con un costo economico che dovrebbe aumentare da 17 miliardi di dollari a 25 miliardi di dollari. Lo studio prevede che dal 2005 al 2025 il carico della malattia aumenterà di oltre il 50%, con un costo economico che dovrebbe aumentare da 17 miliardi di dollari a 25 miliardi di dollari. Questa tendenza evidenzia il significativo impatto socioeconomico di queste malattie parodontali. Inoltre, nelle pazienti di sesso femminile con malattia parodontale e gengivite, esiste una chiara correlazione positiva tra la durata della malattia e la sua cronicità e l'aumento dei rischi per la salute8.
Studi precedenti hanno indicato che l'OP potrebbe promuovere lo sviluppo del Parkinson e viceversa a causa di fattori di rischio comuni per entrambe le malattie, come l'invecchiamento, il fumo e l'assunzione inadeguata di calcio e vitamina D. Nella popolazione femminile in postmenopausa, l'OP grave potrebbe essere accompagnata da una riduzione del contenuto di minerali mandibolari, che potrebbe essere associata a livelli carenti di attacco parodontale9. È stato dimostrato che la ridotta densità ossea associata a OP potrebbe accelerare il riassorbimento osseo alveolare indotto da PD, favorendo così l'invasione di patogeni parodontali10. Tra una serie di sfide per la salute legate all'età e ai cambiamenti fisiologici, la malattia di Parkinson e l'OP sono particolarmente importanti con l'accelerazione dell'invecchiamento della popolazione globale e l'aumento significativo del numero di donne in menopausa. Pertanto, chiarire gli indicatori rilevanti e le loro associazioni è di fondamentale importanza per la prevenzione, il trattamento e la valutazione prognostica della malattia. Motivato da questi aspetti, questo studio ha utilizzato la proteomica per lo screening di proteine chiave, con particolare attenzione alla segnalazione PI3K/Akt mediata da CD44, nello sviluppo di OP+PD, esplorando i ruoli regolatori e i possibili meccanismi delle proteine chiave utilizzando un modello sperimentale di PD nei topi OP. Ulteriore screening degli agenti terapeutici mirati presenti nell'Angelica sinensis, un'erba medicinale tradizionale cinese ampiamente utilizzata nella pratica clinica per le sue proprietà antinfiammatorie e protettive delle ossa, e precedentemente segnalata per alleviare la perdita ossea e modulare le risposte infiammatorie nell'osteoporosi e nella malattia parodontale. Guidata dalla farmacologia di rete e dal docking molecolare, la gliciteina è stata identificata come il principale fitochimico bioattivo e un candidato razionale per l'intervento OP+PD.
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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il protocollo di studio è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico Animale. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza degli animali.
Questo studio si propone di valutare il ruolo della regolazione mediata da CD44 della via PI3K/Akt nel differenziamento osteoclastico e nella progressione infiammatoria durante la comorbilità di osteoporosi e parodontite (OP+PD) e determinare se la gliciteina, un composto bioattivo di Angelica sinensis, può modulare terapeuticamente questi effetti. Il razionale deriva da prove emergenti che collegano la sovraespressione di CD44 al riassorbimento osseo patologico e alla disregolazione immunitaria in OP+PD 11,12,13. Integrando la proteomica, la modellazione in vivo e la farmacologia di rete, il protocollo studia sistematicamente i meccanismi molecolari e gli interventi terapeutici per mitigare la progressione della malattia14.
La dimensione del campione per gli esperimenti in vivo si è basata su studi precedenti e sull'analisi della potenza, risultando in n = 6 per gruppo, che garantisce un'adeguata potenza statistica per rilevare differenze significative (P < 0,05) tra le condizioni di trattamento. La gliciteina è stata somministrata a dosaggi di 50 mg/kg e 100 mg/kg, sospesa in DMSO al 5% in olio d'oliva e somministrata tramite gavagage orale giornaliero. I topi sono stati monitorati per 8 settimane dopo l'induzione della PD. Il posizionamento della legatura per indurre l'infiammazione parodontale ha utilizzato filo di seta 5-0 e l'ovariectomia bilaterale è stata eseguita in anestesia sodica con pentobarbital allo 0,3% (0,5 ml/100 g)15. Inoltre, i saggi molecolari, tra cui RT-qPCR, western blotting ed ELISA, sono stati condotti utilizzando protocolli convalidati16 e le valutazioni istologiche, come l'ematossilina-eosina (H&E) e la colorazione con blu di metilene, hanno seguito le tempistiche e la durata della colorazione stabilite.
Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono reagenti chimici, agenti coloranti e campioni biologici sono state condotte seguendo protocolli di biosicurezza standard per ridurre al minimo i rischi per la salute. Materiali pericolosi come formalina, EDTA, blu di metilene e fucsina acida sono stati maneggiati con dispositivi di protezione individuale (DPI), tra cui guanti, maschere e occhiali di sicurezza. Tutti i materiali di scarto, compresi i reagenti usati e i prodotti monouso contaminati, sono stati raccolti in contenitori designati per il rischio biologico e smaltiti attraverso servizi di smaltimento di rifiuti pericolosi certificati secondo le linee guida istituzionali e di sicurezza ambientale. La Figura 1 mostra il flusso di lavoro sperimentale complessivo.
Raccolta dati clinici
Nel nostro studio, abbiamo raccolto sistematicamente e analizzato in modo completo i dati clinici di base e le storie mediche dettagliate di tre pazienti OP+PD e sei soggetti di controllo, inclusi fattori demografici e stile di vita, nonché profili anatomici e metastatici. Inoltre, è stata effettuata una rigorosa conferma del risultato del test per l'infezione da HPV (positivo o negativo). Lo stadio di progressione o il modello di recidiva delle lesioni metastatiche sono stati registrati in dettaglio. Durante i primi 7 giorni di immunoterapia, i campioni di sangue dei pazienti sono stati sistematicamente raccolti e standardizzati, compresi indicatori biochimici come i test di routine del sangue. Gli esami del sangue di routine sono stati eseguiti in stretta conformità con le procedure standard per valutare accuratamente parametri chiave come piastrine, linfociti e neutrofili. L'albumina sierica è stata misurata in parallelo e la funzionalità epatica è stata valutata mediante analisi quantitativa dell'indice di concentrazione di globuline.
Pazienti
Valutazione della densità minerale ossea e stratificazione dei partecipanti
Abbiamo condotto un confronto sistematico delle misurazioni della densità ossea nella regione lombare e nel collo del femore. Tutti gli esami sono stati eseguiti da radiologi esperti del nostro reparto, utilizzando apparecchiature di precisione per quantificare con precisione i valori di densità ossea. Per garantire una raccolta standardizzata dei campioni, ai partecipanti è stato richiesto di digiunare per almeno 8 ore prima del campionamento. Integrando i dati sulla densità ossea con i dati completi della valutazione parodontale, abbiamo rigorosamente classificato i soggetti nel gruppo osteoporosi con parodontite (OP+PD) o nel gruppo di controllo sano (HC), assicurandoci che il rapporto tra i sessi fosse perfettamente abbinato tra i due gruppi. La corrispondenza del sesso si riferisce all'equa distribuzione delle femmine tra i gruppi OP+PD e i gruppi di controllo sani. Tuttavia, solo le partecipanti di sesso femminile sono state incluse in questo studio per concentrarsi sull'osteoporosi postmenopausale; Non c'erano soggetti maschi in nessuno dei due gruppi. Lo studio ha aderito alle linee guida etiche della Dichiarazione di Helsinki, con tutti i partecipanti che hanno firmato moduli formali di consenso informato, proteggendo pienamente i loro diritti.
