Articolo metodologico

Generazione di organoidi cutanei a pelo planari derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura di interfaccia aria-liquido

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DOI:

10.3791/69088

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17 ottobre 2025

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1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center, 3CEA, Inserm, IRIG, UA13 BGE, Biomics, University of Grenoble Alpes

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo delinea un metodo per la produzione di organoidi cutanei contenenti follicoli piliferi da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura planare e fisiologicamente rilevante di interfaccia aria-liquido per replicare l'architettura e la funzione della pelle.

Abstract

Gli organoidi cutanei (SO) derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) contenenti follicoli piliferi forniscono un sofisticato modello in vitro per lo studio delle interazioni intercellulari all'interno del microambiente cutaneo. Inizialmente sviluppati in una configurazione cistica invertita, in cui il derma è esposto all'ambiente e l'epidermide è rivolta verso l'interno verso il centro dell'organoide, gli SO possono successivamente essere trasferiti in una configurazione planare in un sistema di coltura di interfaccia aria-liquido (ALI), che assomiglia più da vicino alla fisiologia della pelle umana. Questo manoscritto presenta un protocollo completo per la generazione e la selezione di SO cistici che possono essere sezionati in SO planari e ulteriormente sviluppati in un sistema di coltura ALI. Il protocollo include punti di controllo definiti per la valutazione qualitativa macroscopica nelle fasi critiche dello sviluppo degli organoidi, descrive in dettaglio i passaggi tecnici necessari per appiattire gli SO cistici nella pelle planare, specifica le condizioni ottimali per la coltura di ALI e dimostra i risultati attraverso l'analisi molecolare. Al giorno 27, la colorazione in immunofluorescenza con marcatori specifici del lignaggio ha rivelato un epitelio pigmentato pluristratificato con appendici cutanee, inclusi follicoli piliferi e strutture simili a ghiandole sebacee. Questo protocollo fornisce un metodo robusto per generare SO planari con appendici, offrendo un modello in vitro fisiologicamente rilevante. Questo sistema supporta diverse applicazioni nella ricerca sulla pelle ed è già stato utilizzato con successo per modellare l'infezione da agenti patogeni, il danno tissutale indotto dalle radiazioni ultraviolette e le risposte ai farmaci.

Introduzione

La pelle costituisce una barriera protettiva cruciale tra gli organismi e il loro ambiente, regolando anche la temperatura corporea, l'equilibrio idrico e gli input sensoriali. È composto da tre strati principali: l'epidermide, un epitelio cheratinocitario stratificato con una superficie cornificata; il derma, un tessuto connettivo ricco di matrice extracellulare, fibroblasti, nervi, vasi sanguigni e cellule immunitarie; e l'ipoderma, che consiste principalmente di adipociti sottocutanei. La funzione della pelle umana dipende anche da appendici specializzate come i follicoli piliferi (HF), le ghiandole sebacee e le ghiandole sudoripare1.

I disturbi della pelle sono tra le condizioni mediche più comuni in tutto il mondo 2,3. Storicamente, la maggior parte degli studi incentrati sulla pelle sono stati condotti utilizzando modelli animali4, che replicano la complessità fisiologica dell'organo in un contesto sistemico. Tuttavia, le significative differenze interspecie4, insieme alle crescenti preoccupazioni etiche, hanno guidato lo sviluppo di modelli di pelle umana fisiologicamente rilevanti.

I modelli convenzionali di pelle umana si dividono in due categorie: epidermide umana ricostruita, che consiste di cheratinociti stratificati, e pelle umana ricostruita, che incorpora inoltre un compartimento dermico sottostante composto da fibroblasti incorporati in una matrice di collagene5. Sebbene entrambi i tipi di modello abbiano fatto progredire in modo significativo la nostra comprensione della fisiologia della pelle, mancano della piena fedeltà architettonica e della diversità cellulare della pelle umana nativa. Una delle principali limitazioni di questi modelli è l'assenza di appendici cutanee come gli HF, che li rende inadatti per la ricerca e i test farmacologici relativi ai disturbi della pelle che coinvolgono la crescita e la rigenerazione dei peli6. Sebbene siano stati segnalati sistemi più avanzati che incorporano HF, non riescono a ricapitolare completamente la complessità della struttura e del microambiente HF o si basano su tecnologie complesse come il bioprinting o il microstampaggio 7,8,9,10.

Un nuovo modello di pelle che affronta molte di queste sfide è l'organoide cutaneo (SO), generato da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC)11. Imitando lo sviluppo embrionale, le hiPSC possono essere dirette verso l'ectoderma della superficie cranica e le linee della cresta neurale cranica, auto-organizzandosi in strutture cistiche che assomigliano molto alla pelle umana. Questi SO contengono quasi tutti i tipi di cellule cutanee non immunitarie, organizzate in un'epidermide stratificata e un derma ricco di matrice extracellulare. È importante sottolineare che gli SO supportano lo sviluppo delle appendici cutanee: HF e ghiandole sebacee. Data la scalabilità praticamente illimitata delle hiPSC, le SO consentono una sofisticata ingegneria genetica e lo sviluppo di nuovi strumenti funzionali. In quanto tali, gli SO rappresentano un importante progresso nel campo e sono promettenti per applicazioni nella biologia dello sviluppo, nella modellazione delle malattie, nei test farmacologici e nella medicina rigenerativa.

