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Articolo metodologico

Isolamento dell'RNA dall'epitelio del cristallino oculare di topo e dalle masse di massa delle cellule fibrose

909 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/69079

⸱

10 ottobre 2025

 ,  , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive in dettaglio la separazione dell'epitelio del cristallino oculare di topo e della massa cellulare delle fibre, seguita dall'isolamento dell'RNA e dall'analisi qPCR. Questo metodo consente di separare i compartimenti delle cellule del cristallino per un'analisi più dettagliata del trascrittoma e dei processi biologici nelle cellule epiteliali rispetto alle cellule di fibre differenziate.

Abstract

Il cristallino è un tessuto specializzato e trasparente nella camera anteriore dell'occhio che è composto da due tipi di cellule principali, cellule epiteliali e cellule fibrose. Un monostrato di cellule epiteliali del cristallino copre l'emisfero anteriore del cristallino, mentre la maggior parte del cristallino è composta da una massa di cellule fibrose del cristallino. Una membrana basale collagenica, nota come capsula, circonda e incapsula l'intero tessuto. Le cellule epiteliali del cristallino aderiscono fortemente alla capsula del cristallino e possono essere facilmente separate dalla massa fibrosa staccando la capsula dal tessuto. Le difficoltà nell'ottenere una concentrazione sufficiente di RNA dal basso numero di cellule epiteliali nel monostrato del cristallino hanno precedentemente ostacolato lo studio dei trascrittomi delle cellule epiteliali rispetto a quelle delle cellule fibrose. Questo protocollo presenta un metodo per separare e isolare in modo pulito i compartimenti delle cellule epiteliali e delle fibre e le fasi di concentrazione dell'RNA per consentire successivi esperimenti trascrittomici su campioni di cellule epiteliali da un singolo paio di lenti di topo. La capacità di studiare individualmente i principali tipi di cellule del cristallino aiuta a studiare i meccanismi biologici di manutenzione e disregolazione del cristallino, consentendo la caratterizzazione delle perturbazioni specifiche del tipo di cellula responsabili delle patologie del cristallino legate all'età.

Introduzione

La lente oculare è un organo trasparente che focalizza finemente la luce sulla retina per produrre un'immagine chiara. Il cristallino è composto da due tipi principali di cellule: un monostrato di cellule epiteliali che coprono l'emisfero anteriore e cellule fibrose che costituiscono la massa del tessuto (Figura 1). Il cristallino è avvolto da una membrana basale collagenica nota come capsula del cristallino, a cui aderiscono strettamente le cellule epiteliali. Man mano che il cristallino cresce, le cellule epiteliali all'equatore proliferano e si differenziano in gusci nascenti di cellule fibrose che sono stratificate sul cristallino in modo concentrico 1,2,3. La crescita del cristallino per tutta la vita dipende dalla continua proliferazione di questa piccola popolazione di cellule epiteliali equatoriali che costituiscono la zona germinativa4. Man mano che le cellule delle fibre maturano, tutti gli organelli cellulari vengono degradati per eliminare gli oggetti che diffondono la luce 5,6,7,8,9,10,11 e mantenere la trasparenza dei tessuti, e le cellule delle fibre più interne vengono infine compattate, risultando in un centro della lente rigido 9,12. A causa della capsula del cristallino circostante, non c'è ricambio cellulare nel cristallino e le fibre seminali rimangono al centro del cristallino per tutta la vita man mano che vengono aggiunte nuove fibre alla periferia del tessuto o alla corteccia. Le cellule delle fibre della lente hanno proprietà ottiche diverse a seconda della loro età e possono fornire un'istantanea temporale delle diverse caratteristiche biologiche in ogni stadio13.

Nonostante le opzioni chirurgiche disponibili, la cataratta, definita come qualsiasi opacità nel cristallino normalmente trasparente, rimane la principale causa di cecità nel mondo14. La cataratta può manifestarsi nell'epitelio del cristallino, nella corteccia o nel nucleo con diverse fisiopatologie15. Tuttavia, i meccanismi cellulari e molecolari della formazione della cataratta rimangono poco chiari16,17. Per capire meglio come prevenire questi diversi tipi di cataratta e sviluppare alternative alla chirurgia, dobbiamo capire meglio come questi diversi tipi di cellule mantengono la loro omeostasi nel cristallino.