Parametri diagnostici
L'osteoporosi è stata definita secondo le linee guida cinesi per la diagnosi e la gestione dell'osteoporosi primaria (2022)17, con soglie diagnostiche fissate a un punteggio T ≤ -2,5 deviazioni standard (SD) per la BMD lombare (L1-L4) o dell'anca. La stadiazione della parodontite ha seguito la classificazione delle malattie parodontali18 del World Workshop 2018, con l'inclusione limitata ai casi di grado A, stadio II-III. Criteri di inclusione: Donne in postmenopausa di età compresa tra 50 e 65 anni, doppia diagnosi di OP e PD che soddisfano i criteri di cui sopra, assenza di malattie autoimmuni, nessuna storia di neoplasie maligne, funzionalità cardiopolmonare, epatica e renale normale. Criteri di esclusione: Partecipazione rifiutata da parte del paziente o della famiglia, farmacoterapia recente (≤6 mesi) per OP o PD.
Profilazione proteomica di campioni di siero
Per l'analisi proteomica sono stati raccolti campioni di siero da tre pazienti OP+PD e sei soggetti di controllo. La quantificazione relativa delle proteine è stata ottenuta attraverso procedure standard e le proteine differenzialmente espresse sono state definite come quelle con P < 0,05 e variazione di piega > 1,519.
Analisi dell'arricchimento del set genico (GSEA)
GSEA è stato utilizzato per identificare le principali vie di segnalazione disregolate tra le coorti di controllo e OP+PD. I dati trascrittomici grezzi sono stati prima trasformati utilizzando la conversione log2 e normalizzati tramite normalizzazione quantilica per rimuovere gli effetti batch. I set di geni con molteplici funzioni biologiche sono stati selezionati dal Molecular Signatures Database (MSigDB) e la significatività statistica è stata valutata utilizzando il test non parametrico della somma dei ranghi di Wilcoxon. I risultati dell'arricchimento sono stati riportati utilizzando punteggi di arricchimento normalizzati e tassi di false scoperte (FDR < 0,25).
Analisi della rete di co-espressione genica ponderata (WGCNA)
Il WGCNA è stato utilizzato per identificare i moduli genici significativamente associati ai fenotipi OP+PD. È stata selezionata una potenza di soglia morbida di 12 per ottenere una topologia di rete senza scala (R2 > 0,85) e l'analisi di correlazione di Pearson è stata utilizzata per valutare le relazioni tra gli autogeni dei moduli e i tratti clinici. Sono state condotte analisi di arricchimento funzionale per scoprire percorsi biologici rilevanti in moduli fortemente correlati.
Definizione di modelli murini di osteoporotica indotta da ovariectomia
Questo studio ha coinvolto 116 topi femmina di grado SPF. Prima degli esperimenti, gli animali sono stati alloggiati in condizioni di temperatura e umidità controllate per una fase di adattamento di 7 giorni, durante la quale sono stati somministrati cibo standardizzato per roditori e acqua distillata. Tutte le procedure di gestione degli animali hanno seguito rigorosamente i protocolli etici approvati dal Comitato Etico del Centro di Scienze della Salute dell'Università di Xi'an Jiaotong, con l'approvazione ID 0609. Lo studio è stato registrato con il numero di progetto [2024-054].
Protocollo chirurgico per ovariectomia bilaterale (OVX):
I topi sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico allo 0,3% (0,5 ml/100 g di peso corporeo). Il pelo dorsale è stato depilato chirurgicamente e gli animali sono stati posizionati in decubito dorsale su una piattaforma chirurgica riscaldata e sterile. Dopo una preparazione asettica con etanolo al 75%, sono state praticate incisioni paravertebrali bilaterali (1 cm lateralmente alla colonna vertebrale) a livello dei cuscinetti adiposi renali. La borsa ovarica è stata esteriorizzata e l'ovidotto è stato legato prossimalmente all'ovaio utilizzando suture di seta 5-0, seguite dall'escissione delle ovaie bilaterali, del tessuto adiposo associato e delle strutture oviduttali parziali. Gli strati muscolo-fasciali e cutanei sono stati chiusi in sequenza con suture riassorbibili 4-0. L'antisepsi postoperatoria è stata eseguita con etanolo al 75%.
Controlli di chirurgia fittizia:
I topi operati con sham sono stati sottoposti a fasi procedurali identiche, tra cui l'esposizione ovarica e la resezione periovarica del tessuto adiposo, senza estirpazione ovarica.