Permane però un notevole limite: gli SO formano strutture cistiche invertite in cui l'epidermide si trova all'interno della cisti dermica, al riparo dalle forze meccaniche e immersa in mezzo acquoso. Questa configurazione non solo è fisiologicamente imprecisa, ma preclude anche la creazione di un'interfaccia aria-liquido (ALI). Di conseguenza, gli SO cistici hanno un'applicazione limitata per gli studi che coinvolgono la barriera epidermica, le forze meccaniche o i trattamenti apicali diretti. Per affrontare questo problema, di seguito viene presentato un metodo riproducibile per appiattire meccanicamente gli SO cistici e successivamente coltivarli come pelle planare in una condizione di ALI. Questo approccio, originariamente riportato da Jung et al., riorganizza l'architettura tissutale in modo che l'epidermide apicale sia esposta all'aria, promuovendo così un'ulteriore stratificazione e funzione di barriera12. Gli organoidi planari che ne risultano conservano la complessa architettura della pelle umana, riflettendo anche l'orientamento fisiologicamente accurato dei tessuti, consentendo l'accesso sperimentale alla superficie apicale. Sebbene la procedura sia lunga (~100 giorni) e comporti alcuni passaggi tecnicamente impegnativi, in particolare quando si sezionano SO cistici in SO planari, può essere di particolare interesse per i ricercatori che già lavorano con SO o altri equivalenti della pelle umana che desiderano aumentare la rilevanza fisiologica dei loro sistemi modello.

Protocollo

La Figura 1 presenta il flusso di lavoro per la generazione di SO planari utilizzando un sistema di coltura ALI. La prima sezione delinea la generazione di SO cistica da hiPSC sulla base della metodologia sperimentata da Karl R. Koehler11, con piccole modifiche (Figura 2). La seconda sezione descrive in dettaglio la procedura per l'ulteriore sviluppo di SO cistico in SO planare utilizzando un sistema di coltura ALI come precedentemente descritto12, con modifiche (Figura 3). Tutti i prodotti chimici e i materiali sono elencati nella tabella dei materiali. Tre linee hiPSC precedentemente descritte (LUMCi001-A, LUMCi004-A e WT2) sono state utilizzate per generare SO (https://hpscreg.eu/)13.

1. Generazione di SO cistici

La Figura 2 presenta le morfologie attese e aberranti nei passaggi chiave.

