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Articolo metodologico

Analisi automatizzata delle immagini a fluorescenza di C. elegans utilizzando SegElegans

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DOI:

10.3791/69094

⸱

10 ottobre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, 3Instituto de Automática e Informática Industrial, Universitat Politècnica de València

In questo articolo

Sommario

Qui forniamo istruzioni su come utilizzare efficacemente SegElegans, un sistema di deep learning che abbiamo sviluppato per la segmentazione automatizzata di singoli vermi in immagini di microscopia a campo largo, per il successivo utilizzo in software di analisi delle immagini come ImageJ. Forniamo modi per utilizzare il sistema sia online che offline.

Abstract

La microscopia, in particolare del tipo fluorescente, è uno strumento frequentemente utilizzato nella ricerca su C. elegans . L'analisi dei dati provenienti dagli esperimenti di microscopia può, tuttavia, essere piuttosto noiosa e richiedere molto tempo. Pertanto, l'automazione è auspicabile. Abbiamo sviluppato SegElegans, un sistema di rete neurale convoluzionale basato su U-net a due teste progettato specificamente per la segmentazione automatizzata dei worm, anche in immagini con un gran numero di individui che si toccano o si sovrappongono. La prima parte di SegElegans è composta da un codificatore e due decoder. L'encoder, basato sul modello SmaAt AT, applica doppi strati di convoluzione seguiti da un modulo di attenzione a blocchi convoluzionali (CBAM). Entrambi i decodificatori utilizzano LSTM convoluzionali: uno esegue la segmentazione semantica delle immagini dei vermi (corpo, bordo, sfondo o sovrapposizione), mentre l'altro estrae uno scheletro lineare lungo ciascun verme. La seconda parte è un algoritmo di post-elaborazione che combina gli output dei due decoder e li utilizza per generare segmentazioni accurate delle istanze. Queste segmentazioni possono quindi essere inviate a ImageJ o ad altri strumenti di analisi delle immagini appropriati. Qui presentiamo le istruzioni su come accedere ed eseguire questo sistema. Forniamo un'implementazione online basata sul cloud computing e due metodi per utilizzare i modelli SegElegans offline, su una macchina locale, nel caso in cui l'hardware richiesto sia disponibile.

Introduzione

Caenorhabditis elegans è un organismo modello eucariotico con ampio uso nei campi della biologia cellulare e molecolare 1,2,3. Si tratta di un piccolo (~1 mm per gli adulti selvatici) che vive nel suolo con un ciclo di vita veloce (~ tre settimane) e un gran numero di progenie (tipicamente geneticamente identica al genitore ermafrodita autofecondante). Nonostante la sua relativa semplicità, l'animale è pur sempre un organismo multicellulare complesso con tessuti e organi definiti e distinti, che, grazie alle sue ridotte dimensioni e alla sua trasparenza, può essere studiato in vivo senza alcuna necessità di fissazione o altri trattamenti invasivi4. La capacità del verme per lo studio in vivo attraverso la microscopia può essere ulteriormente amplificata attraverso l'uso di reporter fluorescenti, che consentono la facile distinzione delle singole cellule o anche la visualizzazione diretta di organelli/componenti subcellulari come mitocondri, goccioline lipidiche o aggregati proteici, e di processi come la trasduzione del segnale, l'espressione genica, la fusione delle vescicole, autofagia, potenziali d'azione neuronali e muscolari, ecc.5,6,7,8,9,10,11. Inoltre, il nematode è anche altamente suscettibile di manipolazione genetica attraverso la mutagenesi12, la transgenesi tramite microiniezione o bombardamento di microparticelle13, l'editing CRISPR14 e, soprattutto, quando si tratta di uno screening genetico facile ed economico, l'RNAi15. Questa manipolazione consente lo studio approfondito dei geni e del loro ruolo nel nematode stesso, mentre contemporaneamente, grazie alla significativa omologia genetica che C. elegans mostra con altri organismi modello, fa scoperte fondamentali con rilevanza per l'uomo16,17. Infine, questa omologia/conservazione rende il verme un terreno di prova iniziale ideale per farmaci e agenti chimici, consentendo la delucidazione dei meccanismi dell'attività dei farmaci, l'identificazione di potenziali variazioni genetiche che modificano l'attività e la scoperta di potenziali interazioni indesiderate ed effetti off-target 18,19,20.

