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Articolo metodologico

Isolamento e purificazione dei cardiomiociti adulti del topo tramite perfusione di Langendorff e sedimentazione gravitazionale

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DOI:

10.3791/69102

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31 marzo 2026

 ,  , 
1Deqing People's Hospital, 2School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 3Anesthesiology Department, Shanxi Provincial People's Hospital Affiliated Shanxi Medical University

In questo articolo

Sommario

Questo studio mira a ottimizzare e snellire la procedura di estrazione dei cardiomiociti topini adulti, con l'obiettivo finale di migliorare le metodologie di ricerca nelle malattie cardiovascolari. Questo protocollo ottiene in modo efficiente cardiomioci con alta vitalità e purezza con tempi di elaborazione ridotti, consentendo sperimentazioni più affidabili e accelerando i progressi terapeutici.

Abstract

Le malattie cardiovascolari rimangono una grande sfida sanitaria globale, creando un bisogno critico di modelli in vitro affidabili. Questo studio presenta un protocollo ottimizzato per l'isolamento e la coltura di cardiomiociti adulti di topo al fine di affrontare le limitazioni della bassa vitalità e della contaminazione non cardiomiocitaria nei metodi esistenti. Il protocollo si basa sulla perfusione di Langendorff retrograda, utilizzando eparina sodica per l'anticoagulazione e impiegando solo collagenasi di tipo II (1,2 mg/mL) per la digestione. I cardiomiociti venivano purificati tramite sedimentazione gravitazionale e coltivati su superfici rivestite di laminina. Questo metodo ha costantemente prodotto 8,75 ± 0,36 × 105 cardiomiociti per cuore con un'alta proporzione di cellule a bastoncello (91,2% ± 2,11%) e un'alta purezza (la percentuale di cellule cTNT⁺DAPI⁺ rispetto a quelle DAPI⁺ era circa il 97,47% ± 1,365%), che mostrava strutture sarcomeriche chiare. Fornendo un metodo standardizzato e riproducibile per ottenere cardiomiociti adulti di alta qualità, questo protocollo colma efficacemente il divario tra gli studi in vitro e la rilevanza fisiopatologica, supportando così la ricerca cardiovascolare avanzata.

Introduzione

Le malattie cardiovascolari rimangono la principale causa di mortalità a livellomondiale 1. I cardiomiociti, come focus centrale nella ricerca cardiaca, sono a lungo stati strumenti essenziali per l'indagine della fisiologia e patologiacardiaca 2. Sebbene le linee cellulari cardiomiocitariche commercialmente disponibili e i cardiomiociti umani pluripotenti derivati da cellule staminali (hPSC-CM) recentemente popolarizzati offrano maggiori vantaggi in termini di accessibilità e facilità dimanipolazione 3,4,5, i cardiomiociti primari isolati ex vivo dimostrano una superiore correlazione strutturale e funzionale con i meccanismi fisiologici e patologici cardiaci. Pertanto, padroneggiare le tecniche per l'isolamento cardiomiocitato in vitro è di fondamentale importanza.

I cardiomiociti mostrano trasformazioni morfologiche e funzionali distinte durante lo sviluppo. In particolare, queste cellule mantengono il potenziale proliferativo durante lo sviluppo embrionale e il periodo neonatale (entro 7 giorni dalla nascita), ma questa capacità rigenerativa viene definitivamente persadopo 6. Attraverso la maturazione postnatale, i cardiomiociti subiscono un notevole rimodellamento morfologico, acquisendo infine il loro fenotipo caratteristico adulto entro i 2 mesi di età - caratterizzato da morfologia a bastoncello e struttura sarcomerica altamenteorganizzata 7,8. Queste caratteristiche dipendenti dallo stadio di sviluppo sottolineano l'importanza cruciale dell'utilizzo dei cardiomiociti adulti del topo per studi meccanicistici della fisiopatologia cardiaca.

Fondamentale per far avanzare questo campo è l'approvvigionamento affidabile di cardiomiociti ad alta fedeltà, in particolare cellule di origine adulta che emulano accuratamente la fisiologia cardiaca umana. Gli attuali protocolli di isolamento per i cardiomiociti murini adulti affrontano diverse sfide persistenti: (i) compromissa vitalità cellulare, (ii) caratteristiche eterogenee della popolazione e (iii) procedure tecnicamente impegnative - tutte cose che complessivamente ostacolano i progressi dellaricerca 9,10. Ciò sottolinea l'urgente necessità di ottimizzare le metodologie di isolamento per ottenere sia una resa che una purezza aumentate, fornendo così piattaforme cellulari più rilevanti dal punto di vista fisiologico per l'indagine sulle malattie cardiovascolari.