Le cellule epiteliali e le cellule fibrose svolgono ruoli fisiologici diversi nel cristallino. La proliferazione cellulare, ad esempio, è limitata all'epitelio18 del cristallino. Nel frattempo, le fibre della lente costituiscono la massa principale della lente, fornendo struttura e proprietà di rifrazione alla lente9. Per ottenere una prospettiva più sfumata dei processi biologici coinvolti nei diversi compartimenti del cristallino, le cellule epiteliali e le cellule fibrose devono essere studiate separatamente. Qui, presentiamo un metodo per isolare l'epitelio dalla massa cellulare della fibra, estrarre l'mRNA da ciascuna frazione e analizzare questi trascritti utilizzando la reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR).

figure-introduction-1
Figura 1: Diagramma anatomico della lente. Il cristallino è composto da due tipi di cellule, un monostrato di cellule epiteliali (blu e arancione) che copre l'emisfero anteriore e una massa di fibre del cristallino (bianco). Il tessuto è circondato da una sottile membrana collagenica, nota come capsula del cristallino (abbronzatura). Le cellule epiteliali anteriori (blu) sono quiescenti mentre le cellule epiteliali equatoriali (arancione) proliferano, si differenziano e si allungano per diventare nuovi strati di cellule fibrose (bianco) alla periferia del cristallino. Le nuove generazioni di celle in fibra vengono sovrapposte alle generazioni precedenti di fibre in gusci concentrici. Le cellule più vecchie delle fibre del cristallino sono compattate al centro del tessuto. Questa cifra è stata modificata da Cheng (2024)38. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" del National Institutes of Health e un protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dell'Indiana.

1. Area di lavoro, attrezzature e preparazione dei reagenti

  1. Pipettare in autoclave i puntali prima dell'uso e designare scatole di puntali autoclavati per esperimenti con RNA per evitare la contaminazione da RNasi.
  2. Trattare la superficie di lavoro della cappa aspirante e dei pestelli per l'omogeneizzazione dei tessuti con una soluzione di decontaminazione a base di RNasi, sciacquare accuratamente con acqua deionizzata e asciugare.
  3. Immergere gli strumenti di dissezione (pinze curve, pinze diritte e forbici per microdissezione) in etanolo al 70% per 5 minuti e asciugare con una salvietta delicata prima dell'uso.
  4. Utilizzate vassoi di dissezione e piastre di Petri nuovi di zecca per le fasi di dissezione e isolamento dei tessuti.
  5. Aliquotare 400 μL di reagente freddo acido TRIzol-guanidinio-fenolo in provette per microcentrifuga da 1,5 mL prive di DNA e RNAsi nella cappa aspirante.