Tutti i vantaggi sopra menzionati hanno reso C. elegans un modello interessante per studi di biologia cellulare e molecolare, in particolare per gli scienziati interessati al monitoraggio in vivo e spesso in tempo reale dei processi tramite microscopia. Tali studi in genere comportano una quantità significativa di analisi delle immagini attraverso un software speciale, con l'opzione più utilizzata che è ImageJ 21,22,23. Una caratteristica comune dell'analisi attraverso tali software è la necessità per l'utente/ricercatore di specificare le Regioni di Interesse (ROI) per l'analisi attraverso l'uso di strumenti di selezione. Abbastanza frequentemente, ogni singolo verme in un'immagine sarà selezionato come proprio ROI, con l'obiettivo di acquisire informazioni per verme su semplici caratteristiche morfologiche (come le dimensioni del corpo) o letture sperimentali più "avanzate" come i livelli di espressione di un gene (misurati con un reporter fluorescente), la lettura di un reporter raziometrico, il numero e la dimensione delle goccioline lipidiche, la formazione degli aggregati proteici, la morfologia dei singoli organelli e delle loro reti, ecc.5,8,10,24,25,26,27. Queste selezioni per verme sono in genere effettuate manualmente, poiché i metodi di selezione automatica basati su algoritmi standard di elaborazione delle immagini di solito non sono in grado di distinguere le forme e le caratteristiche del verme, specialmente nelle immagini in campo scuro in cui i contorni dei vermi non sono chiaramente visibili o nelle immagini in campo chiaro con un numero significativo di animali che si toccano e si sovrappongono. Il processo manuale è, tuttavia, lento (da 20 s a 1 min per vite senza fine a seconda della precisione necessaria e dell'esperienza dell'utente), laborioso e soggetto a pregiudizi ed errori dell'utente.

Un approccio alternativo e molto più potente per la generazione di ROI individuali di C. elegans (un compito tipicamente indicato come segmentazione nel campo della visione artificiale) è quello di automatizzarlo con l'aiuto di tecniche di deep learning/reti neurali. Le reti neurali convoluzionali basate principalmente sulle architetture Mask R-CNN28 e U-net29 hanno prodotto risultati decenti in compiti di segmentazione su vari sistemi di modelli biologici 30,31,32 tra cui in C. elegans 33,34,35,36,37,38,39 , ma nessuno ha fornito una soluzione soddisfacente al problema della generazione di segmentazioni complete del corpo che distinguano correttamente i singoli animali (segmentazione di istanza) in immagini ad alta risoluzione con un gran numero di vermi che si toccano o si sovrappongono. Per soddisfare questa esigenza, abbiamo sviluppato SegElegans, un modello di deep learning specificamente progettato e ottimizzato per questo compito40.

SegElegans è composto da due parti principali (Figura 1). La prima parte è una rete neurale convoluzionale variante U-net a due teste. È composto da un blocco encoder e due blocchi decoder. Il blocco encoder si basa sul modello SmaAt AT41 e utilizza blocchi a doppia convoluzione per ogni strato che alimenta un modulo di attenzione a blocchi convoluzionali (CBAM)42. I due blocchi di decodifica si basano sulla rete convoluzionale LSTM (Long Short-Term Memory)43. Un decodificatore è responsabile della categorizzazione di ogni pixel delle immagini come parte del corpo principale di un verme, parte del bordo di un verme, parte dello sfondo o parte di un'area in cui i vermi si sovrappongono (questo è tipicamente indicato come segmentazione semantica). L'altro decodificatore è responsabile del disegno di uno "scheletro" lineare lungo la lunghezza di ciascun verme. La seconda parte è un algoritmo di post-elaborazione che combina gli output dei due decoder e li utilizza per generare segmentazioni accurate delle istanze. Inizialmente identifica i segmenti di vere sovrapposizioni confrontando l'output della segmentazione semantica con quello dello scheletro. Quindi emette la segmentazione dell'istanza direttamente per i worm senza sovrapposizioni o assemblandola dai segmenti per quelli sovrapposti40. Queste segmentazioni vengono salvate come maschere binarie e come ROI compatibili con ImageJ.