Attraverso l'ottimizzazione sistematica dei parametri di perfusione, dei protocolli di digestione enzimatica e delle formulazioni di reagenti, questo studio ha riconosciuto con successo una metodologia migliorata per l'isolamento e la coltivazione dei cardiomiociti murini adulti. Il protocollo ottimizzato produce cardiomiociti con integrità morfologica ben conservata, caratterizzati da alti rapporti a forma di bacchetta e strutture sarcomeriche chiaramente visibili. Questi progressi forniscono una solida piattaforma sperimentale per un'indagine approfondita della fisiopatologia cardiomiocitica, facilitando in modo significativo la ricerca sulle malattie cardiovascolari focalizzata sui meccanismi cellulari miocardici.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali in questo studio sono state eseguite rigorosamente in conformità con le linee guida del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (IACUC) approvate dal Comitato Etico del Deqing People's Hospital. Lo studio ha utilizzato topi maschi C57BL/6 di 8-12 settimane acquistati da GemPharmatech Co., Ltd. Tutti gli animali erano ospitati in strutture barriera di grado SPF con parametri ambientali conformi agli standard nazionali (temperatura ambiente 22 ± 2 °C, umidità relativa 50 ± 10%, ciclo luce/buio di 12/12 ore). Durante gli esperimenti, questo studio ha rispettato rigorosamente i principi "3R" (Sostituzione, Riduzione, Raffinatezza) e ha implementato procedure standard, incluse anestesia e analgesia, per minimizzare la sofferenza animale.

NOTA: In breve, il cuore intatto viene rapidamente estratto dalla cavità toracica murina e sottoposto a perfusione retrograda con soluzione di collagenasi di tipo II tramite l'apparato di Langendorff per digerire enzimaticamente la matrice extracellulare. Dopo la digestione completa dei tessuti, il miocardio ammorbidito viene accuratamente dissociato in una sospensione monocellulare. La sospensione cellulare risultante viene filtrata sequencialmente per rimuovere i frammenti di tessuto non digeriti, seguita da sedimentazione gravitazionale per arricchire cardiomiociti vitali. I cardiomiociti purificati possono poi essere utilizzati per applicazioni sperimentali successive.

1. Preparazione del dispositivo di perfusione di Langendorff

NOTA: Il sistema Langendorff ha un volume totale di tubi di 15,5 mL. La portata di perfusione è di 3,5 mL/min per la perfusione cardiaca e di 10-15 mL/min per il lavaggio del sistema.

  1. Risciacquo il sistema di perfusione Langendorff con 50 mL di etanolo al 75%.
    NOTA: Esegui una pulizia mensile dei tubi di vetro con 1 M HCl per garantire la sterilità.
  2. Risciacquo con 250 mL di ddH2Osterile per rimuovere i residui di etanolo ed eliminare le bolle d'aria.
  3. Imposta la temperatura del bagno-maria a 42 °C. Accendi la pompa per avviare il riscaldamento circolante e riempi la cavità esterna del tubo serpentino con acqua calda.
    NOTA: Questo garantisce che la perfusità raggiunga il cuore a 37 °C.

2. Preparazione del tampone

  1. Preparare il tampone di soluzione di Krebs-Bicarbonato (KB), il tampone di perfusione (PB), il tampone di digestione (DB), il mezzo di impiccatura miocitaria (MPM) e il mezzo di coltura miocitaria (MCM) secondo le formulazioni elencate nella Tabella 1.
    NOTA: Prepara fresco il giorno dell'uso.
  2. Preraffredda 10 mL di buffer KB su ghiaccio.
  3. Riempi il lumen con PB. Imposta la portata a 3,5 mL/min e misura la temperatura dell'effluente (37 °C è ottimale).
  4. Sciacquare 7 mL di DB nella tubazione, poi chiudere la linea di perfusione.
  5. Prepara una soluzione di eparina sodica (0,5%, 62,5 KU) e carica 300 μL in una siringa di insulina.
  6. Aggiungere 10 mL di PB e 10 mL di KB in due piastre di Petri separate e preraffreddarle sul ghiaccio.
  7. Posizionare un colino a celle da 100 μm sul coperchio di un tubo centrifuga da 50 mL, pre-inhumidarlo con 1 mL di KB e fissarlo su un tubo centrifuga da 50 mL.

3. Estrazione cardiaca e cannulazione

NOTA: In questo protocollo, durante tutta la procedura sono stati utilizzati guanti sterili, strumenti, garze e cotton fioc per minimizzare la contaminazione esterna. Sebbene la tecnica asetttica completa sia essenziale per la coltura cellulare primaria, qui serviva a sostenere il benessere animale e l'integrità dei tessuti per le analisi istologiche e molecolari a valle, piuttosto che a mantenere la sterilità per l'isolamento cellulare.

