Questo studio presenta un metodo per valutare la funzione di PAK5 nell'ESCC, mostrando che la sua sovraespressione predice una cattiva prognosi e promuove la progressione tumorale attraverso l'asse di segnalazione PAK5-GAREM1.
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Articolo di ricerca
Questo studio presenta un metodo per valutare la funzione di PAK5 nell'ESCC, mostrando che la sua sovraespressione predice una cattiva prognosi e promuove la progressione tumorale attraverso l'asse di segnalazione PAK5-GAREM1.
Il carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) è una delle principali cause di mortalità correlata al cancro a livello globale, in particolare in Asia. A causa della mancanza di sintomi precoci, la maggior parte dei pazienti viene diagnosticata in stadi avanzati, limitando l'efficacia del trattamento e peggiorando la prognosi. Comprendere i meccanismi alla base dell'ESCC e identificare biomarcatori o bersagli terapeutici sono fondamentali per migliorare gli esiti per i pazienti. La proteina chinasi 5 attivata da P21 (PAK5), membro della famiglia delle proteine chinasi attivate dal mitogeno, è stata implicata in varie malignità regolando il ciclo cellulare, la migrazione e l'invasione. Tuttavia, il suo ruolo nell'ESCC rimane poco chiaro. Questo studio ha valutato l'espressione di PAK5 nei tessuti ESCC e nei tessuti normali adiacenti utilizzando l'immunoistochimica ed ha eseguito un'analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier per valutare l'associazione tra PAK5 e prognosi. Sono stati stabiliti modelli cellulari ESCC con sovraespressione e knockdown PAK5, e sono stati condotti saggi funzionali, inclusi CCK-8, formazione di colonie e saggi Transwell. Inoltre, è stato eseguito il sequenziamento dell'mRNA per identificare i bersagli a valle e le vie di segnalazione regolate da PAK5. Questi risultati hanno mostrato che l'espressione di PAK5 era significativamente elevata nei tessuti ESCC rispetto ai tessuti normali ed era associata a una prognosi scadente. I test funzionali hanno rivelato che PAK5 promuoveva la proliferazione cellulare ESCC, la formazione di colonie, la migrazione e l'invasione, mentre l'analisi trascritomica ha evidenziato GAREM1 come un effettore chiave a valle. Questi risultati indicano che PAK5 contribuisce alla progressione dell'ESCC e può fungere da biomarcatore prognostico e bersaglio terapeutico.
A livello globale, il cancro esofageo è tra le malignità più letali. In Cina, il carcinoma a cellule squamose esofagee (ESCC) rappresenta il sottotipo istologico predominante. Sebbene siano stati raggiunti progressi terapeutici, la prognosi per i pazienti ESCC continua a essere deludente, manifestandosi come un tasso di sopravvivenza a 5 anni di appena il 10% al 25%. Ciò è dovuto in gran parte alle difficoltà della diagnosi precoce e alla limitata disponibilità di terapie efficaci miratemolecolare 2. A differenza di altri tumori solidi dove le terapie mirate hanno mostrato un grande potenziale, tali approcci nell'ESCC sono ancora agli inizi, ostacolati dalla scarsità di bersagli molecolari azionabili.
PAK5, un PAK di gruppo II, integra la dinamica del citoscheletro e la segnalazione pro-sopravvivenza ed è stato collegato alla chemioresistenza in diverse neoplasie(3,4,5,6,7,8,9,10,11. Dato il ruolo prominente della segnalazione MAPK nella biologia ESCC e nella rispostaterapeutica 1,2,12, si è ipotizzato che PAK5 sia sovraregolato nell'ESCC e promuova fenotipi maligni tramite la modulazione della segnalazione MAPK, potenzialmente coinvolgendo GAREM1 come adattatore/regolatore 13,14,15,16 . Sono stati impiegati IHC quantitative, perturbazioni genetiche funzionali e profilazione trascrittomica per testare questa ipotesi.