Gestione postoperatoria:
Il recupero post-anestetico è stato facilitato dall'utilizzo di termofori ad acqua circolante fino alla deambulazione completa. L'analgesia è stata mantenuta tramite somministrazione sottocutanea di carprofene (5 mg/kg al giorno) per 72 ore dopo l'intervento, integrata con penicillina G profilattica (50.000 UI/kg) per 48 ore per prevenire le infezioni del sito chirurgico. La massa corporea è stata monitorata settimanalmente durante la fase di modellazione osteoporotica di 6 settimane, con criteri di esclusione applicati agli animali che presentavano una perdita di peso del >20% o distress clinico.
Costruzione di un modello animale sperimentale OP+PD
Il modello sperimentale di PD è stato sviluppato sulla base del modello animale OP precedentemente stabilito. Per evitare la rottura del filo e garantire un inserimento regolare tra i molari, per la legatura è stata utilizzata una sutura di seta 5-0. Durante la procedura, l'angolo della bocca del topo è stato delicatamente retratto e il filo è stato afferrato con una pinza e posizionato con cura nella regione cervicale tra il primo e il secondo molare. Il filo e la punta della pinza sono stati mantenuti in piano per ridurre al minimo il trauma alla mucosa buccale, riducendo così il rischio di sanguinamento o mortalità. L'altra mano tirava delicatamente l'estremità opposta del filo, guidandolo gradualmente nello spazio interprossimale tra i molari. Una volta posizionato correttamente il filo, una sezione vicino al lato vestibolare è stata bloccata con una pinza e fatta passare con cura tra il secondo e il terzo molare utilizzando la stessa tecnica. La delicata trazione verso il basso ha assicurato un passaggio regolare della seta. Infine, il filo è stato legato saldamente attorno al secondo molare nella regione cervicale media. I topi sono stati successivamente lasciati riprendersi.
Reazione a catena quantitativa a trascrizione inversa della polimerasi (RT-qPCR)
La tabella dei materiali elenca sequenze di primer dirette e inverse specifiche per i geni che hanno come bersaglio la RT-qPCR correlati all'infiammazione, alla coagulazione e all'adesione cellulare, tra cui CD44, CDH13, VWF e GAPDH. Le sequenze di primer utilizzate per l'analisi RT-qPCR sono riassunte nella Tabella 1.
Analisi del western blot
Le caratteristiche di espressione delle proteine chiave della via di segnalazione nei tessuti parodontali sono state studiate sistematicamente utilizzando il western blotting. I tessuti parodontali sono stati sottoposti a omogeneizzazione di congelamento-disgelo utilizzando tampone RIPA, contenente inibitori della proteasi e della fosfatasi, per estrarre in modo efficiente le proteine totali. Dopo la centrifugazione ad alta velocità (12.000 × g, 4 °C, 10 min) per separare il lisato, il surnatante è stato utilizzato per misurare con precisione la concentrazione proteica con un kit BCA, fornendo dati affidabili per gli esperimenti successivi.
Per ogni gruppo sperimentale, 30 μg di proteina totale sono stati caricati e separati attraverso un sistema SDS-PAGE al 10%. Le proteine risolte sono state quindi trasferite su membrane in PVDF utilizzando un metodo di blotting semi-secco. Per ridurre al minimo l'interferenza di fondo, le membrane sono state bloccate con il 5% di latte in polvere scremato per h a temperatura ambiente. Successivamente, le membrane sono state mantenute a 4 °C in un ambiente stabile per un'ulteriore lavorazione.
Le membrane sono state quindi incubate con anticorpi primari specifici (vedi Tabella dei materiali) per 2 ore a °C. Il giorno seguente, il tampone TBST è stato utilizzato per un lavaggio accurato e le membrane sono state quindi trattate con anticorpi secondari coniugati con HRP a una diluizione 1:10.000 per 1,5 ore a temperatura ambiente. Tutte le fasi dell'immunorilevazione sono state eseguite in stretta conformità con protocolli standardizzati per garantire la coerenza e la validità dell'analisi della via di segnalazione20.