2. Dissezione della lente del topo

  1. Eutanasia di topi adulti utilizzando un sovradosaggio di CO2 seguito da lussazione cervicale come misura secondaria.
  2. Enuclea gli occhi usando una pinza curva.
    1. Premere delicatamente il tessuto che circonda l'occhio con la pinza, facendo sporgere l'occhio dall'orbita. Chiudere la pinza sotto l'occhio e rimuoverla tirando costantemente verso l'alto.
    2. Trasferire gli occhi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml con 750-1000 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x.
  3. Per la dissezione, trasferire gli occhi in pozzetti in un vassoio di dissezione con 1x PBS fresco.
  4. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare una pinza diritta per tenere la base del nervo ottico e tagliare il nervo il più vicino possibile all'occhio con forbici affilate per microdissezione.
  5. Inserire con cautela una pinza dritta e sottile nell'apertura in cui era stato collegato il nervo ottico e pizzicare per tenere il tessuto in posizione.
  6. Inserire la punta delle forbici per microdissezione nella stessa apertura e tagliare con cura dal polo posteriore dell'occhio verso la giunzione corneale-sclerale. Non inserire gli strumenti troppo in profondità per evitare di danneggiare l'obiettivo.
    NOTA: Il cristallino del roditore occupa un grande volume nell'occhio e, pertanto, si consigliano tagli poco profondi per evitare di perforare il cristallino.
  7. Tagliare lungo la giunzione corneale-sclerale utilizzando le forbici per microdissezione, separando almeno metà della circonferenza dell'occhio.
  8. Usa la pinza diritta per invertire delicatamente i tessuti oculari mentre spingi sulla cornea, estrudendo la lente attraverso l'incisione corneale-sclerale.
  9. Rimuovere con cautela eventuali fazzoletti grandi e attaccati dalla lente utilizzando una pinza dritta fine.
  10. Se necessario, arrotolare delicatamente la lente su una salvietta pulita e delicata utilizzando una pinza curva per rimuovere il tessuto extralenticolare aderente rimanente.
    NOTA: Arrotolare rapidamente il fazzoletto sulla salvietta dell'attività e non consentire un'eccessiva asciugatura del fazzoletto. Potrebbero esserci piccole opacità sulla superficie della lente a causa di macchie secche sulla capsula della lente. Queste opacità sono generalmente reversibili quando l'obiettivo viene riposizionato in PBS 1x e non influenzeranno i passaggi successivi.
  11. Trasferire la lente pulita in una piastra di Petri da 6 cm con 1x PBS.
  12. Usando una pinza dritta fine, perforare superficialmente la capsula del cristallino vicino all'equatore e staccare delicatamente la capsula del cristallino dalla massa della fibra. Le cellule epiteliali del cristallino rimarranno attaccate alla capsula. Rimuovere delicatamente dalla capsula eventuali pezzi di fibra di grandi dimensioni che potrebbero essersi staccati con la decapsulazione.
  13. Afferrare delicatamente la capsula con una pinza dritta e sottile e agitare il PBS 1x per rimuovere eventuali fibre rimanenti. Tutte le cellule fibrose attaccate in modo lasco si dissocieranno dalla capsula e dalle cellule epiteliali.

3. Isolamento dell'RNA

NOTA: Nella Figura 2 è mostrato un flusso di lavoro riassuntivo per l'isolamento dell'RNA.