La gestione dell'ESCC prevede tipicamente una combinazione di esofagectomia, chemioterapia e radioterapia. Sebbene l'esofagectomia possa essere curativa, comporta un alto rischio dimorbilità 4,8. Inoltre, sia la chemioterapia che la radioterapia spesso non riescono a eliminare tutte le cellule tumorali, causando resistenza, recidiva emetastasi 8,9. L'immunoterapia è recentemente emersa come un focus di rilievo nell'oncologia, dimostrando efficacia nel trattamento dei tumori avanzati. Questo crescente interesse evidenzia l'urgente necessità di nuovi biomarcatori che possano aiutare nella diagnosi precoce e nella pianificazione del trattamento per l'ESCC. Studi precedenti hanno dimostrato che altri membri della famiglia PAK, come PAK1 e PAK4, promuovono proliferazione, invasione e resistenza alla terapia nell'ESCC, sottolineando l'importanza di questa famiglia di chinasi nella biologia dell'ESCC. Tuttavia, il ruolo di PAK5, un PAK di gruppo II meno studiato, rimane poco definito, motivando l'attuale studio17,18.
La chinasi 5 attivata da P21 (PAK5), membro della sottofamiglia PAK II, è stata identificata per la prima volta come una chinasi specifica del cervello nel 2002. Situato sul cromosoma 20p12, PAK5 codifica una proteina di circa 80 kDa ed è presente principalmente nei mitocondri e nel nucleo, dove svolge ruoli diversi nella regolazionecellulare 10,11,13. Le sue funzioni nei mitocondri includono il metabolismo energetico e la regolazione, mentre la sua presenza nucleare è collegata alla trascrizione genica e al controllo del ciclo cellulare. Sebbene PAK5 sia meno studiata rispetto alle sue controparti, si ritiene che sia cruciale per lo sviluppo neurologico, la sopravvivenza cellulare e la progressione delcancro 10. In particolare, PAK5 è stato implicato nella regolazione del citoscheletro, nei meccanismi anti-apoptotici e nella proliferazionecellulare 12. La sua regolazione all'alza nelle cellule neoplastiche è stata collegata a una resistenza emergente ai farmaci, in sintonia con i risultati che associano la sovraespressione di PAK5 a una maggiore resistenza delle cellule tumorali allachemioterapia 10,11,13,14. Tuttavia, la funzione precisa del PAK5 nella progressione dell'ESCC rimane sfuggente. Questo studio approfondisce l'influenza di PAK5 sull'ambiente trascritomico ESCC e le sue implicazioni funzionali. È stata effettuata una profilazione trascrittomica per identificare alterazioni nell'espressione genica associate all'attività PAK5 nelle cellule ESCC. Inoltre, è stato generato un modello di cellule ESCC con modulazione controllata di PAK5 per chiarirne il ruolo nella crescita tumorale e nel potenziale metastatico. A differenza delle strategie convenzionali di scoperta di biomarcatori nell'ESCC che si basano principalmente su Western blotting o misurazioni di trascritti monomodali, il flusso di lavoro attuale integra immunoistochimica quantitativa, profilazione trasscrittomica e saghi funzionali. Questo approccio combinato consente una validazione simultanea molecolare e fenotipica, fornendo una visione meccanicistica migliorando al contempo la rilevanza biologica. Inoltre, il protocollo enfatizza la riproducibilità sperimentale, utilizzando campioni di tumori accoppiati e tessuti adiacenti, procedure standardizzate di immunocolorazione e input RNA di alta qualità (numero di integrità dell'RNA ≥ 7) per il sequenziamento. Queste caratteristiche migliorano la robustezza e l'applicabilità dei saghi in tutti i laboratori, in particolare per studi che cercano di definire reti regolatorie clinicamente significative guidate dalle chinasi nell'ESCC.