Utilizzando substrati di chemiluminescenza avanzata (ECL) per catturare i segnali e apparecchiature di imaging ad alta risoluzione per localizzare con precisione le bande proteiche, i valori di densità ottica delle bande sono stati analizzati quantitativamente utilizzando il software ImageJ. In definitiva, confrontando sistematicamente i livelli di espressione relativi di proteine bersaglio/β-actina in ciascun gruppo con il gruppo di controllo, sono stati accuratamente valutati il grado di attivazione e i cambiamenti dinamici della via PI3K/Akt nell'ambito di diversi interventi.
Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)
Utilizzando i kit ELISA (vedi Tabella dei materiali), questo studio ha ottenuto una quantificazione precisa di varie citochine infiammatorie, tra cui TNF-α, IL-6, IL-1β e IL-4, in campioni di siero. Ha anche valutato le concentrazioni di TRAP5b, ALP e TGF-β come marcatori dell'attività degli osteoclasti. Una piastra a 96 pozzetti prerivestita con anticorpi di cattura è stata incubata a 25 °C con campioni di siero diluiti 1:10 in PBS per 2 ore, consentendo agli antigeni di legarsi in modo specifico agli anticorpi di cattura immobilizzati. Dopo l'incubazione, le sostanze non legate sono state rimosse mediante tre lavaggi utilizzando PBS-T (soluzione salina tamponata con fosfato con Tween-20). Successivamente, sono stati aggiunti anticorpi di rilevamento marcati con biotina e incubati per 1 ora alla stessa temperatura. Successivamente, è stata introdotta la streptavidina-HRP per legare gli anticorpi biotinilati e la miscela è stata incubata per altri 20 minuti a temperatura ambiente in condizioni di protezione dalla luce. La reazione enzimatica è stata quindi terminata utilizzando la soluzione di arresto e l'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre per determinare le concentrazioni di citochine.
Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)
Sono stati utilizzati metodi standard per eseguire la colorazione H&E su sezioni di tessuto parodontale incluse in paraffina per analizzare i cambiamenti microstrutturali. Il processo di preparazione del campione ha comportato la fissazione iniziale in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore, seguita da disidratazione graduata con etanolo (70%, 80%, 95% e 100%) e chiarificazione in xilene, e infine inclusione in paraffina per produrre sezioni spesse 4 μm21. Dopo la deceratura in xilene, i campioni sono stati reidratati attraverso concentrazioni discendenti di etanolo (dal 100% al 70%). Il processo di colorazione è iniziato con un'immersione di 5 minuti in ematossilina (Meisner's), seguita da risciacquo sotto acqua corrente, differenziazione in alcol acido all'1% in etanolo e un altro risciacquo. Le sezioni sono state quindi colorate con eosina allo 0,5% per 10 secondi per completare il protocollo.
Dopo la colorazione, i vetrini sono stati nuovamente disidratati in una serie di etanolo graduato, eliminati in xilene e sigillati con mezzo di montaggio. Le osservazioni sono state effettuate al microscopio dotato di obiettivi 10x e 40x per l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione. L'analisi istologica ha valutato l'integrità strutturale del tessuto connettivo parodontale, l'infiltrazione di cellule infiammatorie e la morfologia del riassorbimento osseo alveolare. Il livello di infiammazione è stato valutato utilizzando un indice di Loe-Silness migliorato, con due patologi all'oscuro dell'identità del campione che hanno valutato i campioni in modo indipendente tramite una scala semiquantitativa per garantire l'oggettività e la riproducibilità22.
Colorazione blu di metilene
Questo studio ha impiegato il metodo di colorazione con blu di metilene su sezioni ossee alveolari mascellari standardizzate e lavorate per quantificare il grado di riassorbimento osseo. La procedura sperimentale è iniziata con la fissazione dei tessuti: i tessuti parodontali sono stati fissati in una soluzione di formalina neutra al 10% per 24 ore, seguita da un trattamento di decalcificazione di 21 giorni in soluzione di EDTA al 10% (pH 7,4). Dopo la decalcificazione, i campioni sono stati inclusi in paraffina e preparati in sezioni di tessuto spesse 4 μm, che sono state poi montate su vetrini silanizzati. Il processo di pretrattamento della sezione comprendeva la deceratura dello xilene, l'idratazione con etanolo a gradiente e l'incubazione in un bagno d'acqua a 60 °C. I vetrini sono stati quindi colorati con una soluzione di blu di metilene allo 0,1% per 15 minuti.