  1. Depositare 2 capsule di lenti o 2 masse di fibre nelle rispettive provette da microcentrifuga da 1,5 mL contenenti 400 μL di reagente TRIzol freddo.
    NOTA: Le masse di fibre devono essere spostate dal piatto al tubo utilizzando una pinza curva per raccogliere il tessuto.
  2. Tappare ermeticamente e spostare i tubi in una cappa chimica per i passaggi successivi.
  3. Omogeneizzare delicatamente le masse di massa della fibra della lente usando un pestello a pellet pulito.
    NOTA: Assicurati di rompere completamente la massa della fibra.
  4. Incubare i campioni (capsule di lenti o masse di fibre omogeneizzate) in TRIzol per 30 minuti a temperatura ambiente nella cappa aspirante.
  5. Nella cappa aspirante, aggiungere 200 μl di cloroformio per 400 μl di reagente TRIzol a ciascuna provetta. Chiudere bene le provette e agitare energicamente con le mani per 15 s, mantenendo il pollice sul fondo della provetta e l'indice sul tappo.
    NOTA: Le provette per microcentrifuga da 1,5 ml indicate nell'elenco dei materiali vengono utilizzate a causa della tenuta ermetica. Se si utilizzano provette per microcentrifuga di altre marche, testare la chiusura e la tenuta della provetta prima di agitare, poiché il trizollo e la soluzione di cloroformio possono fuoriuscire da sotto il tappo delle provette che non hanno una chiusura ermetica.
  6. Incubare i campioni per 10-15 minuti a temperatura ambiente per consentire la separazione di fase.
    NOTA: Dovrebbe esserci uno strato rosa di reagenti TRIzol sul fondo della provetta contenente lipidi e proteine, uno strato bianco tra le fasi contenenti DNA e una fase acquosa chiara nella parte superiore contenente RNA. Lo strato di DNA bianco può essere più difficile da vedere nei campioni di cellule epiteliali.
  7. Centrifugare i campioni a 14.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
    NOTA: Spostare con cautela le provette dentro e fuori dalla centrifuga, facendo attenzione a non disturbare le fasi di trasferimento.
  8. Assemblare le provette e i reagenti da un kit RNA Clean e Concentrator. I tubi a colonna rotante sono inseriti in un tubo di raccolta del kit.
  9. Nella cappa aspirante, trasferire con cura la fase acquosa limpida (lo strato superiore) in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 mL, prendendo nota del volume.
    NOTA: Evitare di disturbare, toccare o sollevare lo strato di DNA bianco sotto la fase acquosa. Inclinare il tubo durante il trasferimento della fase acquosa per evitare di disturbare lo strato bianco. È preferibile lasciare una piccola quantità di fase acquosa nella provetta piuttosto che contaminare il campione. Tipicamente, per 200 μL di cloroformio aggiunto, si possono recuperare 180-190 μL di fase acquosa.
  10. Aggiungere etanolo a prova 200 alla fase acquosa in un rapporto volumetrico 1:1.
    NOTA: Il tampone legante l'RNA del kit del concentratore può essere aggiunto in un rapporto volumetrico 2:1 alla fase acquosa prima di aggiungere l'etanolo. Questo passaggio viene saltato per aumentare la resa dell'RNA e perché l'RNA ha una purezza sufficiente dopo l'isolamento.
  11. Mescolare delicatamente capovolgendo la provetta più volte o pipettando la soluzione su e giù. Trasferire la soluzione miscelata in una colonna di spin dell'RNA utilizzando un pipettatore.
    NOTA: Fare attenzione a non toccare il filtro con la punta della pipetta.
  12. Centrifughe a centrifuga a 16.000 x g per 30 s a 4 °C.
    NOTA: Si consiglia di etichettare il coperchio della colonna e il lato della provetta di raccolta per mantenere organizzati i set di provette e nel caso in cui il tappo si rompa nella successiva fase di centrifugazione.
  13. Scartare il flusso e aggiungere 400 μL di RNA Prep Buffer alla colonna di rotazione.
  14. Centrifughe a centrifuga a 16.000 x g per 30 s a 4 °C.
  15. Scartare il flusso e aggiungere 700 μL di RNA Wash Buffer alla colonna di centrifuga.
  16. Centrifughe a centrifuga a 16.000 x g per 30 s a 4 °C.
  17. Scartare il flusso e aggiungere 400 μL di RNA Wash Buffer alla colonna di centrifuga.
  18. Centrifuga le colonne di centrifuga a 16.000 x g per 1 min a 4 °C.
  19. Scartare il flusso continuo e centrifugare nuovamente a 16.000 x g per 30 s a 4°C per garantire che la colonna di centrifuga sia asciutta.
  20. Spostare la colonna di centrifuga su una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL etichettata.
  21. Aggiungere 15 μL di acqua priva di RNasi sul filtro a membrana. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Fare attenzione a non toccare il filtro con la punta della pipetta.
  22. Centrifugare la colonna di centrifuga a 16.000 x g per 30 s a 4 °C per eluire l'RNA purificato.
    NOTA: Il tappo della provetta per microcentrifuga da 1,5 mL rimarrà aperto durante la centrifugazione. Posizionare con cura le colonne di centrifuga e le provette per microcentrifuga in modo che i tappi aperti poggino contro il coperchio del rotore in modo che non oscillino e si rompano durante la centrifugazione. I coperchi devono seguire la direzione di rotazione del rotore.
  23. Rimuovete ed eliminate le colonne di rotazione. L'RNA sarà nel liquido raccolto nelle provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
  24. Chiudere ermeticamente le provette per microcentrifuga da 1,5 mL e incubare i campioni di RNA a 55-65 °C per 10 minuti per favorire la risolubilizzazione.
  25. Posizionare immediatamente i campioni sul ghiaccio dopo la fase di riscaldamento.
  26. Conservare i campioni a -80 °C o trascriverli inversamente in cDNA per la conservazione a lungo termine.
    NOTA: I campioni di RNA sono stati conservati per un massimo di 3 mesi senza alcuna perdita di concentrazione evidente. Aliquotare i campioni di RNA in volumi più piccoli per la conservazione per ridurre al minimo i cicli di gelo-scongelamento e prevenire la degradazione.