  1. Aggregazione cellulare (Giorno -2)
    1. Coltura di hiPSC in una piastra standard a 6 pozzetti fino a raggiungere la confluenza del 70-80%.
    2. Lavare le cellule con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare (CDR) e incubare a 37 °C con CO2 al 5% per ~6 min per allentare le hiPSC senza staccarle dalla matrice (evitare la sovradigestione).
    3. Aspirare il CDR e aggiungere 1 mL di terreno di mantenimento hiPSC (hiMM) contenente 10 μM di inibitore ROCK. Staccare delicatamente le cellule pipettandole verso l'alto e verso il basso con una pipetta P1000 e preparare una sospensione cellulare a 3,5 × 103 cellule/mL.
    4. Erogare 100 μl di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U a bassissimo attacco utilizzando una pipetta multicanale. Centrifugare la piastra a 110 × g per 6 minuti a temperatura ambiente e incubare a 37 °C con CO2 al 5%.
  2. Diluizione dell'inibitore ROCK (Giorno -1)
    1. Preparare hiMM contenente 100 μg/mL di integratore antibiotico-antimicotico (AAS).
    2. Erogare 100 μl per pozzetto e incubare a 37 °C con CO2 al 5%.
  3. Induzione dell'ectoderma di superficie (Giorno 0)
    1. Scongelare il volume appropriato della matrice della membrana basale sul ghiaccio prima di procedere alla fase successiva. Preparare il terreno minimo hiPSC (hiMinM) integrato con matrice di membrana basale (2%), BMP4 (2,5 ng/mL), SB431542 (10 μM) e bFGF (4 ng/mL) (indicato come hiMinM+SFB) su ghiaccio.
      NOTA: Potrebbe essere necessario regolare la concentrazione di BMP4 a seconda della linea cellulare utilizzata (vedi discussione).
    2. Raccogliere gli aggregati cellulari in una provetta a fondo tondo da 2 mL utilizzando un puntale per pipetta P200 a orifizio largo.
      NOTA: Utilizzare punte a orifizio largo disponibili in commercio. Selezionare un orifizio con un diametro interno di almeno 2 mm per ridurre al minimo i danni agli aggregati. In alternativa, riscalda un bisturi con uno sterilizzatore ad anello a infrarossi e usalo per creare un ampio orifizio da una punta di pipetta convenzionale.
    3. Lasciare che gli aggregati si depositino sul fondo del tubo. Aspirare con cura il terreno e aggiungere 2 ml di hiMinM per lavare gli aggregati. Ripetere il lavaggio per un totale di 3 volte.
    4. Trasferire gli aggregati cellulari in hiMinM+SFB freddo in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti preraffreddata utilizzando una punta per pipetta P1000 a orifizio largo. Quindi, trasferire ciascun aggregato in 100 μL di hiMinM+SFB in una piastra a 96 pozzetti con fondo a U a bassissimo attacco utilizzando un puntale per pipetta P200 a orifizio largo. Rimettere la piastra nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
      NOTA: Utilizzare uno stereomicroscopio posizionato sotto una cappa a flusso d'aria laminare (LAF) per questa fase.
  4. Induzione di popolazioni cellulari non epiteliali (Giorno 3)
    1. Preparare hiMinM contenente LDN193189 (1 μM), bFGF (250 ng/mL) e AAS (100 μg/mL). Erogare 25 μl in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale.
    2. Agitare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme del fluido. Rimettere la piastra nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
  5. Fornire nutrienti (Giorno 6)
    1. Preparare hiMinM contenente AAS (100 μg/mL). Erogare 75 μl in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale.
    2. Agitare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme del fluido. Rimettere la piastra nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
  6. Ristoro medio (8° e 10° giorno)
    1. Preparare hiMinM contenente AAS (100 μg/mL). Rimuovere con cautela 100 μl di terreno da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. Erogare 100 μl di terreno fresco in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale.
    2. Agitare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme del fluido. Rimettere la piastra nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
  7. Passaggio a piastre a 24 pozzetti a basso attacco (giorno 12)
    1. Scongelare il volume appropriato della matrice della membrana basale sul ghiaccio prima di procedere alla fase successiva. Preparare il terreno di maturazione degli organoidi (OMM) utilizzando il terreno avanzato (49% v/v), il terreno basale neurale (49% v/v), l'integratore di glutammina (1x), l'integratore di B-27 meno la vitamina A (0,5x), l'integratore di N2 (0,5x), il 2-mercaptoetanolo (0,1 mM) e l'AAS (100 μg/mL). Preparare il volume appropriato di OMM freddo contenente l'1% di matrice di membrana basale (OMM1%M) e conservare in ghiaccio.
      NOTA: Utilizzare dispositivi di protezione individuale e lavorare in un'area ben ventilata durante la manipolazione del 2-mercaptoetanolo.
    2. Raccogliere gli aggregati cellulari in una provetta a fondo tondo da 2 mL utilizzando un puntale per pipetta P1000 a orifizio largo.
    3. Lasciare che gli aggregati si depositino sul fondo del tubo. Aspirare con cura il terreno. Aggiungere 1,5 ml di terreno avanzato per lavare gli aggregati. Ripetere il lavaggio per un totale di 3 volte.
    4. Trasferire gli aggregati cellulari in OMM1%M freddo in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti preraffreddata utilizzando un puntale per pipetta P1000 a orifizio largo. Quindi, trasferire ciascun aggregato in 500 μl di OMM1%M in una piastra a 24 pozzetti a bassa aderenza utilizzando un puntale per pipetta P1000 a orifizio largo. Rimettere la piastra nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
      NOTA: Utilizzare uno stereomicroscopio posizionato sotto una cappa LAF per questo passaggio.
  8. Ristoro medio (giorno 15)
    1. Scongelare il volume appropriato della matrice della membrana basale sul ghiaccio prima di procedere alla fase successiva. Preparare il volume appropriato di freddo OMM1%M. Tenere in ghiaccio.
    2. Utilizzando i puntali P1000, rimuovere con cautela 250 μl di terreno da ciascun pozzetto. Quindi, aggiungere 250 μl di OMM1%M a ciascun pozzetto. Riposizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 su un agitatore orbitale impostato a 65 giri/min.
  9. Tra il giorno 18 e il giorno 45, eseguire un cambio di mezzo mezzo (250 μL) con OMM il lunedì, il mercoledì e il venerdì.
  10. Tra il giorno 45 e il giorno 90, eseguire un cambio mezzo medio (250 μL) con OMM il lunedì e il mercoledì e un cambio medio completo il venerdì.

2. Transizione da SO cistici a SO planari

NOTA: Gli SO cistici presentano una morfologia invertita, con l'epidermide rivolta verso l'interno verso il centro dell'organoide e il derma a contatto con l'ambiente esterno. Tra il 70° e il 90° giorno, a seconda della linea cellulare e dell'efficienza di differenziazione, la differenziazione soprabasale precoce dell'epidermide è molto avanzata e si sviluppano le forcine. Questa è la fase in cui gli SO cistici vengono trasferiti in un sistema di coltura ALI per ottenere un tessuto che assomigli più da vicino alla pelle umana nativa.