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Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico del Secondo Ospedale Affiliato dell'Università Medica di Hainan (Approvazione n. LW2022602), e fu ottenuto il consenso informato da ciascun partecipante in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Raccolta di campioni di pazienti e tessuti
Sono stati arruolati in totale 40 pazienti con ESCC patologicamente confermata, tutti con funzionalità epatica e renale normale prima dell'intervento. I campioni tumorali (Gruppo T) e i tessuti normali adiacenti (Gruppo N; ≥2 cm dal margine tumorale) sono stati raccolti immediatamente dopo la resezione chirurgica. I tessuti sono stati fissati al 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS a temperatura ambiente per 7 giorni prima dell'inserimento della paraffina.
2. Colorazione immunoistochimica
I blocchi incorporati in paraffina venivano sezionati a 5 μm e cotti a 60 °C per 1 ora. Le sezioni sono state deparafinizzate con sostituto dello xilene, reidratate tramite etanolo graduato e sottoposte al recupero dell'antigene in 10 mM di tampone di citrato di sodio (pH 6,0) a 95-98 °C per 20 minuti. L'attività della perossidasi endogena è stata stemperata con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti, seguita da un blocco con siero normale al 5% per 30 minuti a temperatura ambiente. Le sezioni sono state incubate durante la notte (12-16 ore) a 4 °C con anticorpo primario anti-PAK5 (diluizione 1:100, vedi Tabella dei Materiali). Dopo i lavaggi PBS, le vetrine sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rapano per 30 minuti a temperatura ambiente, sviluppate con DAB fino a quando è apparso il colore (1-5 minuti, monitorate al microscopio per evitare sovra-macchie), e controcolorate con ematossilina per 30-60 secondi. Le sezioni sono state disidratate, montate e fotografate al microscopio a campo chiaro. L'intensità della colorazione e la proporzione di cellule positive sono state quantificate utilizzando software di analisi delle immagini con almeno cinque campi casuali per sezione (ingrandimento 200×). Il metodo di quantificazione adottò il calcolo del punteggio H, con la formula: H-score = ∑ (grado di intensità di colorazione × percentuale di cellule positive) (intensità classificata come 0 = negativo, 1 = debole, 2 = moderato, 3 = forte; percentuale categorizzata come 0-25%, 26-50%, 51-75%, 76-100%). Per garantire l'affidabilità, due patologi indipendenti hanno effettuato il punteggio alla cieca, con un accordo tra osservatori di valore κ ≥ 0,75. I criteri di controllo qualità sono stati rigorosamente implementati: i controlli positivi (tessuti ESCC PAK5 positivi noti) e i controlli negativi (anticorpi primari sostituiti con PBS) devono superare la validazione; l'intensità della colorazione di fondo deve essere inferiore a una soglia preimpostata (ad esempio, punteggio H < 50); il coefficiente di variazione (CV) dei risultati di colorazione tra lotti duplicati deve essere <20% per escludere la variabilità sperimentale.
3. Linee cellulari e coltura
Le cellule KYSE-150 (ESCC umano) e HEK-293 (impacchaggio virale) sono state autenticate tramite profilazione a breve ripetizione tandem (STR) e confermate prive di micoplasma. Le cellule KYSE-150 sono state coltivate in un mezzo RPMI-1640 integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di estreptomicina). Le celle HEK-293 sono state mantenute in DMEM integrate con gli stessi additivi. Le cellule sono state sottocolte utilizzando lo 0,25% di tripsina-EDTA quando hanno raggiunto la confluenza del 70%-80%, e sono state seminate alle densità appropriate 24 ore prima di ogni esperimento.
