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Articolo metodologico

Valutazione radiochimica dell'attività dell'enzima glicogeno sintasi nei tessuti animali

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DOI:

10.3791/69103

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24 ottobre 2025

 , 
1Indiana University School of Medicine-Muncie and Ball State University

In questo articolo

Sommario

Il test sui tessuti animali utilizza la rilevazione a scintillazione nucleare per determinare l'attività enzimatica della glicogeno sintasi misurando l'incorporazione del glucosio radiomarcato nel glicogeno.

Abstract

Il glicogeno è un metabolita importante per molte cellule eucariotiche, parte integrante dell'accumulo di energia e del rilascio rapido di energia. La costruzione della molecola dipende dalla glicogeno sintasi, un enzima altamente regolato con la funzione primaria di facilitare l'attacco sequenziale delle unità di glucosio in un polimero di glicogeno in crescita. Questo enzima è attivato allostericamente dal glucosio-6-fosfato e inibito in più siti dalla fosforilazione. La conoscenza dell'attività enzimatica della glicogeno sintasi è una componente chiave per comprendere il metabolismo del glicogeno, i livelli di energia muscolare e i disturbi metabolici come il diabete e le malattie da accumulo di glicogeno. Qui descritto è un metodo altamente sensibile ed efficace per determinare l'attività della glicogeno sintasi nel tessuto muscolare animale misurando la quantità di glucosio integrato, dal glucosio [14C]-UDP radiomarcato, nelle molecole di glicogeno. Questa procedura utilizza 14C radioattivo e richiederà l'autorizzazione appropriata e lo spazio di laboratorio per l'uso e lo smaltimento. Questa procedura richiederà anche l'accesso a un contatore a scintillazione liquida.

Introduzione

Il glicogeno, un polisaccaride altamente ramificato composto da unità di glucosio, funge da importante riserva di energia in vari tessuti, tra cui muscoli, fegato e cervello1. La sua sintesi e degradazione sono orchestrate da un complesso sistema di enzimi specializzati e proteine regolatrici. Vitale per la sua biosintesi è l'enzima glicogeno sintasi (GYS), di cui esistono due isoforme (GYS1 e GYS2). GYS1 è un enzima regolatore direttamente responsabile della creazione di glicogeno dal glucosio nelle cellule non epatiche, mentre GYS2 funziona nel fegato. Questo processo, noto come glicogenesi, è l'aggiunta sequenziale di una singola unità di glucosio su una catena di glicogeno in crescita. GYS catalizza il trasferimento di glucosio dall'intermedio uridina difosfato glucosio (UDP-glucosio) all'estremità di una catena di glicogeno, creando un legame alfa-1,4-glicosidico2. In coordinazione con l'enzima ramificante del glicogeno, questa reazione estende le molecole di glicogeno, fornendo sia un efficiente immagazzinamento che un rilascio di energia.

Esistono tecniche di saggio per misurare l'attività dell'enzima, con uno dei raggruppamenti più comuni di metodi costituito da quelli della varietà spettrofotometrica 3,4. Questi saggi si basano tipicamente su un sistema di reazioni accoppiate indirette e misurano l'assorbanza del prodotto a valle, NADH, a 340 nm. Viene consumata un'unità di NADH per ogni unità di UDP liberata dall'UDP-glucosio dalla glicogeno sintasi, producendo un'eccitazione misurabile che è direttamente correlata all'attività della glicogeno sintasi 5,6. Sebbene i saggi spettrofotometrici siano relativamente economici e accessibili, presentano il piccolo svantaggio di affidarsi a una reazione indiretta e i principali svantaggi dell'interferenza dovuta alla torbidità del campione e alla minore sensibilità, in particolare un problema per i campioni più piccoli o per i campioni con glicogeno sintasi poco/altamente fosforilata. I saggi fluorometrici, utilizzando le reazioni accoppiate sopra descritte, sono stati sviluppati per migliorare la sensibilità nel tessuto muscolare dell'uomo7 e del topo8. Esistono altre tecniche per quantificare la glicogeno sintasi, come l'immunoblotting9 e l'immunoistochimica10; Tuttavia, queste tecniche sono in grado di quantificare solo la quantità fisica dell'enzima e, nella migliore delle ipotesi, possono dedurre l'attività dalla fosforilazione ma non quantificare direttamente l'attività dell'enzima11.

