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Articolo di ricerca
Questo studio dimostra che il decotto di Yangjing Zhongyu migliora i risultati della riproduzione assistita nelle donne con ridotta riserva ovarica migliorando la qualità degli ovociti e degli embrioni. In un modello di ratto di insufficienza ovarica prematura, il decotto ha ripristinato l'equilibrio ormonale, promosso lo sviluppo dei follicoli e modulato l'autofagia e il metabolismo dei lipidi.
Il decotto Yangjing Zhongyu (YZD), una formula tradizionale cinese a base di erbe, è stato suggerito per migliorare la funzione ovarica e gli esiti di fertilità, ma le prove cliniche standardizzate rimangono limitate. Questo studio ha valutato gli effetti della YZD nelle donne con riserva ovarica ridotta (DOR) sottoposte a fecondazione in vitro/ICSI-ET, insieme alla convalida meccanicistica in un modello di ratto di insufficienza ovarica prematura (POF). Nello studio clinico, i pazienti con DOR hanno ricevuto il protocollo standard antagonista del GnRH da solo o in combinazione con YZD. Le caratteristiche di base tra i gruppi erano comparabili e il gruppo YZD ha mostrato un numero maggiore di ovociti recuperati ed embrioni di alta qualità, oltre a migliorare i punteggi della sindrome della medicina tradizionale cinese. Parallelamente, la POF è stata indotta nei ratti e gli animali trattati con YZD hanno mostrato un miglioramento della ciclicità estrale, il ripristino dei livelli sierici di estradiolo, la riduzione dell'ormone follicolo-stimolante e un'istologia ovarica più sana. La microscopia elettronica ha rivelato che YZD ha ridotto l'eccessiva formazione di autofagosomi e l'accumulo di lipidi nelle cellule ovariche, suggerendo la regolazione dell'asse del metabolismo autofagico-lipidico. Insieme, questi risultati indicano che la YZD migliora la funzione della riserva ovarica, migliora lo sviluppo embrionale e può aumentare il potenziale di gravidanza nelle donne con DOR. Questo protocollo standardizzato fornisce un quadro riproducibile per l'integrazione di YZD nei cicli di tecnologia di riproduzione assistita, supportando il suo potenziale traslazionale nella medicina riproduttiva clinica.
La diminuzione della riserva ovarica (DOR) è una condizione clinica che compromette la salute riproduttiva femminile ed è caratterizzata da una riduzione del numero o della qualità dei follicoli ovarici1. Clinicamente, si riflette in una diminuzione della conta dei follicoli antrali, in una riduzione dei livelli dell'ormone antimulleriano (AMH) o in un aumento delle concentrazioni dell'ormone follicolo-stimolante (FSH)2. La DOR rappresenta circa il 10% dei casi di infertilità e rappresenta un importante ostacolo al successo del concepimento3. Nel contesto della tecnologia di riproduzione assistita (ART), la prevalenza della DOR è stimata tra il 19% e il 26% negli Stati Uniti4 ed è associata a tassi di gravidanza ridotti, maggiore incidenza di preeclampsia e un aumento del rischio di aborto spontaneo ricorrente5. Nonostante la disponibilità di molteplici approcci terapeutici, il miglioramento degli esiti di ART nei pazienti con DOR rimane una sfida considerevole, sottolineando la necessità di interventi nuovi ed efficaci6.
Il decotto Yangjing Zhongyu (YZD), una formulazione classica della medicina tradizionale cinese (MTC) multi-erba, è stata a lungo applicata nella pratica riproduttiva7. Si ritiene che migliori l'equilibrio endocrino e supporti la funzione ovarica, migliorando così i risultati della fecondazione in vitro e dell'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi-trasferimento di embrioni (IVF/ICSI-ET)cicli 8. I dati clinici preliminari suggeriscono che la YZD può migliorare la risposta ovarica, ma rigorosi studi meccanicistici e traslazionali sono ancora limitati. Le precise vie biologiche attraverso le quali YZD agisce nei pazienti con DOR rimangono poco chiare 9,10. La letteratura attuale indica che i composti erboristici cinesi possono influenzare il microambiente ovarico attraverso molteplici meccanismi, come la modulazione dell'espressione di AMH, l'inibizione delle vie di segnalazione correlate all'atresia follicolare, tra cui PI3K/AKT/mTOR, e la riduzione del danno da stress ossidativo. Tuttavia, queste ipotesi meccanicistiche sono in gran parte indirette e mancano di convalida sperimentale.