  1. Selezione di SO cistici tra il giorno 70 e il giorno 90 per la transizione a SO planari
    1. Selezionare SO cistiche con un diametro di almeno 5 mm e un contenuto minimo di sottoprodotti (cellule mesenchimali che si accumulano in un polo della cisti e possono anche contenere cartilagine). Utilizzare la presenza di placode/mollette per capelli come indicatore di qualità dello sviluppo dell'organoide cutaneo (Figura 1A e Figura 2B).
      NOTA: Appiattire 2-4 SO planari da ciascun SO cistico, a seconda delle loro dimensioni.
  2. Preparazione dell'inserto rivestito di collagene (formato a 12 pozzetti)
    1. Preparare una soluzione di NaOH (1 M) sciogliendo la quantità appropriata di pellet di NaOH in acqua distillata. Sterilizzare con filtro la soluzione di NaOH utilizzando un filtro a membrana con pori da 0,2 μm.
      NOTA: Utilizzare dispositivi di protezione individuale e lavorare in un'area ben ventilata durante la manipolazione della soluzione di NaOH (1 M).
    2. Con ghiaccio, diluire la soluzione di collagene di tipo I a una concentrazione finale di 2 mg/mL utilizzando 10x PBS (fino a una concentrazione finale di 1x), NaOH (5 mM) e acqua distillata per regolare il volume finale. Distribuire 150 μl di soluzione di collagene in ciascun inserto inserito in una piastra standard a 12 pozzetti. Incubare la piastra a 37 °C per 30 minuti per consentire al gel di collagene di polimerizzare.
  3. Appiattimento dell'SO cistico (Figura 3)
    NOTA: Utilizzare uno stereomicroscopio posizionato sotto una cappa LAF per questo passaggio.
    1. Posizionare l'SO cistico selezionato con una piccola quantità di terreno sul coperchio di una piastra di Petri da 10 cm utilizzando una pipetta P1000 a orifizio largo. Asportare accuratamente i sottoprodotti dell'SO utilizzando un bisturi sterile. Utilizzare una pinza sterile sul lato opposto per stabilizzare l'organoide durante l'escissione (Figura 3A).
      NOTA: In questa fase, l'SO cistico assomiglia a un palloncino sgonfio con due strati di pelle posizionati uno sopra l'altro.
    2. Asportare a circa 1 mm dalle estremità dell'organoide adiacente alla prima incisione utilizzando un bisturi (Figura 3B, F). Aprire delicatamente lo strato superiore della pelle utilizzando una pinza sterile (Figura 3C, G).
    3. Tagliare il pezzo di tessuto in 2-4 pezzi a seconda delle dimensioni. Trasferire delicatamente ogni pezzo di tessuto e posizionarlo su un inserto rivestito di collagene con l'epidermide rivolta verso l'alto, utilizzando una pinza sterile (Figura 3D, H).
      NOTA: Valutare i pioli con uno stereomicroscopio per garantire il corretto orientamento dell'epidermide.
    4. Trasferire nuovamente l'inserto in una piastra standard a 12 pozzetti contenente 600 μl di OMM. Rimettere la piastra nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 (Figura 3E).
  4. Manutenzione a lungo termine della coltura dell'interfaccia aria-liquido
    1. Tra il giorno 1 e il giorno 21 dopo l'appiattimento, eseguire una sostituzione completa del terreno (600 μL) con OMM il lunedì, il mercoledì e il venerdì. Riposizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 e il 95% di umidità relativa.
    2. Tra il giorno 21 e il giorno 27 dopo l'appiattimento, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2 senza umidità per rafforzare la barriera cutanea. Eseguire una sostituzione completa del terreno (800 μL) con OMM al giorno.

Risultati

L'ottimizzazione e i punti di controllo per la generazione di SO cistici sono stati ampiamente descritti14. Il metodo qui presentato, quindi, si concentra sui punti di controllo chiave da valutare durante lo sviluppo di organoidi cistici (Figura 2A), sulla selezione di quelli adatti alla transizione in SO planari (Figura 2B) e sui criteri utilizzati per valutare la qualità degli SO planari risultanti (Figura 1B-D e Figura 4).

Il primo passo chiave nello sviluppo degli SO cistici è la formazione di un singolo aggregato cellulare denso che incorpora la maggior parte delle cellule presenti nel pozzetto al giorno 0 (Figura 2A). Ciò si ottiene attraverso un'attenta e rapida manipolazione delle hiPSC, combinata con un'efficiente centrifugazione, che si traduce in una distribuzione omogenea delle cellule al centro del pozzetto (Figura 2A, Giorno -2). La corretta induzione dell'ectoderma di superficie porta alla formazione di un epitelio sottile e chiaro sullo strato più esterno dell'aggregato entro il giorno 3 (Figura 2A), che successivamente si sviluppa, in seguito all'induzione delle cellule mesenchimali, in aggregati cistici trasparenti contenenti un nucleo scuro di cellule mesenchimali entro il giorno 8. Tra il 12° e il 20° giorno, la cisti epiteliale viene ricoperta da un sottile strato di cellule mesenchimali che si accumulano in un polo della cisti (Figura 2A, Giorno 12). La co-induzione riuscita di cellule epiteliali e mesenchimali si traduce infine in un epitelio stratificato, consentendo la formazione di placodi e pioli di capelli, che diventano visibili tra i giorni 50 e 80 (Figura 2A, B). Selezionando gli SO appropriati sulla base di questi punti di controllo dello sviluppo, la variabilità morfologica e dimensionale può essere minimizzata al momento della transizione agli SO planari.