Dopo la colorazione, le sezioni sono state lavate per 1 minuto utilizzando acqua distillata preriscaldata a 60 °C, garantendo un'efficace rimozione del colorante in eccesso senza danneggiare la struttura del tessuto. Sono stati quindi controcolorati con fucsina acida allo 0,1% per 5 minuti per migliorare il contrasto tra le strutture tissutali. Questo protocollo di colorazione ha fornito una visualizzazione coerente e affidabile per l'analisi quantitativa del riassorbimento osseo alveolare23. Infine, i vetrini sono stati disidratati utilizzando etanolo graduato, eliminati in xilene e montati. Il tessuto osseo colorato è stato analizzato al microscopio a campo luminoso e sono state acquisite immagini ad alta risoluzione per valutare con precisione il riassorbimento del bordo osseo alveolare per la successiva valutazione morfologica.
Analisi di micro-tomografia computerizzata (Micro-CT)
La scansione micro-CT è stata eseguita per valutare i cambiamenti microstrutturali 3D nell'osso alveolare di topi modello OP+PD, mirando specificamente alla regione del primo molare mascellare. Dopo 8 settimane di monitoraggio postoperatorio, i topi sono stati sottoposti a eutanasia umana tramite inalazione di CO2 , un metodo adatto a preservare le strutture maxillo-facciali. I campioni mascellari sono stati quindi raccolti e fissati in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 48 ore24.
L'analisi Micro-CT è stata eseguita con le immagini DICOM ricostruite della regione mascellare importate nel software selezionando il set di dati corrispondente ai campioni scansionati. Una regione standard di interesse (ROI) è stata definita manualmente come la porzione mesiale vestibolare di un terzo della radice del primo molare mascellare delineando la struttura ossea alveolare nelle viste sagittale e coronale, e in genere sono state incluse circa 50 fette consecutive per coprire completamente la regione.
Per separare l'osso trabecolare dai tessuti molli circostanti e dal fondo, è stata applicata una soglia di densità di 180-220 mgHA/cm3 . La segmentazione è stata quindi eseguita per generare una struttura binaria che rappresenta solo l'osso trabecolare. L'analisi morfometrica è stata effettuata utilizzando il Bone Morphometry Module all'interno del software. I parametri sono stati calcolati automaticamente, tra cui la frazione di volume osseo (BV/TV), lo spessore trabecolare (Tb.Th), il numero trabecolare (Tb.N), il rapporto superficie-volume osseo (BS/BV) e la densità minerale ossea (BMD). A seguito dell'analisi, i risultati numerici sono stati esportati come fogli di calcolo.
Queste misurazioni sono state utilizzate per valutare l'entità del danno microstrutturale nell'osso alveolare associato alla condizione patologica OP+PD e per valutare l'efficacia terapeutica della gliciteina nel ripristinare la qualità dell'osso. Questo approccio ha consentito una valutazione ad alta risoluzione, riproducibile e quantitativa dell'integrità strutturale nell'ambiente osseo parodontale, offrendo informazioni morfologiche chiave sui risultati del trattamento.