Questo studio affronta queste lacune integrando la valutazione clinica con la verifica sperimentale. In particolare, abbiamo esaminato gli effetti della YZD nelle donne con DOR sottoposte a ART e ne abbiamo studiato le basi meccanicistiche utilizzando un modello di ratto DOR indotto da glicosidi tritergiumatici. Negli esperimenti sugli animali, abbiamo monitorato i marcatori endocrini (estradiolo e FSH), la conta dei follicoli antrali, la formazione di autofagosomi e l'accumulo di lipidi nel tessuto ovarico. Combinando i risultati clinici con i dati meccanicistici sperimentali, questo lavoro fornisce un protocollo standardizzato per incorporare YZD nei cicli di fecondazione in vitro/ICSI-ET e offre nuove prove a sostegno del suo potenziale come terapia aggiuntiva per migliorare la riserva ovarica e gli esiti riproduttivi nelle pazienti con DOR. La novità di questo studio risiede nel suo duplice approccio, che collega l'applicazione clinica standardizzata con intuizioni meccanicistiche, che fa progredire sia la traduzione clinica che la comprensione teorica della YZD nella medicina riproduttiva.
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Tutte le procedure cliniche sono state condotte in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e sono state approvate dal Comitato Etico dell'Ospedale Changhai di Shanghai (Approvazione n. CHEC2022-156). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico del Changhai Medical College (Approvazione n. CHEC2022-156) e rispettava gli standard nazionali per la cura degli animali da laboratorio.
Caratteristiche cliniche
Reclutamento e raggruppamento dei pazienti
Da agosto 2022 a marzo 2023, 78 pazienti con infertilità con diagnosi di sindrome da deficit renale-yin10 e in cerca di ART sono stati reclutati dal Centro di Medicina Riproduttiva del Primo Ospedale Affiliato della Naval Medical University e dal reparto ambulatoriale dell'Ospedale Yueyang, Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai. I partecipanti sono stati assegnati in modo casuale a un gruppo di controllo o a un gruppo di trattamento (39 casi ciascuno) utilizzando la generazione di numeri casuali SPSS 23.0.
Criteri diagnostici
La diagnosi medica occidentale ha seguito il parere del comitato 2020 dell'American Society for Reproductive Medicine (ASRM) sugli indicatori di riserva ovarica11. I criteri includevano FSH ≥ 10 UI/L, estradiolo ≥ 80 pg/mL, conta dei follicoli antrali (AFC) < 7 e AMH < 0,5-1,1 ng/mL. La sindrome da deficit renale-yin è stata diagnosticata secondo la Ginecologia della Medicina Tradizionale Cinese12 e i Criteri di Efficacia Diagnostica delle Sindromi MTC13.
Criteri di inclusione ed esclusione
I criteri di inclusione sono stati pianificati IVF/ICSI-ET utilizzando un protocollo antagonista; storia di scarsa risposta ovarica (< 5 ovociti recuperati); età 20-40 anni; soddisfare i criteri sia DOR che della sindrome MTC; e ha firmato il consenso informato. I criteri di esclusione includevano patologia endometriale (polipi, tubercolosi, displasia, cancro), malformazione uterina, comorbidità (diabete, lupus), terapia ormonale recente (< 3 mesi), anamnesi di chirurgia pelvica, anomalie cromosomiche o allergia ai farmaci. I criteri di eliminazione sono stati applicati per la deviazione dal protocollo, gli eventi avversi, la sospensione o il concepimento spontaneo entro 2 settimane dall'arruolamento.
Metodo farmacologico
Entrambi i gruppi sono stati sottoposti a valutazione basale il giorno 2-3 delle mestruazioni mediante ecografia transvaginale e test ormonali. Il gruppo di controllo ha ricevuto il regime antagonista: FSH ricombinante o gonadotropina umana in menopausa, dose iniziale di 225 UI/die per via intramuscolare per 5 giorni, seguita da un aggiustamento della dose in base alla crescita del follicolo. Quando il diametro del follicolo principale superava i 12 mm, l'antagonista del GnRH (0,125 mg/die per via sottocutanea) veniva iniziato e continuava fino all'attivazione. Quando ≥ follicolo 1 ha raggiunto i 18 mm, ≥ 2 ha raggiunto i 17 mm o ≥ 3 ha raggiunto i 16 mm, l'ovulazione è stata innescata con 250 μg di hCG ricombinante, seguita dal prelievo degli ovociti dopo 34-36 ore.