  1. Anestesiare il topo tramite iniezione intraperitoneale di 80 mg/kg pentobarbital sodio (grado farmaceutico) combinato con 5 IU/g di peso corporeo di eparina sodio. Monitorare attentamente fino a quando non si ottiene l'anestesia profonda. Pizzica le dita dei piedi del topo e osserva la scomparsa del riflesso di pizzicare per confermare il successo dell'anestesia.
  2. Rimuovere i peli toracici usando una crema depilatoria.
  3. Fissa il topo su una tavola di schiuma e disinfetta la pelle del petto con alcol al 75%.
  4. Solleva la pelle toracica con la pinza e fai un'incisione nel processo xifoide.
  5. Sollevare lo xifoide e tagliare le costole bilateralmente verso le regioni ascellari, poi trancetto completamente il diaframma.
    NOTA: Evita di danneggiare il cuore.
  6. Immobilizza lo sterno e le costole usando la pinza emostatica per esporre completamente il cuore.
  7. Assorbire il sangue e spostare delicatamente il fegato verso gli arti posteriori con tessuto. Usa con attenzione i cotton fioc per manipolare il cuore e esporre la vena cava inferiore.
  8. Iniettare 300 μL di soluzione di eparina sodio (dal passo 2.5) nella vena cava inferiore usando la siringa di insulina preparata.
    NOTA: Fai attenzione a prevenire l'introduzione di bolle d'aria.
  9. Espelle il tessuto timico, poi recidi le vene e le arterie circostanti. Trasferisci immediatamente il cuore al buffer di cacaduta pre-raffreddata (dal passo 2.6).
    NOTA: La rimozione del timo migliora la visibilità aortica. Preservare un segmento aortico durante l'escissione. La contrazione miocardica è stata rallentata dalla soluzione di PB preraffreddata. L'escissione cardiaca sotto anestesia consente un'eutanasia umana.
  10. Utilizzando micropinze, afferrare l'aorta e montarla sulla cannula del sistema di perfusione di Langendorff. Fissa con sutura di seta 5-0.
    NOTA: Esegui questo passaggio rapidamente. Assicurati che il sistema di perfusione sia disattivato durante la montatura del cuore.

4. Perfusione cardiaca

  1. Attiva il sistema di perfusione e avvia il timing per 2 minuti e 30 secondi. Durante questo periodo, l'effluente è costituito da buffer PB e non necessita di raccolta.
  2. Al termine dell'intervallo di 2 minuti e 30 secondi, inizia a raccogliere e ricircolare il buffer DB mentre si cronica per 15 minuti.
    NOTA: Monitorare lo stato miocardico - la digestione ottimale è indicata da una riduzione dell'elasticità tissutale e un aumento della trasparenza. Se la digestione appare incompleta, la durata può essere moderatamente estesa, ma non dovrebbe superare i 20 minuti totali per prevenire danni cardiomiociti.
  3. Dopo il periodo a tempo, passa da DB a PB buffer e continua la perfusione per altri 4 minuti e 30 secondi. L'effluente durante questa fase contiene un buffer DB; Raccoglilo.
  4. Interrompi la perfusione spegnendo il sistema dopo l'ultimo intervallo di tempo.

5. Dissociazione e purificazione cellulare

  1. Rimuovi il cuore dalla cannula e trasferiscilo nel buffer KB pre-raffreddato (preparato nel passo 2.6).
    NOTA: La digestione enzimatica è stata interrotta con il trasferimento immediato del cuore nel buffer KB. Questo diluisce rapidamente l'enzima residuo, prevenendo una digestione eccessiva e garantendo un'elevata vitalità cellulare.
  2. Con forbici sottili, si eliminano con cura i tessuti atriali e aortici, trattenendo solo il miocardio.
  3. Dissociare meccanicamente il tessuto miocardico in piccoli frammenti (<1 mm3) utilizzando microforceps.
  4. Soffia delicatamente via i frammenti di tessuto usando un contagocce da 2 mL per ottenere una sospensione a singola cellula.
    NOTA: Esercitare estrema attenzione durante il soffiamento per preservare la morfologia dei cardiomiociti a forma di bastoncello. Evita di usare punte standard di pipetta, poiché il loro diametro stretto potrebbe compromettere meccanicamente l'integrità cellulare.
  5. Filtrare la sospensione risultante attraverso il filtro per celle da 100 μm pre-bagnato (assemblato nel passo 2.7) in un tubo da 50 mL.
  6. Trasferire la sospensione filtrata su un tubo da 15 mL e lasciare che i cardiomiociti si depositino tramite sedimentazione gravitazionale (15 min, 4 °C).
    NOTA: La riduzione della superficie basale dei tubi da 15 mL migliora significativamente l'efficienza del recupero cellulare rispetto ai tubi da 50 mL.
  7. Aspirare con cura il surnatante, risospendere i cardiomiociti a pellet in 10 mL di tampone KB gelato usando una pipetta di trasferimento da 2 mL, e ripetere la sedimentazione (15 min, 4 °C).
  8. Ripeti i passaggi 5.4-5.7 per ottenere una preparazione purificata di cardiomiociti intatti a forma di bastoncello, adatti alle applicazioni.