4. Costruzione del vettore lentivale e infezione
I vettori lentivrali sono stati progettati per sovraesprimere PAK5 (pLV-EF1α-PAK5-PGK-Puro) o silenziare PAK5 (pLV-U6-shRNA-PAK5-PGK-Puro). Le cellule HEK-293 sono state seminate in piatti da 10 cm e trasfettate al 70%-80% di confluenza con il plasmide di trasferimento, i plasmidi di imballaggio (gag/pol e rev) e il plasmide dell'involucro (VSV-G) in un rapporto 4:3:1 utilizzando un reagente di trasfezione a base di lipidi, con una quantità totale di DNA di ~20 μg per piatto da 10 cm. Il substrato veniva sostituito 6-8 ore dopo la trasfezione. I soprannatanti virali venivano raccolti a 48 e 72 ore, centrifugati a 500 × g per 10 minuti per rimuovere i detriti, filtrati attraverso un filtro da 0,45 μm e concentrati o conservati a −80 °C. Per la trasduzione, le cellule KYSE-150 sono state seminate un giorno prima dell'infezione ed esposte a un supernante virale con una molteplicità di infezione (MOI) di 5-10 in presenza di 8 μg/mL di polibrene. Il MOI è stato definito come il rapporto tra unità infettive e numero di celle bersaglio. È stato condotto un pre-esperimento per stimare il MOI utilizzando il conteggio della GFP o qPCR, e è stato selezionato un MOI di 5-10. Il mezzo è stato sostituito dopo 12-16 ore e si è stabilita una curva di uccisione della puromicina trattando cellule non trasdotte con concentrazioni di puromicina variabili da 0-4 μg/mL per 72-96 ore per determinare la concentrazione letale minima. La concentrazione selezionata per la selezione era di 1-2 μg/mL, mentre quella di mantenimento era 0,5-1 μg/mL. Le cellule sono state selezionate con puromicina (1-2 μg/mL) a partire da 48 ore dopo. La sovraespressione o silenziamento del PAK5 è stata verificata tramite RT-qPCR utilizzando primer specifici per PAK5 (5′-CCAAAGCCTATGGTGGGACCC-3′, 5′ inverso-AGGCCGTTGATGGAGGTTTC-3′) e GAPDH (5′-GTGGACATCCCCCAAAGAC-3′, 5′ in rovescia-AAAGGGTGTTAACGCAACTA-3′). L'espressione relativa di PAK5 è stata calcolata utilizzando il metodo 2−ΔΔCt . Tutti gli esperimenti sono stati condotti con almeno tre repliche biologiche.
5. Saggio di viabilità delle cellule CCK-8
La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando il Kit di Conteggio Cellulare-8 (CCK-8), basato sulla riduzione del reagente WST-8 tramite deidrogenasi cellulari. Le cellule KYSE-150 a crescita logaritmicamente sono state seminate a 2.000 celle per pozzo in piastre da 96 pozzi in un mezzo completo da 100 μL. A 0 h, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h, a ciascun pozzo venivano aggiunti 10 μL di reagente CCK-8 (contenente WST-8). Dopo l'incubazione a 37 °C per 2 ore, l'assorbenza a 450 nm (A450) è stata misurata con un lettore di microplacche. Erano inclusi pozzi a vuoto contenenti solo il mezzo. Ogni gruppo sperimentale conteneva almeno tre repliche biologiche, e ogni misurazione veniva eseguita con cinque repliche tecniche.
6. Saggio di formazione della colonia
Le sospensioni a singola di KYSE-150 sono state seminate a 1.000 celle per pozzo in piastre a 6 pozzi e coltivate per 14 giorni, con il mezzo sostituito ogni 2-3 giorni. Le colonie sono state fissate con PFA al 4% per 15 minuti, colorate con viola cristallina allo 0,1% in metanolo al 20% per 15 minuti, sciacquate con acqua e asciugate all'aria. Le colonie contenenti più di 50 cellule venivano contate utilizzando software di analisi delle immagini e il tasso di formazione delle colonie veniva calcolato.