Il gruppo di trattamento ha seguito lo stesso protocollo con l'aggiunta di Decotto di Yangjing Zhongyu (YZD), somministrato per via orale 2 volte al giorno (mattina e sera), un decotto al giorno, a partire dai giorni 2-3 del ciclo mestruale fino al giorno di attivazione. La formula clinica conteneva Rehmannia 12 g, Paeonia lactiflora 12 g, Cornus officinalis 10 g e Angelica sinensis 12 g.
Indicatori di osservazione
Gli esiti clinici includevano parametri basali di età, BMI (calcolato come peso (kg)/altezza² (m²)), durata dell'infertilità, FSH, dose/durata di gonadotropine, punteggi della sindrome da deficit renale-yin, numero di follicoli antrali (valutati mediante ecografia transvaginale, 2-9 mm di diametro), ovociti recuperati, ovociti di metafase II (MII) (identificati al momento del prelievo degli ovociti), embrioni fecondati, scissioni, embrioni di alta qualità (definiti dai criteri standard del laboratorio di embriologia), e il tasso di gravidanza clinica, che è stato definito come la presenza di un sacco gestazionale all'ecografia a 6-7 settimane di gestazione.
Animali da esperimento
Qui, 30 femmine di ratti Sprague-Dawley di grado SPF (8 settimane di età, 160-200 g) sono stati acclimatati in condizioni controllate (23 ± 2 °C, 40%-45% di umidità, ciclo luce/buio di 12 ore) con cibo e acqua ad libitum .
Preparazione del farmaco
YZD è stato preparato con Rehmannia 30 g, Angelica 15 g, Paeonia lactiflora 15 g e Cornus officinalis 15 g. Le erbe sono state decotte in acqua, filtrate attraverso un filtro a 200 maglie e concentrate a pressione ridotta a 70 °C. Le soluzioni finali per dosi basse, medie e alte erano 0,34 g/mL, 0,68 g/mL e 1,35 g/mL, corrispondenti a 0,5x, 1,0x e 1,2x della dose clinica di YZD. I decotti venivano conservati a 4 °C.
Modellazione e raggruppamento
Un modello DOR è stato indotto mediante iniezione intraperitoneale di glicosidi del tripterigio (40 mg/kg al giorno per 15 giorni). I ratti sono stati assegnati in modo casuale ai gruppi di trattamento in bianco (n = 6), modello (n = 6) e YZD (dosi basse, medie e alte; n = 6 ciascuno). La somministrazione di sonda gastrica (10 ml/kg di peso corporeo) è stata effettuata 1 volta al giorno, a partire dal primo giorno di iniezione di glicosidi del tripterigio continuata per 15 giorni.
Citologia vaginale
Le fasi del ciclo estrale sono state valutate mediante citologia esfoliativa vaginale. Gli strisci vaginali sono stati raccolti una volta al giorno (08:00-10:00) con tamponi di cotone sterili, diluiti in 30 μL di soluzione salina ed esaminati al microscopio ottico con ingrandimento 100x. Il periodo di osservazione è durato 15 giorni consecutivi. L'indice del ciclo estrale normale è stato definito come la percentuale di ratti che mostrano cicli estrali regolari di 4-5 giorni in questo periodo.
Saggi ormonali
Il sangue intero è stato raccolto in anestesia mediante puntura cardiaca alla fine del periodo di trattamento di 15 giorni, lasciato coagulare a temperatura ambiente per 30 minuti e centrifugato a 1000 x g per 15 minuti a 4 °C per ottenere il siero. I livelli di E2 e FSH sono stati misurati mediante ELISA secondo le istruzioni del produttore.
Istologia ovarica
Il tessuto ovarico è stato raccolto immediatamente dopo l'eutanasia mediante rimozione chirurgica di entrambe le ovaie, sciacquato in soluzione salina fredda per rimuovere il sangue e quindi fissato in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 24-48 ore. I tessuti sono stati disidratati in etanolo graduato, chiariti in xilene, incorporati in paraffina e sezionati a 4-5 μm. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina, disidratate, pulite e montate.
Analisi statistica
I dati sono stati analizzati utilizzando SPSS 26.0. Le variabili normali sono state espresse come media ± SD e confrontate mediante t-test; variabili non normali come mediana (IQR) e confrontate mediante test U di Mann-Whitney. Le variabili categoriali sono state espresse in % e confrontate con il test del chi-quadrato. p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Per coerenza, gli stessi metodi statistici sono stati applicati alle analisi delle figure (nessuna descrizione separata del test t di Student).