6. Coltura cellulare

  1. Ricoprire le ciotole di coltura con 10 μg/mL laminina e incubare a 37 °C per 2 ore.
    NOTA: Per minimizzare i danni meccanici ai cardiomiociti a forma di bastoncello e ridurre i tempi di elaborazione prolungati associati alla placcatura differenziale, questo studio ha utilizzato il rivestimento laminina invece della placcatura differenziale, una strategia che non solo migliora l'efficienza dell'attacco cellulare ma preserva anche le caratteristiche fisiologiche native dei cardiomiociti.
  2. Risospendere i cardiomiociti in 4 mL di MPM preriscaldati (37 °C). Dopo aver rimosso la soluzione di laminina, semina i cardiomiociti nelle piastre rivestite. Incubare a 37 °C con il 2% diCO2 per 1 ora. Osserva la morfologia, la dimensione e la densità cellulare al microscopio.
  3. Dopo l'incubazione, si decanta con cura il MPM e sostituiscilo con MCM preriscaldato (37 °C). Mantieni l'incubazione a 37 °C con il 2% diCO2 per 24 ore.
  4. Dopo 24 ore, esaminare i cardiomiociti per l'integrità strutturale e la morfologia.
    NOTA: Mantieni una tecnica asettica rigorosa durante tutta la procedura.
    ATTENZIONE: Il collagenasi di tipo II può causare allergie respiratorie, irritazione della pelle e degli occhi. Assicurati di operare in un'area ben ventilata ed evitare di inalare polvere o entrare in contatto con pelle e mucose. Tutti i tessuti cardiaci di topo scartati, campioni di sangue e qualsiasi materiale usa e getta che siano entrati in contatto con essi devono essere raccolti come rifiuti biologici in contenitori dedicati e a prova di perdite, contrasposti con il simbolo di biohazard. Questi materiali sono successivamente sottoposti a procedure centralizzate di decontaminazione e smaltimento.

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Risultati

La procedura di isolamento e coltura dei cardiomiociti di topo adulto è illustrata nel protocollo, con la strumentazione necessaria e la configurazione dei tubi illustrate nella Figura 1. La valutazione morfologica ha rivelato che i cardiomiociti appena isolati, così come quelli coltivati per 1 ora e 24 ore, presentavano tutti una morfologia caratteristica a forma di bastoncello o fusiforme con striature chiaramente visibili (Figure 2A-C

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Discussione

Questo studio rappresenta una significativa svolta metodologica nella ricerca cardiovascolare stabilendo un protocollo ottimizzato per l'isolamento e la coltura dei cardiomiociti di topo adulto. Attraverso un raffinamento sistematico della composizione del tampone e dei parametri di digestione enzimatica, questo approccio migliora notevolmente l'affidabilità del sistema di coltura migliorando sia la purezza che la vitalità dei cardiomiociti. Questi progressi tecnici forniscono una solida...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Ringraziamo con gratitudine il sostegno finanziario fornito dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82400312).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BDMAladdin Scientific Corporation, Shanghai, CinaD111028
BSAAladdin Scientific Corporation, Shanghai, CinaB265994
C57BL/6 topi GemPharmatech Co., Ltd8– Maschio di 12 settimane 
CaCl2Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, CinaC431202
Collagenasi tipo IIWorthington Biochemical Corporation (USA)LS004176LOT#:43D23502    Unità di attività enzimatica: 270u/mg dw
FBSBeyotime Biotechnology, CinaC0226
GlucosioAladdin Scientific Corporation, Shanghai, CinaD639737
HEPESSigma-AldrichH7006
KClAladdin Scientific Corporation, Shanghai, CinaP112134
KH2PO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, CinaP104075
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030081
MEMThermo Fisher Scientific11095080
MgSO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, CinaM116444
Na2HPO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, CinaS274390
NaClAladdin Scientific Corporation, Shanghai, CinaC111547
NaH2PO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, CinaS108339
NaHCO3Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, CinaS112338
Penicillina-estreptomicina (100x)Beyotime Biotechnology, CinaC0222
Microscopio Primovert per Colture Cellulari Invertite  Carl Zeiss
TaurinaAladdin Scientific Corporation, Shanghai, CinaT103829

Riferimenti

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