Profilazione farmacologica di rete
Per studiare sistematicamente i componenti bioattivi della medicina tradizionale cinese (MTC) che possono modulare i percorsi biologici chiave rilevanti per l'osteoporosi e la parodontite in comorbilità (OP+PD), questo studio ha utilizzato un approccio di farmacologia di rete per analizzare l'Angelica sinensis. Questa pianta è stata selezionata in base al suo uso storico nella MTC per la gestione dei disturbi e dell'infiammazione legati alle ossa, compresi i sintomi associati sia all'osteoporosi che alle malattie gengivali croniche. Nella fase di screening dei composti, i principi attivi di Angelica sinensis sono stati recuperati utilizzando i database TCMSP e TCMID [i dettagli del database sono stati spostati in ToM] e filtrati utilizzando i criteri di biodisponibilità orale (OB) ≥ 30% e somiglianza al farmaco (DL) ≥0,18. Le interazioni composto-bersaglio sono state previste utilizzando STITCH, con convalida del sito bersaglio tramite DisGeNET e OMIM. L'analisi dell'arricchimento del percorso è stata condotta utilizzando la piattaforma DAVID 2021 per identificare le vie di segnalazione KEGG potenzialmente modulate dai composti selezionati. Per visualizzare le interazioni molecolari, è stata costruita una rete "compound-target-pathway" basata su indici topologici (centralità del grado, centralità dell'intersessualità). L'analisi ha identificato la gliciteina, un flavonoide naturale, come un composto con proprietà farmacocinetiche favorevoli e forte connettività con CD44, suggerendo una potenziale rilevanza terapeutica in OP+PD. Tuttavia, la gliciteina non è stata clinicamente approvata per il trattamento dell'osteoporosi o della parodontite; Questi risultati si basano su previsioni in silico e forniscono un quadro teorico per i successivi esperimenti di validazione in vivo 25.
Convalida del docking molecolare
Le strutture proteiche di CD44 (PDB ID: 1UUH) e PI3K (PDB ID: 4L23) sono state recuperate dalla RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org). Le strutture dei ligandi (gliciteina, ligustilide) sono state ottimizzate attraverso la minimizzazione dell'energia utilizzando un campo di forza molecolare. Le simulazioni di attracco sono state condotte con un algoritmo genetico secondo i seguenti parametri: 100 corse, dimensione della popolazione 150 e 25×106 valutazioni energetiche. Le tasche di legame sono state definite in base alle coordinate del ligando cristallografico (CD44: 20×20×20 Å3; PI3K: 25×25×25 Å3). Le pose di aggancio risultanti sono state classificate in base all'energia di legame (ΔG, kcal/mol) e la riproducibilità è stata convalidata utilizzando una soglia di deviazione quadratica media (RMSD) di <2,0 Å.
Valutazione terapeutica della giciteina in modelli murini OP+PD
La gliciteina (purezza ≥ 98%) è stata ottenuta da un fornitore biochimico certificato di grado analitico per esperimenti in vivo è un isoflavone naturale noto per essere presente nell'Angelica sinensis, con proprietà antinfiammatorie e osteoprotettive riportate26. La parodontite osteoporotica è stata indotta in topi femmina C57BL/6 di 11 settimane attraverso l'ovariectomia bilaterale (OVX) e l'infiammazione parodontale indotta dalla legatura. I topi sono stati randomizzati in quattro coorti (n = 6 per gruppo):
Sham: chirurgia fittizia + veicolo (5% dimetil solfossido [DMSO] in olio d'oliva, gavage orale giornaliero)
OP+PD: Modello di malattia + veicolo
OP+PD + Glicetina a basso dosaggio (50 mg/kg): modello di malattia + sospensione di gliciteina nel veicolo
OP+PD + Glicetina ad alte dosi (100 mg/kg): modello di malattia + sospensione di gliciteina nel veicolo
Analisi statistica
Sono stati eseguiti test statistici inferenziali e sono state create rappresentazioni visive dei dati per la generazione di grafici e la visualizzazione dei dati. I dati numerici sono stati espressi come media ± SD. I confronti di gruppo sono stati valutati attraverso test t non appaiati a due code, considerando valori con &l 0,05 come statisticamente significativi. Questi metodi hanno garantito la robustezza dei dati e migliorato l'affidabilità dei risultati analitici successivi.