La presenza di placodi o pioli di capelli è il criterio di inclusione primario per la selezione di SO cistici per un ulteriore sviluppo in SO planari. L'assenza di placodi visibili di solito deriva da un difetto nella stratificazione epidermica, che appare quindi estremamente sottile (Figura 2B, Giorno 50, pannello centrale). Per l'appiattimento, vengono utilizzate solo cisti di grandi dimensioni (almeno 5 mm di diametro) con sottoprodotti concentrati in un polo e sottoprodotti minimi complessivi, mentre sono escluse quelle con sottoprodotti non polarizzati (Figura 2B).

Una volta nella loro configurazione planare, il controllo primario di qualità degli SO si basa sul monitoraggio macroscopico della crescita degli HF sotto uno stereomicroscopio. Gli scompensi spontanei si allungano progressivamente durante i 27 giorni di coltura di ALI, con ghiandole sebacee che diventano visibili intorno al giorno 14 e la pigmentazione che aumenta gradualmente nel tempo (Figura 1B, C). A causa dei vincoli spaziali imposti dalla membrana dell'inserto che si trova appena sotto il sottile gel di collagene, solo gli HF situati alla periferia del SO planare possono crescere completamente, e lo fanno con un orientamento parallelo all'inserto (Figura 1C). In particolare, il fusto del capello raramente sporge oltre la superficie della pelle. Per valutare ulteriormente la qualità degli SO planari sviluppati, possono essere incorporati in paraffina o OCT, sezionati e colorati per esaminarne la composizione e la morfologia. La colorazione H&E rivela che la loro struttura assomiglia molto a quella della pelle umana (Figura 4A), con un epitelio completamente stratificato e un derma separati da una membrana basale. La colorazione in immunofluorescenza con marcatori specifici per i diversi strati epidermici, le ghiandole sebacee e i melanociti conferma ulteriormente l'architettura tissutale simile alla pelle umana degli SO planari (Figura 1D e Figura 4B).