4. Misurazione della concentrazione di RNA mediante spettrofotometro UV-Vis

  1. Tenere i campioni di RNA sul ghiaccio, accendere il NanoDrop (spettrofotometro UV-Vis) e consentire l'inizializzazione dello strumento.
  2. Nel menu Acidi nucleici , selezionare il modulo di quantificazione dell'RNA.
  3. Cancellare lo spettrofotometro UV-Vis pipettando 2,0 μl di eluente dalla fase di concentrazione dell'RNA sul piedistallo, in questo caso acqua di grado molecolare. Abbassare il braccio dello strumento e leggere il campione vuoto.
  4. Sollevare il braccio dello strumento, pulire il piedistallo del sensore utilizzando una salvietta delicata pulita e asciutta, seguita da un'altra salvietta inumidita con acqua deionizzata, seguita da una salvietta asciutta ancora una volta.
  5. Se lo si desidera, inserire i dettagli del campione nell'interfaccia dello spettrofotometro UV-Vis.
  6. Caricare 2,0 μl del campione di RNA sul piedistallo, abbassare il braccio e quantificare.
  7. Ripetere i passaggi da 4.4 a 4.6 per pulire il piedistallo tra i campioni.
  8. Al termine, salvare ed esportare l'esperimento per ulteriori quantificamenti, se necessario.

5. Trascrizione inversa

  1. Utilizzando una trascrittasi inversa altamente processuale e termostabile, trascrivere 2,0 μg di RNA in fibra di lente e tutto l'RNA epiteliale estratto utilizzando il protocollo raccomandato dal produttore. Mescolare i reagenti e l'RNA per ogni campione in una provetta PCR pulita. Conservare tutte le soluzioni e i campioni di RNA sul ghiaccio.
    NOTA: Questa trascrittasi può trascrivere inversamente fino a 2,5 μg di RNA per reazione. Si presume una conversione completa da RNA a cDNA, quindi la concentrazione iniziale di RNA viene utilizzata come concentrazione presunta di cDNA.
  2. Eseguire la reazione nel termociclatore utilizzando le condizioni elencate nella Tabella 1.
  3. Conservare il cDNA trascritto inversamente a -80 °C o procedere alla fase qPCR.
    NOTA: i campioni di cDNA sono stati conservati per un massimo di 4 mesi senza alcuna degradazione evidente, poiché il cDNA è più stabile dell'RNA. I campioni possono probabilmente essere conservati più a lungo, a condizione che i cicli di congelamento-scongelamento siano ridotti al minimo.
PassoTemperatura (°C)Tempo (min)Cicli
Ricottura25101
Trascrizione inversa50101
Inattivazione enzimatica8551
Tenere4∞1

Tabella 1: Condizioni del termociclatore per la trascrizione inversa. Queste condizioni sono in sintonia con una trascrittasi inversa specifica, altamente processiva e termostabile. Le condizioni di funzionamento possono variare a seconda dell'enzima e del kit utilizzato.