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Protocollo

Le sezioni seguenti includono istruzioni dettagliate su come utilizzare efficacemente SegElegans (Figura 2). Includono istruzioni sull'acquisizione preparatoria delle immagini (Sezione 1), su come eseguire il modello online (Sezione 2) o offline (Sezioni 3-5) e sull'importazione delle ROI in ImageJ o in altri strumenti (Sezione 6). Poiché la valutazione delle immagini attraverso il modello richiede un PC con un'unità di elaborazione grafica (GPU) compatibile con CUDA che disponga di almeno 6 GB (idealmente di più) di memoria video ad accesso casuale (VRAM), si consiglia alla maggior parte degli utenti (a condizione che abbiano accesso ai servizi di Google) di utilizzare la versione online del modello che soddisfa e supera questi requisiti hardware attraverso il cloud computing (Sezione 1 > Sezione 2 > Sezione 6). In alternativa, gli utenti che hanno accesso a un hardware adeguatamente potente e una conoscenza di base dell'uso della riga di comando/terminale (o gli utenti che non hanno accesso alle suddette opzioni di cloud computing) potrebbero trovare più conveniente l'esecuzione del modello localmente (Sezione 1 > Sezione 3 > Sezione 4 o 5 > Sezione 6).

1. Acquisizione di immagini campione e guida

  1. Usa SegElegans per acquisire segmentazioni di vermi adulti da qualsiasi ceppo di vermi, indipendentemente dai reporter fluorescenti che possono o non possono esprimere. Se i fenotipi/dati di interesse sono misurati in immagini in campo chiaro, acquisirli normalmente utilizzando un microscopio a campo largo e un software compatibile, utilizzando un obiettivo 4x o simile.
    NOTA: SegElegans è in grado di analizzare immagini con un'ampia gamma di luminosità e contrasto, anche se è preferibile che non vi siano pixel chiari o scuri saturi. Per quanto riguarda le dimensioni, il sistema è stato addestrato con immagini 1328 x 1048, ma dovrebbe funzionare con qualsiasi immagine di dimensioni almeno 512x512.
  2. Se il fenotipo/i di interesse viene misurato in immagini in campo scuro (tipico quando si utilizzano uno o più reporter o coloranti fluorescenti transgenici), acquisire immagini in campo chiaro insieme ai dati da utilizzare come immagini guida (come spiegato nel passaggio 1.1). Assicurarsi che le immagini guida corrispondano perfettamente alle immagini in campo scuro dei canali di fluorescenza spazialmente e il più vicino possibile in termini di tempo, idealmente utilizzando le opzioni di acquisizione multicanale fornite dal software operativo del microscopio. Salvare le immagini guida in una cartella separata dalle corrispondenti immagini di dati in campo scuro, utilizzando lo stesso nome per entrambe.