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Figura 1: Flusso di lavoro per la generazione di SO planari contenenti HF da hiPSC utilizzando un sistema di coltura ALI. Vengono mostrate la rappresentazione schematica e le immagini rappresentative dei passaggi chiave. (A) Generazione di SO cistici, essenzialmente come precedentemente descritto10, fino a quando non si formano placodi/pioli di capelli visibili intorno al giorno 80. (B) Gli SO cistici sono incisi e appiattiti, con il lato dell'epidermide rivolto verso l'alto, su un inserto di coltura cellulare rivestito di collagene di tipo I. Le colture ALI vengono mantenute per 21 giorni in condizioni umidificate, seguite da 6 giorni in condizioni asciutte. (C) Vista ad alto ingrandimento di una regione mostrata in (B), che illustra la crescita del follicolo pilifero, lo sviluppo della struttura simile a una ghiandola sebacea (punte di freccia) e la pigmentazione progressiva nel tempo. (D) Immagini confocali di sezioni planari di SO al giorno 27 dopo l'appiattimento, marcate con anticorpi anti-collagene di tipo IV insieme a rosso Nilo, che contrassegna strutture simili a ghiandole sebacee, o anticorpi anti-PMEL, che colorano i melanociti. I nuclei sono controcolorati con DAPI. Barre graduate: 200 μm (A); 500 μm (B,C); 50 μm (D). Abbreviazioni: SO = organoidi della pelle; HF = follicoli piliferi; hiPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte umane; ALI = interfaccia aria-liquido; Col IV = collagene di tipo IV; PMEL = proteina premelanasoma; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Immagini rappresentative della morfologia dell'aggregato cellulare nelle fasi chiave durante la produzione di SO. (A) Immagini rappresentative di SO cistiche con morfologie appropriate (pannelli di sinistra) e inadeguate (pannelli di centro e di destra) a diversi stadi. Al giorno -2, gli aggregati cellulari dovrebbero mostrare una distribuzione uniforme (pannello di sinistra), mentre una manipolazione impropria della piastra dopo la centrifugazione può interrompere la distribuzione delle cellule (pannello di destra). Al giorno 0, gli aggregati ben formati appaiono come cluster cellulari compatti e densi (pannello di sinistra), mentre la bassa vitalità cellulare provoca una morte cellulare diffusa e la perdita delle strutture 3D compatte (pannello di destra). Al giorno 3, uno strato epiteliale esterno distinto diventa visibile (pannello di sinistra), la sua assenza può indicare che la concentrazione di BMP4 necessita di ottimizzazione (pannello di destra). Al giorno 12, le cellule mesenchimali si accumulano in un polo e migrano per avvolgere la cisti epiteliale (pannello sinistro), mentre un'eccessiva differenziazione epiteliale (pannello centrale) o mesenchimale (pannello destro) impedisce una corretta stratificazione epiteliale. Al 50° giorno, gli SO presentano una morfologia bipolare, con cute cistica da un lato e sottoprodotti, prevalentemente cartilaginei, dall'altro (pannello sinistro). Un'eccessiva differenziazione epiteliale (pannello centrale) o mesenchimale (pannello destro) ostacola il corretto sviluppo della pelle. (B) Immagini rappresentative di SO cistiche con forcine per capelli visibili intorno al giorno 80. Si noti la proporzione variabile di sottoprodotti (a sinistra della curva tratteggiata) rispetto alla pelle. I tre pannelli più a sinistra consentono la generazione di 2-4 SO planari, mentre il pannello più a destra mostra un SO di qualità insufficiente per l'appiattimento. Barre di scala: 500 μm per il giorno -2, il giorno 50 e il giorno 80; 200 μm per il giorno 0, il giorno 3 e il giorno 12. Abbreviazione: SO = organoide della pelle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Rappresentazione schematica dei passaggi tecnici per la produzione di SO planari. Eseguire l'appiattimento degli SO cistici sotto uno stereomicroscopio all'interno di una cappa LAF. (A) Asportare il polo che accumula i sottoprodotti dell'SO cistico utilizzando un bisturi sterile. (B) Tagliare gli arti superiori e inferiori dell'SO per facilitare l'apertura dei tessuti. (C) Tagliare il tessuto planare in 2-4 pezzi. Trasferisci e appiattisci ogni pezzo, con il lato epidermico rivolto verso l'alto, su un inserto rivestito di collagene utilizzando una pinza sterile. (D) Posizionare l'inserto di coltura contenente il tessuto appiattito in una piastra standard a 12 pozzetti contenente 600 μl di terreno. (E) Incubare la piastra a 37 °C con CO2 al 5%. (F) Vista schematica trasversale dell'organoide cutaneo raffigurato in (B). (G) Vista schematica trasversale dell'organoide cutaneo raffigurato in (C). (H) Immagine di un SO planare posizionato su un gel di collagene di tipo I versato su un inserto di coltura cellulare posizionato in una piastra a 12 pozzetti contenente 600 μL di terreno. Abbreviazioni: SO = organoide della pelle; LAF = flusso d'aria laminare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Caratterizzazione di SO planari derivati da hiPSC. (A) Immagini rappresentative in campo chiaro di SO planare colorato con H ed E ai giorni 1 e 27 dopo l'appiattimento. Entro il 27° giorno, gli SO planari mostrano una maturazione cutanea con un'epidermide pluristratificata e HF contenenti strutture simili a ghiandole sebacee (punte di freccia). (B) Le immagini confocali delle sezioni planari di SO colorate con integrina anti-β4 e anticorpi anti-cheratina 10 o anti-loricrina mostrano una differenziazione soprabasale precoce (cellule KRT10+ ) al giorno 1 e una differenziazione tardiva (strato LOR+ ) al giorno 27. I nuclei sono controcolorati con DAPI. Barre di scala: 50 μm (A); 100 μm (B). Abbreviazioni: SO = organoide della pelle; hiPSC = cellula staminale pluripotente indotta umana; H&E = ematossilina ed eosina; β4 = integrina b4; KRT10 = cheratina 10; LOR = loricrina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo qui descritto supera una limitazione chiave del sistema cistico SO ripristinando l'orientamento e l'ambiente del tessuto nativo attraverso l'appiattimento dei tessuti e l'esposizione dell'epidermide apicale all'aria. Questo metodo preserva l'intrinseca complessità cellulare e strutturale dell'organoide, promuove un'organizzazione fisiologicamente rilevante e fornisce l'accesso diretto alla superficie epidermica pluristratificata per la manipolazione sperimentale.

Diverse fasi del protocollo sono fondamentali per ottenere SO planari di alta qualità, a partire dalla generazione di SO cistici di alta qualità. I principali controlli di qualità e i potenziali punti di modifica del protocollo sono stati ampiamente descritti prima del12. In breve, il punto di partenza dovrebbe essere costituito da colture di hiPSC ben mantenute e indifferenziate con confluenza del 70-80%, che mostrino cellule strettamente impacchettate con un elevato rapporto nucleo-citoplasmatico. La generazione di SO cistici richiede una modulazione precisa della segnalazione di BMP4 durante l'induzione dell'ectoderma di superficie12. Poiché la sensibilità BMP4 può variare tra le linee hiPSC, potrebbe essere necessaria una titolazione per ottenere risultati ottimali. Si raccomanda di testare concentrazioni di BMP4 comprese tra 2,5 e 15 ng/mL, poiché non sono stati riportati casi di successo al di fuori di questo intervallo. Anche la coerenza nella fonte del reagente è importante; Pertanto, le scorte sfuse di un unico fornitore devono essere preparate e conservate nelle condizioni raccomandate e utilizzate prima della data di scadenza per garantire la piena attività biologica e ridurre al minimo la variabilità.