6. PCR quantitativa in tempo reale

  1. Prima di iniziare le reazioni, preparare le soluzioni madre di cDNA alla concentrazione desiderata diluendole con acqua di grado molecolare. In questi esperimenti, 1 μL di cDNA sarà utilizzato a 5 ng/μL per reazioni a 5 ng/pozzetto. Conservare tutte le soluzioni e i campioni di cDNA sul ghiaccio.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare le piastre array TaqMan (formato da 0,1 mL) per consentire reazioni di 5-50 ng di cDNA per pozzetto. Fare aliquote di cDNA è utile per limitare i cicli di gelo-disgelo. In questo studio, i campioni sono stati limitati a un massimo di 5 cicli di congelamento-scongelamento.
  2. Preparare una master mix funzionante composta da Advanced Master Mix e sonde secondo le raccomandazioni commerciali. Vedere la sezione 7 per un esempio di preparazione. Conservare tutte le soluzioni e i campioni di cDNA sul ghiaccio.
    NOTA: Per pozzetto viene comunemente utilizzata una coppia di sonde con due coloranti diversi. Ad esempio, in questo studio, Crygs-FAM-MGB è stato utilizzato come gene di interesse e Ppia-VIC-MGB come controllo interno. Le raccomandazioni commerciali per le concentrazioni finali della sonda e del primer sono rispettivamente di 250 nM e 900 nM. Se un bersaglio è espresso in modo molto elevato, può essere necessaria una sonda limitata al primer per prevenire l'esaurimento dei reagenti di reazione.
  3. Caricare il cDNA stock (1 μL) in pozzetti appropriati sulla piastra qPCR, quindi la miscela master di lavoro (9 μL). Miscelare le soluzioni pipettando lentamente su e giù mentre si aggiunge la miscela master. Assicurarsi che la goccia di cDNA sia mescolata alla soluzione ed evitare bolle.
    NOTA: A seconda della sensibilità del bersaglio, potrebbe essere necessario caricare la piastra sul ghiaccio.
  4. Sigillare la piastra qPCR applicando con cura un coperchio adesivo ottico. Utilizzare un applicatore di pellicola adesiva per lisciare il coperchio e garantire una tenuta ermetica attorno a ciascun pozzetto.
  5. Piastre a vortice a 1000 giri/min per 10 s da miscelare.
  6. Centrifugare le piastre a 1000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente per assicurarsi che non vi siano bolle d'aria sul fondo dei pozzetti.
  7. Caricare la piastra in un termociclatore PCR quantitativo ed eseguirla utilizzando i cicli elencati nella Tabella 2.
    NOTA: I protocolli qPCR convenzionali sono in genere limitati a 40 cicli. È improbabile che l'aumento del numero di cicli produca risultati significativi, poiché con 40 cicli, una singola copia target può teoricamente produrre circa 1 trilione di ampliconi19.
PassoTemperatura (°C)Tempo (i)Cicli
Inattivazione dell'uracil-N-glicosilasi (UNG)501201
Denaturazione951201
Denaturazione95145
Ricottura6020
Tenere4∞1

Tabella 2: Condizioni del termociclatore per la reazione quantitativa della polimerasi a catena. Queste condizioni sono in sintonia con una serie specifica di saggi commerciali di espressione genica. Vengono utilizzati i parametri predefiniti, ad eccezione dell'aumento dei cicli di amplificazione da 40 a 45.

7. Esempio di calcolo del volume per la qPCR

NOTA: Un codice sorgente R per un calcolatore di volume per le equazioni descritte di seguito è disponibile nel File supplementare 1. Questo calcolatore è per le sonde Taqman e la miscela master elencate nella Tabella dei Materiali.

  1. Determinare il numero di pozzetti da pipettare e calcolare un eccesso minimo del 12,5%. Questa costante in eccesso (kin eccesso) compensa l'errore di pipettaggio e garantisce la disponibilità di una soluzione sufficiente. Per questo esempio, 96 pozzetti saranno utilizzati come target per la preparazione del campione.
    Equazione:
    figure-protocol-1
    Esempio:
    figure-protocol-2
    NOTA: Se l'eccesso del 12,5% non è un numero intero, un modo semplice per garantire numeri "piacevoli" nei passaggi successivi è arrotondare per eccesso al pozzo più vicino e regolare kEccesso di conseguenza.
  2. Calcolare il volume di miscelazione master di lavoro. In questi esperimenti, vengono utilizzati 1 μL di cDNA e 9 μL di master mix di lavoro per pozzetto. I volumi di cDNA e master mix possono essere regolati secondo necessità.
    Equazione:
    figure-protocol-3
    Esempio:
    figure-protocol-4
  3. Calcolare il modificatore di concentrazione (kConc). Questo modificatore viene utilizzato per creare un master mix di lavoro più concentrato che si diluirà a 1x se miscelato con cDNA.
    Equazione:
    figure-protocol-5
    Esempio:
    figure-protocol-6
  4. Calcolare il volume della sonda (20x).
    Equazione:
    figure-protocol-7
    Esempio:
    figure-protocol-8
  5. Calcolare il volume della miscela master (2x).
    Equazione:
    figure-protocol-9
    Esempio:
    figure-protocol-10
  6. Portare la miscela master di lavoro al volume calcolato utilizzando il grado molecolare H2O.
    Equazione:
    figure-protocol-11
    figure-protocol-12
    figure-protocol-13
    figure-protocol-14
    figure-protocol-15
    Esempio:
    figure-protocol-16
    figure-protocol-17
    figure-protocol-18
    figure-protocol-19
    figure-protocol-20

File supplementare 1: codice sorgente R per un calcolatore di volume. Clicca qui per scaricare questo file.