Sicurezza e smaltimento dei rifiuti
I glicosidi di paraformaldeide, xilene e triterigio sono stati trattati in cappe chimiche certificate con guanti, occhiali e camici da laboratorio; le fuoriuscite e i prodotti monouso contaminati sono stati raccolti in contenitori per rifiuti pericolosi etichettati e smaltiti secondo le SOP istituzionali di biosicurezza. Tutte le procedure che coinvolgono paraformaldeide, xilene e glicosidi del tripterigio sono state eseguite in cappe chimiche con adeguati dispositivi di protezione individuale (guanti, camici da laboratorio, occhiali). I rifiuti chimici e le carcasse di animali sono stati smaltiti secondo le linee guida istituzionali sulla biosicurezza.
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Caratteristiche cliniche
Durante lo studio, 3 pazienti nel gruppo di controllo si sono ritirati a causa dell'infezione da COVID-19 e 1 è stato escluso a causa di una funzionalità epatica anormale, lasciando 35 pazienti. Nel gruppo di trattamento, 4 si sono ritirati a causa di COVID-19 e 35 pazienti hanno completato lo studio. Pertanto, un totale di 70 soggetti sono stati inclusi...
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In questo studio, abbiamo studiato il potenziale ruolo del decotto Yangjing Zhongyu (YZD) come terapia aggiuntiva per la diminuzione della riserva ovarica (DOR) nella tecnologia di riproduzione assistita (ART). I risultati clinici hanno dimostrato che le pazienti che hanno ricevuto YZD in aggiunta al protocollo antagonista standard hanno ottenuto un numero significativamente più elevato di ovociti recuperati ed embrioni di alta qualità. Sebbene i tassi di gravidanza non differissero sign...
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Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.
Il supporto per questo lavoro proviene dal National Key Research and Development Program of China (numero di sovvenzione: 2018YFC1004900): studio sull'effetto e il meccanismo del decotto di Yangjing Zhongyu sulla regolazione del metabolita microbico erucamide nel liquido follicolare per migliorare la funzione ovarica nei ratti (numero di sovvenzione: 2024QN027)
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Centrifuga | Separazione sierica (1000 x g, 15 min, 4 °C; C) | Eppendorf 5810R | 5811 000.012 |
| Cotton cotton cotton fiagna (sterili) | Raccolta di campioni di citologia vaginale | Forniture Mediche Kangjian del Jiangsu | KJ-MW-01 |
| Kit ELISA per E2 | Quantificazione dell'estradiolo siero (rat) | Elabscience Biotechnology Inc. | E-EL-0152 |
| Kit ELISA per FSH | Quantificazione della FSH sierotica (ratto) | Elabscience Biotechnology Inc. | E-EL-R0391 |
| Etanolo (70– 100%) | Disidratazione gradata per istologia | Sinopharm Chemical Reagent Co., Cina | 100092683 |
| Vetri e vetri: copertine | Montaggio del campione | Citotest Scientific, Cina | 7101/1812 |
| Ematoxilina & Eosina | Soluzione di colorazione per istologia | Beyotime Biotechnology, Cina | C0105S |
| Microscopio ottico | Osservazione istologica e citologica | Olympus (generico, senza marchio) | CX23 |
| Paraffina | Mezzo di incorporamento | Leica Biosystems | 39601095 |
| Paraformaldeide (4%) | Fissativo per la preparazione dei tessuti | Sigma-Aldrich | P6148 |
| Soluzione salina (0,9%) | Preparazione del frottis vaginale | Sinopharm Chemical Reagent Co., Cina | 10019318 |
| Sprague– Ratti di Dawley | Animali sperimentali (femmina, 8 settimane, 160 e ndash; 200 g) | Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Tech Co., Ltd. | SCXK(Pechino) 2024-0011 |
| SPSS Software | Analisi statistica (ver. 26.0) | IBM Corp. | RRID:SCR_002865 |
| Microscopio elettronico a trasmissione | Osservazione ultrastrutturale | JEOL Ltd. | JEM-1400Plus |
| Glicosidi tripterigii | Induzione del modello di ratto DOR | Fornitore generico (senza marchio) | TG-001 |
| Xilene | Reagente di purificazione per l'istologia | Sinopharm Chemical Reagent Co., Cina | 10023418 |
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