2. Esecuzione della versione online di SegElegans

  1. Accedi a un account Google su un browser web. A questo scopo è consigliabile creare un nuovo account lab dedicato.
  2. Entra in Google Drive (https://drive.google.com) e carica la cartella con le immagini in campo chiaro (dati o guida). Come accennato in precedenza, se le immagini guida vengono utilizzate per generare ROI per le immagini in campo scuro, non includere tali immagini di dati in campo scuro in questa cartella.
  3. Vai su https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 e fai clic sul file SegElegans Body Prediction Interface.ipynb . Fare clic sul pulsante Apri in Colab nella parte superiore del file che si apre. Il taccuino/interfaccia Jupyter per SegElegans si aprirà su Google Colab.
  4. Eseguire il blocco di codice 1 premendo il pulsante di riproduzione (figure-protocol-1) sotto il titolo. Concedere al runtime l'autorizzazione per eseguire il codice e osservare l'output al termine dell'esecuzione (viene visualizzato un segno di spunta verde accanto al pulsante di riproduzione). Colab dovrebbe eseguire automaticamente il runtime corretto e compatibile con CUDA e visualizzare una tabella di output NVIDIA-SMI. In caso contrario, forzare l'uso di un runtime GPU T4 tramite il menu Runtime > Cambia tipo di runtime .
  5. Esegui il blocco di codice 2 per caricare il contenuto di Google Drive nel runtime. Accetta tutte le finestre di dialogo di conferma e concedi tutte le autorizzazioni richieste.
  6. Esegui i blocchi di codice 3 e poi 4. Il blocco 3 impiegherà un paio di minuti per finire, quindi assicurati che sia apparso il segno di spunta verde prima di procedere al 4.
  7. Apri l'icona con la scheda della cartella a sinistra dell'interfaccia di Colab. Verranno visualizzati i file caricati nel runtime, inclusi i contenuti importati di Drive come /content/drive/MyDrive. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla cartella con le immagini, copiare il percorso e incollarlo nel modulo di input test_images del blocco di codice 5. Assicurati che assomigli a questo: /content/drive/MyDrive/Imagefolder. Allo stesso modo, specificare un percorso per l'output dell'analisi (ad esempio, /content/drive/MyDrive/Imagefolder/Output). Si noti che i percorsi in questo ambiente utilizzano una barra per separare le cartelle (/).
  8. Eseguire il blocco di codice 5.
  9. Specificare l'esatta estensione delle immagini che devono essere analizzate dal modello nella forma fornita del blocco di codice 6. Ai fini di questo input ".tif", ". TIF" e ".tiff" sono trattati come estensioni diverse.
  10. Non regolare l'input batch_crop_img nel blocco di codice 6 se il sistema è in esecuzione nel runtime GPU T4 predefinito (che viene fornito gratuitamente a tutti gli utenti per un numero limitato di ore al giorno, a seconda dei livelli di utilizzo). Ridurlo se il runtime solleva problemi di disponibilità della memoria.
  11. Eseguire il blocco di codice 6. Ci vorrà un po' di tempo, quindi assicurati che sia apparso il segno di spunta verde prima di procedere.
  12. Eseguire il blocco di codice 7. Non regolare gli input per il runtime T4 predefinito, ma ridurre il numero di sottoprocessi o disabilitare completamente l'elaborazione parallela se emergono problemi di disponibilità della memoria. Anche questo richiederà molto tempo.
  13. Accedi a Google Drive in una finestra o scheda del browser diversa e vai alla cartella di output designata nella versione 2.7.
    NOTA: A questo punto, SegElegans ha concluso la valutazione iniziale e la post-elaborazione delle segmentazioni e ha creato diverse sottocartelle con gli output. 0_summary risultati contengono grafici che riassumono l'output per ogni immagine, con un numero di indice assegnato a ciascun worm. 1_complete_mask contiene le maschere binarie curate per tutte le segmentazioni che l'algoritmo ha deciso essere valide per l'analisi. 1_edge_small_mask contiene maschere binarie per tutte le segmentazioni che l'algoritmo ha deciso di rifiutare perché gli animali sono troppo piccoli o parzialmente oscurati ai bordi dell'immagine. 1_overlap_mask contiene maschere binarie per tutte le segmentazioni di worm che hanno mostrato sovrapposizioni reali e, per impostazione predefinita, non vengono aggiunte all'output curato. 1_all_rois_results contiene le segmentazioni di TUTTI e 3 i tipi, indipendentemente dalla cura, in formato ImageJ (file zip con ROI).
  14. A questo punto, scegli una delle tre opzioni:
    1. Utilizzare le ROI fornite in 1_all_rois_results in ImageJ e rifiutare le ROI indesiderate dopo l'importazione (vedere la sezione 6 del protocollo).
    2. Accetta le buone maschere curate senza alcuna correzione manuale (e senza l'inclusione di vermi sovrapposti) (salta alla 2.16).
    3. Regolare manualmente la cura selezionando i worm (compresi quelli sovrapposti) da includere nell'output (continuare con 2.15).
  15. Per regolare manualmente la cura, utilizzare il blocco di codice 8. Esamina i risultati della selezione iniziale dai grafici di riepilogo nella cartella dei risultati 0_summary . Per ogni immagine che necessita di correzione, inserire il nome completo (con estensione) dell'immagine di input originale nel modulo "name_image_change" e i numeri delle maschere da conservare (dal grafico riassuntivo), separati da virgole nel modulo "index_images". Eseguire il blocco di codice 8. Ripeti questo passaggio per qualsiasi altra immagine che necessita di correzione.
  16. Dopo la correzione o se gli utenti scelgono di accettare la cura iniziale senza correzioni (e senza i worm sovrapposti), eseguire il blocco di codice 9. Verrà creata una nuova sottocartella nella cartella degli output in Google Drive chiamata 2_curated_rois_results. Include tutte le segmentazioni finali curate in formato ImageJ (file zip con ROI).
  17. Per eseguire nuovamente il processo per una cartella di immagini diversa, reimpostare il runtime tramite il menu Runtime > Restart Session e ricominciare dall'inizio.