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Risultati

L'epitelio del cristallino e le fibre sono stati isolati da topi selvatici di 6-7 settimane. Per questi esperimenti sono stati utilizzati tre topi e 2 capsule di lenti o 2 masse cellulari di fibre di ciascun topo sono state raggruppate insieme per una replica biologica. Come descritto nel protocollo, l'RNA è stato estratto utilizzando la separazione di fase del reagente TRIzol. In media, una coppia di epitelio a cristallino e masse di massa di fibre ha prodotto rispettivamente 0,8 μg (SD ± 0,2) e 9,7 μg (SD ± 2,3) di RNA...

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Discussione

I passaggi qui presentati dimostrano la capacità di isolare l'RNA da compartimenti lenti separati che possono essere trascritti con successo in cDNA per metodi di biologia molecolare. A causa della natura sensibile dei metodi di analisi, è essenziale che la lente sia pulita dai tessuti attaccati nella fase di dissezione. Ciò potrebbe richiedere alcune iterazioni di rotazione della lente su un Kimwipe per ottenere una pulizia adeguata. È necessario prestare attenzione a non penetrare trop...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione R01 EY032056 (a CC) del National Eye Institute.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Centrifuga e rotoreFisher Scientifico14285554PM
Cloroformio, grado HPLCAlfa Aesar22920
Etanolo (a prova di 190)Laboratori Decon2801
Etanolo (a prova di 200)Fisher BioReagentiBP2818
Fisherbrand Pestello a pelletFisher Scientifico12-141-363
pinze, curve; Pinzette per studenti #7Strumenti di precisione mondiali501981
pinze, diritte; Dumont #5Strumenti per la scienza11252-40
pinze, diritte; Pinzette per studenti #4Strumenti di precisione mondiali501978
Kimwipes, piccoliKimberly-Clark34155Pulizia delicata per attività
Applicatore di film adesivo MicroAmpBiosistemi Applicati4333183
MicroAmp EnduraPlate Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti con codice a barreBiosistemi Applicati4483485
MicropipettatoriEppendorf  01-671-120
Microscopio, DissezioneCarl ZeissSteREO Discovery.V8
MiniAmp Copertura Adesiva OtticaBiosistemi Applicati4360954
MiniAmp TermociclatoreBiosistemi ApplicatiCodice: A37834
Miscelatore a vortice a piastre MixMateEppendorf5353000529
Acqua di grado molecolareFisher ScientificoBP28191
Spettrofotometro UV-Vis a microvolume Nanodrop OneTermo ScientificoND-ONE-W
MiniVassoi Nunc MicroWellFisher Scientifico12-565-154Vassoio di dissezione
Provette per PCRVWR201007-012
Piastra di Petri, 60 mm x 15 mmFisher ScientificoFB0875713A
Soluzione salina tamponata con fosfato, 1x Dulbecco'sGibco14190-136
Puntali per pipette, 10 &; L GraduatoStati Uniti d'America Scientific1161-3700
Puntali per pipette, 1250 &; L XL GraduatoStati Uniti d'America Scientific1161-1720
Puntali per pipette, 200 &; micro; Profilo a L GraduatoStati Uniti d'America Scientific1163-1700
Sistema di PCR in tempo reale QuantStudio 3Biosistemi ApplicatiCodice A28567
Trascrittasi inversa, SuperScript IV VILO Invitrogen11756050Trascrittasi inversa altamente processiva e termostabile
Kit RNA Clean e Concentratore 5ZymoZR1013
Acqua priva di RNasiFisher BioReagentiBP2819
RNaseZapSigmaAnno 2020Soluzione di decontaminazione con RNasi
SealRite Microcentrifuga Provette da 1,5 mLStati Uniti d'America Scientific1615-5500
Vannas SuperFine 8 cmStrumenti di precisione mondiali501778Forbici
TaqMan FAST Advanced Master Mix per qPCRBiosistemi Applicati4444557
Sonda per il saggio di espressione genica (FAM) TaqMan (MTO)ThermoFisher Scientifico4448892
TRIzolInvitrogen15596026Soluzione acido-guanidinio-fenolo
Miscelatore a vorticeTermo Scientifico88880017

Riferimenti

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