7. Saggio d'invasione di Transwell
Gli inserti con pori da 8 μm sono stati pre-rivestiti con matrice di membrana basale (50 μL per inserto, diluizione 1:8) e incubati a 37 °C per 1 ora; Il controllo qualità è stato effettuato prima della seminazione delle celle: sono stati installati inserti vuoti (senza celle) e inserti di controllo negativo (senza chemoattractant) per verificare la validità del saggio, e l'uniformità dello strato della matrice della membrana basale è stata confermata tramite ispezione visiva (o misurazione del peso per un controllo più rigoroso). Le cellule sono state difamate di siero in un mezzo FBS all'1% per 6-12 ore, e 2 cellule × 10⁵/mL (200 μL per inserto) sono state seminate nella camera superiore. La camera inferiore conteneva un mezzo da 600 μL con il 20% di FBS come chemoattraente. Dopo 24 ore di incubazione, le cellule non invase sulla superficie superiore sono state rimosse, e quelle invase sulla superficie inferiore sono state fissate con metanolo per 10 minuti e colorate con viola cristallino allo 0,1% per 15 minuti. Le cellule colorate sono state fotografate al microscopio a campo chiaro e conteggiate in almeno cinque campi microscopici casuali per inserto (ingrandimento 200×); Il conteggio è stato eseguito utilizzando un metodo cieco (il personale conteggiante non era a conoscenza degli assegnamenti di gruppo) per evitare bias soggettivi.
8. Rilevamento citometrico in flusso dell'apoptosi
Le cellule sono state prelevate (incluse quelle galleggianti), lavate due volte con PBS e risospese in tampone di legame a 1 × 106 cellule/mL. Annessa V-FITC (5 μL) e iodio di propidio (5 μL) sono stati aggiunti a 100 μL della sospensione, seguiti da incubazione a temperatura ambiente per 15 minuti al buio; dopo l'incubazione, a ciascun campione veniva aggiunto un tampone di legame di 400 μL. Prima dell'analisi citometrica del flusso, l'aggiustamento di compensazione veniva effettuato utilizzando controlli a singola colorazione (Annexin V-FITC cellule singole colorate e PI a singola colorazione) per eliminare il riversamento di fluorescenza, e il gate FSC/SSC era impostato per selezionare singole cellule (escludendo detriti cellulari e aggregati). I campioni sono stati analizzati entro 1 ora su un citometro a flusso dotato di un laser a 488 nm, con almeno 10.000 eventi acquisiti per campione. Gli indici apoptotici sono stati quantificati utilizzando software di analisi della citometria di flusso: è stata applicata una soglia di gating uniforme su tutti i campioni per garantire la coerenza, e le proporzioni delle cellule apoptotiche precoci (Annexin V⁺/PI⁻) e delle cellule apoptotiche tarde (Annexin V⁺/PI⁺) sono state riportate separatamente per caratterizzare il profilo apoptotico di ciascun gruppo.
9. Sequenziamento dell'RNA e analisi bioinformatica
L'RNA totale è stato estratto e valutato per purezza (A260/280 tra 1,8 e 2,1) e integrità (RIN ≥7 come soglia di controllo qualità). L'mRNA veniva purificato usando sfere oligo(dT), frammentato a 94 °C per 5-7 minuti e trascritto inversamente in cDNA. Le librerie venivano preparate tramite riparazione delle estremità, legatura degli adattatori e amplificazione PCR (8-12 cicli), e sequenziate su una piattaforma Illumina per generare letture a estremità accoppiate da 150 bp a una profondità di 30-50 milioni di coppie di lettura per campione. Le letture sono state tagliate e allineate al genoma di riferimento umano usando STAR o HISAT2. I conteggi genici sono stati ottenuti con featureCounts, e l'analisi differenziale dell'espressione è stata eseguita con DESeq2, applicando soglie di FDR < 0,05 e |log2 fold change| ≥ 1. L'analisi di arricchimento funzionale di geni espressi differenzialmente è stata condotta utilizzando clusterProfiler per Gene Ontology e i percorsi KEGG (con Benjamini-Hochberg (BH) corretto FDR < 0,05), e sono state costruite reti di interazione proteina-proteina utilizzando il database STRING.