3. Preparare la versione offline di SegElegans prima del primo utilizzo

  1. In alternativa all'esecuzione di SegElegans online su Colab, è disponibile una versione offline di SegElegans per gli utenti che non possono o preferiscono non utilizzare i servizi di cloud computing di Google. Ciò richiede un PC (Windows o Linux) con una GPU compatibile con CUDA (https://developer.nvidia.com/cuda-gpus) con almeno 6 GB di VRAM (anche se si consigliano 16 se disponibili e convenienti).
    NOTA: Le seguenti istruzioni nelle sezioni 3-5 sono incentrate su Windows, ma il software può essere eseguito anche su sistemi basati su Linux con alcune piccole modifiche nei comandi utilizzati.
  2. Scaricare il programma di installazione del toolkit CUDA da https://developer.nvidia.com/cuda-downloads seguendo le istruzioni per ottenere la versione appropriata per il dispositivo utilizzato.
    NOTA: SegElegans è stato testato con le versioni 12.9 e 13.0 del toolkit e CUDA versione 11 in Windows, tuttavia si prevede che le versioni future manterranno la compatibilità con le versioni precedenti.
    1. Installa il toolkit, seguendo le istruzioni del programma di installazione stesso. Visual Studio non è necessario.
  3. Scaricare la versione appropriata del programma di installazione Python per il dispositivo da https://www.python.org/downloads/. Installa Python, seguendo le istruzioni del programma di installazione stesso e assicurandoti che python.exe venga aggiunto a PATH.
    NOTA: SegElegans è stato costruito e testato su Python 3.13, ma si prevede che le versioni future manterranno la compatibilità con le versioni precedenti.
  4. Vai a https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOffline/releases/tag/v1 . Fare clic sul collegamento Codice sorgente (zip) per scaricare il pacchetto con i file necessari per configurare ed eseguire SegElegans in locale.
  5. Estrai il file zip. Inserirlo in una cartella di livello superiore o superiore, ad esempio C:\SegElegans. Il contenuto del file zip si trova già all'interno di una sottocartella SegElegansOffline-1.
  6. Apri il prompt dei comandi di Windows (cmd.exe). Digita il comando python -m venv "fullsegeleganspath" dove "fullsegeleganspath" è il percorso completo, tra virgolette, nella sottocartella SegElegansOffline-1 .
    NOTA: Ad esempio, se il file zip è stato estratto in C:\SegElegans, il percorso completo è C:\SegElegans\SegElegansOffline-1 e il comando sarà python -m venv "C:\SegElegans\SegElegansOffline-1" . Si noti che i percorsi in questo ambiente utilizzano una barra rovesciata per separare le cartelle ("\").
  7. Nel prompt dei comandi, utilizzare i controlli standard per spostarsi all'interno della cartella SegElegansOffline-1 ed eseguire il comando Scripts\activate. Un'etichetta (SegElegansOffline-1) dovrebbe apparire prima del cursore del prompt successivo, indicando che l'ambiente Python è ora attivo.
  8. Mentre sei all'interno dell'ambiente attivo (SegElegansOffline-1), esegui il comando pip install -r requirements.txt . Il processo richiederà del tempo.
  9. Inserisci ed esegui il comando python assemblenetworks.py .
    NOTA: SegElegans è ora pronto per l'esecuzione. A tale scopo, sono disponibili due modi: uno script rapido che fornisce automaticamente tutte le segmentazioni come ROI di ImageJ senza la possibilità di correggere manualmente la selezione (sezione 4) e un notebook Jupyter locale che consente di visualizzare e correggere la selezione (sezione 5). Quest'ultimo approccio è consigliato per la maggior parte degli utenti.