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Profilazione proteomica di coorti OP+PD
L'analisi proteomica quantitativa del siero di pazienti OP+PD (n=3) e di controlli sani (n=6) ha identificato proteine disregolate implicate nella patogenesi della malattia. L'analisi comparativa ha rivelato nove proteine sottoregolate (APOL1, CST3, IGLV3-27, IGHV3-33, PF4, CLEC3B, SRGN, C6, SELL) e sei proteine sovraregolate (IGLV9-49, A2M, VWF, CETP, CD44, CDH13) nei sieri OP+PD rispetto ai controlli (Figura 2A, B...
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Questo studio propone un quadro di ricerca traslazionale che combina la profilazione proteomica, la validazione dell'espressione genica, la modellazione animale in vivo e la farmacologia di rete per esplorare i meccanismi molecolari alla base della comorbilità di osteoporosi e parodontite (OP+PD). L'ipotesi centrale è che CD44 modula l'asse di segnalazione PI3K/Akt, esacerbando così la perdita ossea infiammatoria in condizioni di OP+PD, e che la gliciteina, un flavonoide di Angelica sinensis, possa atte...
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Questo studio è stato sostenuto dalla Science and Technology Foundation for the Health Care Industry della provincia di Gansu, in Cina (Grant No. GSWSKY2020-77), la Fondazione provinciale per le scienze naturali del Gansu (sovvenzioni n. 25JRRA314 e 21JR7RA620), il programma provinciale per i talenti del Gansu e il programma di ricerca sull'incubazione giovanile dell'ospedale provinciale del Gansu (sovvenzione n. 23GSSYF-35).
Contributi dell'autore:
Jing Qi ha condotto la maggior parte del lavoro sperimentale e dell'analisi dei dati. Yunqing Pang ha contribuito alla raccolta dei campioni, alla cura dei dati e all'analisi statistica. Yu Wang ha assistito alla progettazione sperimentale e ha fornito supporto tecnico. Dawei Hou e Jing Wang hanno supervisionato congiuntamente il progetto, hanno rivisto criticamente il manoscritto per un importante contenuto intellettuale e hanno approvato la versione finale. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit ELISA | Biotecnologia del collegamento enzimatico di Shanghai | Quantificazione delle citochine infiammatorie (TNF-&alfa;, IL-6, IL-1β, IL-4, ALP, TRAP5b, TGF-β, VWF, CD44) | |
| Kit per estrazione dell'RNA | Shanghai Yesheng Biotecnologia | Estrazione dell'RNA sierico | |
| kit di sintesi di cDNA | Shanghai Yesheng Biotecnologia | Trascrizione inversa ad alta attività | |
| Kit qPCR | Shanghai Yesheng Biotecnologia | Amplificazione quantitativa della PCR | |
| Anticorpi (primari/secondari) | Tecnologia di segnalazione cellulare / Abcam / Hangzhou Xianli Biotechnology / Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology | Anticorpi primari specifici; controllo interno della β-actina; anticorpo secondario IgG anti-coniglio di capra | |
| Reagenti istologici | Beyotime Biotecnologie / Shanghai Shangshang | Ematossilina– colorazione con eosina e blu di metilene | |
| Substrato chemiluminescente | Yakken Biotecnologia | Rilevamento di Western blot | |
| Sistema Micro-CT | Scanco Medical AG (Viva CT40) | Analisi microstrutturale ad alta risoluzione | |
| Sistema LC-MS/MS | Thermo Scientific Q Exactive HF-X | Analisi proteomica ad alta risoluzione | |
| Software: MaxQuant (v2.1.0), Andromeda | Istituto Broad | Pre-elaborazione dei dati di proteomica | |
| Software: GSEA (v4.3.2) | Istituto Broad | Analisi dell'arricchimento del percorso | |
| Software: R (v4.0.3), WGCNA (v1.73), pheatmap (v1.0.12) | Fondazione R | Calcolo statistico, analisi di rete, clustering, heatmap | |
| Software: AutoDock 4.2, AutoDockTools 1.5.7 | L'Istituto di ricerca Scripps | Docking molecolare e definizione della griglia | |
| Software: Open Babel 3.1.1 | Progetto Open Babel | Ottimizzazione della struttura del ligando | |
| Software: PyMOL 2.5.2 | Schrö dinger, LLC | Visualizzazione dell'attracco molecolare |
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