La selezione di SO cistici con morfologia e dimensioni appropriate è fondamentale per il successo dell'appiattimento dell'SO. La maturazione degli SO cistici e di conseguenza la formazione di pioli e placodi di capelli può variare tra le linee hiPSC, quindi i tempi di appiattimento possono variare dal giorno 70 al giorno 90. L'aggiunta di CHIR99021, un inibitore di GSK3 e agonista del segnale WNT, al giorno 3 della formazione cistica di SO può essere presa in considerazione, poiché è stato dimostrato che aumenta le dimensioni degli organoidi e riduce la formazione di cartilagine promuovendo la proliferazione e inibendo la migrazione della cresta neurale12. Sebbene promettenti, non abbiamo osservato risultati coerenti con questa modifica nelle nostre culture.

Il processo di appiattimento richiede destrezza manuale e familiarità con il tessuto. In particolare, durante il trasferimento del frammento di pelle sull'inserto rivestito, è necessario prestare attenzione per garantire il corretto orientamento dei tessuti. Si consiglia di verificare l'orientamento utilizzando una pinza fine al microscopio e di regolare delicatamente il tessuto fino a quando il lato apicale è rivolto verso l'alto. Se posizionati correttamente, le mollette/placche per capelli devono essere rivolte verso il basso. Dopo il trasferimento degli SO planari alla coltura di ALI, gli HF iniziano tipicamente a mostrare una crescita notevole e una pigmentazione del fusto del capello entro pochi giorni.

I principali limiti del modello descritto sono il tempo e l'elevato livello di manutenzione richiesto e l'immaturità del modello. Lo sviluppo di SO cistiche dotate di forcine per capelli dura tra i 70 e i 90 giorni ed è seguito da 4 settimane di coltura ALI. Questa tempistica estesa, combinata con una laboriosa procedura di appiattimento, rende il sistema meno adatto per applicazioni ad alto rendimento, soprattutto rispetto agli equivalenti in pelle umana disponibili in commercio. Anche se piccole ottimizzazioni possono ridurre leggermente il tempo di coltura, è improbabile una riduzione sostanziale. L'elevata diversità cellulare e strutturale della pelle dipende da una complessa sequenza di interazioni epitelio-mesenchimali e segnali meccanici, che probabilmente non possono essere accelerati dall'aggiunta di fattori esogeni in vitro 15,16,17,18. La formazione di SO cistici e la loro progressione nella forma planare richiedono un alto livello di manutenzione. Uno dei periodi più intensivi di manipolazione, a parte i primi 18 giorni di coltura cistica, si verifica quando gli SO planari sono mantenuti in un'atmosfera a bassa umidità e richiedono un rifornimento quotidiano del mezzo. Analogamente ad altri modelli derivati da hiPSC, gli SO mantengono un fenotipo simile a quello fetale in vitro. Inoltre, le ghiandole sudoripare e i muscoli erettori dei pili sono in gran parte assenti negli SO14, probabilmente a causa della mancanza di vascolarizzazione, cellule immunitarie e forze meccaniche come lo stress di taglio, lo stiramento e l'attrito, tutti essenziali per una corretta maturazione 15,16,17,18,19. Alcune di queste limitazioni possono essere risolte aumentando la complessità del modello. La co-coltura con macrofagi autologhi derivati da hiPSC17, l'integrazione di un sistema di perfusione9 o l'applicazione di stretching meccanico17 possono aiutare a promuovere la maturità del modello20,21.

Va notato che il formato dell'inserto transwell limita in qualche modo la crescita verso il basso degli HF negli SO planari. Di conseguenza, gli HF tendono a diffondersi lateralmente e possono essere esposti all'aria. Poiché gli HF sono normalmente protetti all'interno della pelle in vivo, questo dovrebbe essere considerato quando si progettano gli esperimenti. La modifica del rivestimento dell'inserto mediante l'applicazione di uno strato di idrogel più spesso può aiutare a mitigare questo problema. Inoltre, in questo modello i fusti dei capelli raramente sporgono oltre la superficie della pelle. Le nostre osservazioni indicano che gli scompensi spontanei negli SO planari rimangono in anagen, la fase di crescita attiva, fino al giorno 27 della coltura di ALI. Data la durata prolungata di anagen negli scompensi umani scompensati, ciò non è del tutto inaspettato. Sebbene la cultura a lungo termine possa eventualmente supportare la transizione di fase, ciò è improbabile in assenza di segnali sistemici. L'identificazione e l'integrazione dei segnali molecolari necessari per il ciclo follicolare può consentire l'induzione artificiale delle fasi catagen e telogen.