4. Esecuzione della versione offline di SegElegans con uno script rapido

  1. Apri il prompt dei comandi di Windows (cmd.exe). Come descritto nel passaggio 3.7, accedere alla cartella dell'ambiente SegElegans e attivarla.
  2. Per utilizzare lo script rapido, mentre si è nel prompt dei comandi con l'ambiente attivo (SegElegansOffline-1) immettere ed eseguire il comando python SegElegansBodyQuickEval.py -i "pathtoinputfolder" -x dove "pathtoinputfolder" è il percorso completo, tra virgolette, della cartella con le immagini in campo chiaro (ad esempio "D:\Data\Experiment12365\Condition 1") e è l'estensione precisa del file delle immagini che gli utenti desiderano analizzare (Esempio). TIF"). Digita il comando python SegElegansBodyQuickEval.py -h per istruzioni su parametri aggiuntivi che possono essere modificati per accelerare l'elaborazione da parte dello script se il dispositivo è in grado di gestirlo.
    NOTA: La cartella di output in questo caso verrà creata all'interno della cartella di input (quindi per l'esempio precedente: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output"). Al suo interno è presente una serie di sottocartelle. 0_summary risultati contengono grafici che riassumono l'output di ogni immagine, con un numero di indice assegnato a ciascun worm. 1_complete_mask contiene le maschere binarie curate per tutte le segmentazioni non sovrapposte che l'algoritmo ha deciso essere valide per l'analisi. 1_edge_small_mask contiene maschere binarie per tutte le segmentazioni che l'algoritmo ha deciso di rifiutare perché gli animali sono troppo piccoli o parzialmente oscurati ai bordi dell'immagine. 1_overlap_mask contiene maschere binarie per tutte le segmentazioni di vermi che hanno mostrato sovrapposizioni reali. 1_all_rois_results contiene le segmentazioni di TUTTI e 3 i tipi, indipendentemente dalla cura, in formato ImageJ (file zip con ROI). Poiché non è possibile correggere manualmente la cura, 2_curated_rois_results include per impostazione predefinita tutte le segmentazioni ritenute valide dall'algoritmo E tutte le segmentazioni sovrapposte nel formato ImageJ (file zip con ROI).