10. Analisi statistica
I dati continui sono stati espressi come media ± SD da almeno tre esperimenti indipendenti. Sono stati effettuati confronti tra due gruppi con test t non accoppiati a due code, e confronti tra tre o più gruppi sono stati effettuati con ANOVA unidirezionale seguiti dal test post-hoc di Tukey. Sono stati applicati test non parametrici dove appropriato. Le distribuzioni di sopravvivenza sono state stimate tramite analisi di Kaplan-Meier con test log-rank. Per i dati RNA-seq, è stata eseguita una correzione di test multipli utilizzando il metodo Benjamini-Hochberg. I valori p esatti sono riportati nelle legende delle figure; È stata considerata la significanza statistica a p < 0,05, con * che indica p < 0,05 e **indica p < 0,01.
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PAK5 è fortemente espressa nell'ESCC ed è associata a una prognosi negativa
La Figura 1 illustra il flusso di lavoro complessivo, dalla validazione clinica di PAK5 all'analisi funzionale e trasscrittomica, che identifica GAREM1 come bersaglio a valle. Per testare l'ipotesi che PAK5 promuova la progressione dell'ESCC modulando la via MAPK tramite GAREM1, sono stati esaminati i modelli di espressione di PAK5 nei tessuti ESCC e la ...
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Questo studio offre un esame approfondito del ruolo di PAK5 nella progressione del carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) combinando campioni clinici, analisi funzionali e analisi trascrivomica. Questi risultati ampliano la comprensione del coinvolgimento di PAK5 nell'ESCC, evidenziandone il potenziale sia come marcatore prognostico sia come bersaglio terapeutico.
La marcata sovraespressione di PAK5 nei tessuti ESCC e la sua associazione con una peggiore...
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari o relazioni personali in conflitto che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Provinciale delle Scienze Naturali di Hainan della Cina (Grant No. 822QN474).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di rilevamento dell'apoptosi Annexin V-FITC | Beyotime Biotechnology | C1062S | Kit per la colorazione per il rilevamento dell'apoptosi |
| Anticorpo anti-PAK5 | Abcam | ab110069 | Anticorpo primario per IHC, diluizione 1:100 |
| Sistema automatico di elettroforesi | Agilent | Bioanalizzatore 2100 | Valutazione dell'integrità dell'RNA |
| Kit di sintesi cDNA | Invitrogen | 1896649 | Kit di trascrizione inversa |
| Soluzione viola cristallina | Sigma-Aldrich | C3886 | Colorante per colonie e invasioni |
| DMEM Medium | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | Mezzo di coltura cellulare |
| Siero Fetale Bovino (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 16000044 | Supplemento per colture cellulari |
| Citometro a flusso | BD in Biologia | FACSCanto II | Strumento per l'analisi cellulare |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Versione 8 | Software per analisi statistica e grafica |
| H& Kit di colorazione E | Solarbio | G1120 | Soluzione di colorazione per ematossilina ed eosina |
| IgG Anti-Rat coniugata con HRP | Abcam | ab150165 | Anticorpo secondario per l'IHC |
| Sequencer Illumina NovaSeq | Illumina | NovaSeq 6000 | Piattaforma di sequenziamento ad alta produttività |
| Linea cellulare KYSE-150 | Banca Cellulare RIKEN | RCB2057 | Linea cellulare del carcinoma squamoso esofageo umano |
| Lipofectamina 3000 | ThermoFisher | L3000008 | Reagente di trasfezione |
| Lettore di microplacche | Bio-Tek Instruments | ELx808 | Strumento di misurazione dell'assorbenza |
| DynabeadTM Oligo(dT)25s | Thermo Fisher Scientific | 61005 | Per la purificazione dell'mRNA |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | Antibiotici per la coltura cellulare |
| Propidio ioduro (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | Colorante per la colorazione del DNA |
| RPMI-1640 Medium | Gibco (Thermo Fisher) | 11875093 | Mezzo di coltura cellulare |
| Spettrofotometro | Thermo Fisher | NanoDrop ND-1000 | Misurazione della concentrazione e della purezza dell'RNA |
| Software SPSS | IBM | Versione 23 | Software di analisi statistica |
| Inserti Transwell | Corning | 3422 | Inserti per il saggio di invasione cellulare |
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