In sintesi, il protocollo per generare SO planari consente un'ampia gamma di approcci sperimentali che non sono fattibili o rilevanti nell'SO cistico. Gli SO planari sono già stati utilizzati con successo per modellare le infezioni batteriche11 e virali22, il danno tissutale indotto dalle radiazioni ultraviolette22 e le risposte farmacologiche associate 12,22,23. La capacità di accedere alla superficie apicale di un equivalente cutaneo complesso e fisiologicamente rilevante rappresenta un progresso sostanziale per il campo e apre le porte a una varietà di nuove applicazioni nella ricerca sulla pelle.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Ringraziamo i nostri colleghi dell'hiPSC Hotel, Leiden University Medical Center, per aver fornito le linee hiPSC. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine sostenuta dalla Novo Nordisk Foundation, Danimarca (sovvenzione numero NNF21CC0073729) a K.R. K.R. è Chargé de Recherche presso l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM/F12 avanzatoThermo Fisher Scientific#12634010nel testo è chiamato Advanced medium.
ALK5, inibitore. TGFb tipo 1, SB431542Tocris Bioscienza#1614Aliquot, conserva a -20 ° C e   mantenere a 4 gradi; C per un massimo di 7 giorni  
Anticorpo monoclonale di ratto Anti-CD104 439-9BBD in Biologia#555719NA
Anticorpo policlonale anticollagene tipo IVMerckMillipore#Ab769NA
Anticorpo policlonale anti-citocheratina 10 del coniglioBiolegend#905401NA
Anticorpo policlonale anti-loricrin del coniglioBiolegend#905101NA
Anticorpo monoclonale anti-PMEL nel topoNovus Biologicals#NBP2-29407 NA
Integratore di B-27, meno vitamina AThermo Fisher Scientific#12587010Aliquot, conserva a -20 ° C 
Inserti di coltura cellulareGreiner Bio-one#66564112-pozzo, poro 0,4 & micro; m; trasparente (48 inserti/scatola); https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html
Collagene di tipo ICorning#354249Tieni la soluzione di serie a 4 gradi; C
Bisturi usa e getta sterile 0507 n. 21Swann Morton#0507NA
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)Thermo Fisher Scientific#14190094NA
Essenziale 6 (E6) mediaThermo Fisher Scientific#A1516401chiamato hiPSC medium minimale (hiMinM)  nel testo.
FasudilLC Labs#F-4660Una soluzione 1000x stock e conserva a -20 °C. Una volta scongelato, tieni a 4 gradi e gradi; C per un massimo di 14 giorni 
Dissociazione delle cellule delicate  ReagenteTecnologie Stemcell#100-0485NA
Integratore GlutaMAXThermo Fisher Scientific#35050038NA
Grado base di prenium FGF-2 umanoMiltenyi Biotec#130-093-842Aliquot, conserva a -80 & deg; C e   mantenere a 4 gradi; C per un massimo di 7 giorni  
LDN 193189 diidrocloruroTocris#6053Eccolò, fotosensibile, conserva a -20 & deg; C 
Matrice della membrana basale ridotta con fattore di crescita MatrigelCorning#354230Aliquot, conserva a -20 ° C e   mantenere a 4 gradi; C per un massimo di 7 giorni  
2-MercaptoetanoloThermo Fisher Scientific#21985023Sostanze pericolose, tossici, corrosive, irritanti, pericoli per la salute e per l'ambiente.
NaOHMerck#567530-250MGSostanze pericolose, corrosive e irritanti. Prepara una soluzione spontaneamente.
Mezzo neurobasaleThermo Fisher Scientific#21103049chiamato mezzo basale neurale e nbsp; nel testo.
Normocin 50 mg/mlInvivogen#ant-NR-1nel test è stato indicato come integratore antibiotico-antimicotico. Aliquot, conserva a -20 ° C e   mantenere a 4 gradi; C per un massimo di 14 giorni 
Micropiastra Nunclon Sphera 96-WellU-BottomThermo Fisher Scientific#174929NA
Nunclon Sphera 174930 multidish a 24 pozziThermo Fisher Scientific#174930NA
Supplemento N2Thermo Fisher Scientific#17502048Aliquot, conserva a -20 ° C 
Oscillatore orbitaleThermo Fisher Scientific#88881102NA
Penicillina-StreptomicinaThermo Fisher Scientific#15070063NA
Proteina BMP4 umana ricombinanteR& Sistemi D#314-BP-010Aliquot, conserva a -80 & deg; C e   mantenere a 4 gradi; C per un massimo di 7 giorni  
StemFlex (SF) mediumThermo Fisher Scientific#A3349401chiamato mezzo di manutenzione hiPSC (hiMM) e nbsp; nel testo.
SteriMax smart - Sterilizzatore ad anello a infrarossiWLD-TEC#4.002.000 Opzionale
PinzettaMerck#T4537-1EAStile 5; Acciaio inossidabile antimagnetico affilato come ago
VitronectinaTecnologie Stemcell#07180NA

Riferimenti

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