5. Esecuzione della versione offline di SegElegans con un notebook Jupyter

  1. Apri il prompt dei comandi di Windows (cmd.exe). Come descritto nel passaggio 3.7, accedere alla cartella dell'ambiente SegElegans e attivarla.
  2. Per utilizzare l'interfaccia Jupyter, mentre ci si trova nel prompt dei comandi con l'ambiente attivo (SegElegansOffline-1), immettere ed eseguire il comando jupyter notebook. Si aprirà una finestra/scheda del browser Web con un sito ospitato localmente. Nella schermata iniziale, seleziona il file SegElegansOfflineJupyterInterface.ipynb.
  3. Esegui il codice nel blocco di codice 1 selezionandolo (fai clic a sinistra all'esterno del codice effettivo) e premendo il pulsante di riproduzione (figure-protocol-2) sulla barra degli strumenti in alto. Al termine dell'esecuzione, verrà visualizzato un messaggio di conferma sotto il blocco di codice.
  4. Eseguire il blocco di codice 2. Questo genererà alcuni moduli di input nella lettura sotto il blocco di codice. Compila i moduli generati con il percorso della cartella di input con le immagini in campo chiaro (Esempio: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1"), il percorso desiderato per l'output dell'analisi (Esempio: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output") e l'estensione precisa del file delle immagini da analizzare (Example ". TIF"). Regolare le impostazioni aggiuntive fornite (aumentare il numero di sottocolture per batch a 9 o 16 ed eseguire più processi paralleli di post-elaborazione) se il dispositivo è sufficientemente capace.
  5. Eseguire il blocco di codice 3.
  6. Eseguire il blocco di codice 4. Ci vorrà del tempo, quindi assicurati che sia completo prima di procedere.
  7. Eseguire il blocco di codice 5. Ancora una volta, ci vorrà del tempo. Successivamente, vai alla cartella di output designata sopra.
    NOTA: A questo punto, SegElegans ha concluso la valutazione iniziale e la post-elaborazione delle segmentazioni e ha creato diverse sottocartelle con gli output. 0_summary risultati contengono grafici che riassumono l'output per ogni immagine, con un numero di indice assegnato a ciascun worm. 1_complete_mask contiene le maschere binarie curate per tutte le segmentazioni che l'algoritmo ha deciso essere valide per l'analisi. 1_edge_small_mask contiene maschere binarie per tutte le segmentazioni che l'algoritmo ha deciso di rifiutare perché gli animali sono troppo piccoli o parzialmente oscurati ai bordi dell'immagine. 1_overlap_mask contiene maschere binarie per tutte le segmentazioni di worm che hanno mostrato sovrapposizioni reali e che per impostazione predefinita non vengono aggiunte all'output curato. 1_all_rois_results contiene le segmentazioni di TUTTI e 3 i tipi, indipendentemente dalla cura, in formato ImageJ (file zip con ROI).
  8. Simile alla versione online di SegElegans, utilizza una delle tre opzioni elencate di seguito:
    1. Utilizzare le ROI fornite in 1_all_rois_results in ImageJ e rifiutare le ROI indesiderate dopo l'importazione (vedere la sezione 6 del protocollo).
    2. Accetta le maschere valide curate automaticamente senza alcuna correzione manuale (e senza l'inclusione di vermi sovrapposti) (vai al passaggio 5.11).
    3. Regolare manualmente la cura selezionando i worm (compresi quelli sovrapposti) da includere nell'output (continuare con il passaggio 5.9).
  9. Per regolare manualmente la cura, utilizzare i blocchi di codice 6 e 7. Prima eseguire 6. In questo modo verranno creati moduli di input nella lettura sotto il codice.
  10. Esamina i risultati della selezione iniziale dai grafici di riepilogo nella sottocartella dei risultati 0_summary . Per ogni immagine che necessita di correzione, inserire il nome completo dell'immagine INPUT (con estensione) nella forma Immagine da correggere: e i numeri delle maschere da conservare (dal grafico riassuntivo) separati da virgole nella maschera da mantenere. Eseguire il blocco di codice 7 e assicurarsi che l'esecuzione sia completa. Ripeti questo passaggio per qualsiasi altra immagine che necessita di correzione.
  11. Dopo aver eseguito la correzione della cura o se gli utenti scelgono di accettare la cura iniziale senza correzioni (e senza i worm sovrapposti), eseguire il blocco di codice 8. Verrà creata una nuova sottocartella nella cartella di output designata denominata 2_curated_rois_results. Include tutte le segmentazioni finali curate in formato ImageJ (file zip con ROI).
  12. Per eseguire nuovamente il processo per una cartella di immagini diversa, reimpostare il runtime tramite il menu Kernel > Riavvia kernel e Cancella output di tutte le celle e ricominciare dall'inizio.

6. Importazione delle segmentazioni in ImageJ (o alternative)

  1. Aprire una delle immagini di dati effettivi su ImageJ.
  2. Apri il file zip corrispondente con le ROI di quell'immagine. In questo modo le selezioni verranno caricate in ImageJ ROI Manager. Se si tratta di ROI dall'output 2_curated_rois_results , sono pronti per l'analisi con i metodi desiderati normalmente utilizzati (preferibilmente con l'uso di macro per automatizzare e accelerare ulteriormente il processo).
  3. Se si tratta di ROI dall'output 1_all_rois_results , rimuovi le segmentazioni indesiderate dal gestore ROI. Selezionali e premi il pulsante Elimina nella finestra del gestore stessa. Non premere il tasto Canc sulla tastiera, poiché ciò elimina invece il contenuto della selezione nell'immagine.
  4. Se per l'analisi è necessario un software diverso da ImageJ, è molto probabile che il formato ROI non sia compatibile. In tal caso, importa le segmentazioni nella forma universalmente utilizzata di maschere binarie, fornite nelle cartelle 1_complete_mask e 1_overlap_mask . Consultare le istruzioni del software ricevente su come eseguire l'importazione.

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Risultati

Seguendo questo protocollo, i ricercatori dovrebbero essere in grado di estrarre segmentazioni di vermi di alta qualità, anche per l'analisi di immagini a fluorescenza senza bordi visibili dei vermi. Come discusso nella sezione 6 del protocollo, queste segmentazioni possono essere importate direttamente in ImageJ e utilizzate per la misurazione rapida di proprietà rilevanti come l'intensità dei reporter fluorescenti (comunemente utilizzati per la quantificazione dell'espressione) o il nu...

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Discussione

La metodologia qui presentata dovrebbe consentire agli utenti di analizzare gli esperimenti di microscopia di C. elegans in un lasso di tempo significativamente più veloce senza alcuna perdita di precisione. Poiché estrae le segmentazioni dalle immagini guida in campo chiaro indipendentemente dalla fluorescenza effettiva (come discusso nella sezione 1 del protocollo), può essere utilizzato con qualsiasi ceppo e per qualsiasi applicazione che richieda la misurazione dei fenotipi ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Il lavoro nel laboratorio degli autori è finanziato dal Segretariato generale per la
Ricerca e innovazione del ministero greco dello Sviluppo,
Unione Europea - NextGenerationEU (codice progetto: TAEDR-0535850, acronimo:
BrainPrecision) nel quadro dell'azione "Azioni faro in
Aree scientifiche interdisciplinari con particolare interesse per la connessione
al tessuto produttivo", nell'ambito del Piano Nazionale per la Ripresa e la Resilienza
Piano "Grecia 2.0", l'Agenzia esecutiva per la ricerca della Commissione europea
L'Excellence Hub "CHAngeing" (GA-101087071) e la Fondazione Ellenica
per la Ricerca e l'Innovazione (H.F.R.I.) nell'ambito del "1° Bando per H.F.R.I.
Progetti di ricerca a supporto dei docenti e dei ricercatori e
l'acquisto di attrezzature di ricerca ad alto costo" (numero del progetto:
HFRI-FM17C3-0869, Neuromitofagia).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Computer con accesso a internet (esempio: Dell Vostro Desktop)Diverse (ad esempio Dell) -Questo permetterà di eseguire SegElegans online tramite cloud computing come raccomandato e di utilizzare software di analisi delle immagini come ImageJ.
Unità di elaborazione grafica compatibile con CUDA con almeno 6 GB di VRAM (esempio: MSI Geforce RTX  RTX3050 Ventus 2X 6GB) (Opzionale)NVIDIA + diversi produttori (ad esempio Micro Star International)https://developer.nvidia.com/cuda-gpusQuesto permetterà di eseguire SegElegan offline su una macchina locale.
chipset GPU compatibili CUDA sono disponibili qui:
https://developer.nvidia.com/cuda-gpus
La VRAM dipende dall'effettiva implementazione del chipset in una GPU da parte del produttore.
ATTENZIONE: Sarà necessaria una scheda CUDA costosa e potente ben oltre i requisiti minimi (16+ GB di VRAM) per eguagliare le prestazioni ottenute dalla versione cloud computing.
Microscopio a epifluorescenza (Invitrogen EVOS FL Auto 2)ThermoFisher Scientific AMAFD2000 ad esempioRaccomandiamo di utilizzare un sistema che possa acquisire automaticamente immagini sia da campo chiaro che da uno o più canali di fluorescenza quasi simultaneamente.
ImageJ (Opzionale)NIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsConsigliamo la distribuzione Fiji, disponibile qui:
https://imagej.net/software/fiji/downloads
PC con compatibilità GPU NVIDIA (esempio: Dell Vostro Desktop) (Opzionale) & nbsp;Diverse (ad esempio Dell) -Questo è necessario in combinazione con la GPU per eseguire SegElegans offline su una macchina locale.
Una GPU richiederà hardware compatibile con Windows con gli slot PCI appropriati sulla scheda madre, spazio per la scheda e un alimentatore sufficientemente potente.
SegElegans-https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 Vedi il manoscritto per le istruzioni complete. 

Riferimenti

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