Tra queste tecniche di analisi enzimatica, i metodi radiochimici rimangono i più utilizzati per determinare l'attività della glicogeno sintasi nei tessuti dei mammiferi a causa della loro mancanza di interferenza da parte della torbidità del campione e della loro elevata sensibilità 8,9. Questi saggi incorporano glucosio radiomarcato da UDP-glucosio marcato con 14C12 o 3H13 in glicogeno, consentendo la misurazione diretta dell'attività enzimatica in un determinato periodo di tempo. Nella procedura seguente, un campione di tessuto contenente glicogeno sintasi viene esposto a UDP-glucosio e primer di glicogeno. La glicogeno sintasi catalizza la reazione mostrata nell'equazione seguente:

UDP-[14C]glucosio + (glicogeno)n → (glicogeno)n+1[14C] + UDP

Dopo un determinato periodo di tempo, la reazione viene terminata e il glicogeno contenente glucosio radiomarcato viene precipitato su carta da filtro12 (come descritto di seguito) o sottoposto a filtrazione su gel come descritto da Niederwanger et al.14 e misurato utilizzando un rivelatore a scintillazione. Questo metodo include anche una reazione identica separata che include il glucosio-6-fosfato (G6P), un attivatore allosterico della glicogeno sintasi. In condizioni con livelli sufficienti di G6P, l'attività della glicogeno sintasi è attivata al massimo, mostrando il potenziale assoluto per l'attività della glicogeno sintasi di un dato campione. Il metodo qui descritto è stato modificato da Suzuki e colleghi15 a un formato a 96 pozzetti ed è ottimizzato per l'uso nel tessuto muscolare del topo; Tuttavia, il protocollo può essere modificato per altri tessuti e specie animali.

Nonostante i costi intrinseci e le considerazioni di sicurezza associate ai materiali radioattivi, i saggi radiochimici offrono vantaggi significativi rispetto alle alternative non radioattive, a condizione che siano disponibili strumenti. La seguente procedura descrive in dettaglio un mezzo altamente sensibile e robusto per determinare l'attività della glicogeno sintasi, un enzima chiave nel metabolismo del glicogeno, nel tessuto muscolare animale.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Ball State University. Coorti maschili e femminili di B6; I topi wildtype 129-Gaatm1Rabn/J, di età pari a 3 mesi, sono utilizzati come esempio rappresentativo in questo manoscritto. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione prima del saggio

  1. Prelevare il tessuto mediante lussazione cervicale16 e congelarlo immediatamente in N2 liquido per preservare le riserve di glicogeno e conservare in N2 liquido o congelatore ultrabasso fino all'inizio del test.
  2. Preparare le soluzioni madre prima dell'inizio del saggio della glicogeno sintasi (Tabella 1).
  3. Determinare il numero di campioni di topo replicati e i controlli desiderati per il saggio. Ogni campione di topo richiede quattro repliche totali, due per ogni reazione (presenza o assenza di G6P) (vedi Figura 1 e Tabella 2).
  4. Tagliare la carta per cromatografia in strisce di 4 cm. Il glicogeno si attacca a questa carta e rimane legato durante il processo di lavaggio. Utilizzando la larghezza (6 mm) di un distruggidocumenti, sminuzzare la carta per cromatografia in singoli segmenti sottili.
  5. Usando una matita, etichetta le strisce di carta designate con l'identificazione del mouse, gli spazi vuoti e i totali. Evitare l'uso di inchiostro.
  6. Caricare le carte per cromatografia nella sagoma del blocco di legno. Ogni modello contiene fino a 12 documenti, corrispondenti a una fila di una piastra a 96 pozzetti.
  7. Procurarsi delle pinze per carta per cromatografia (parte superiore degli appunti).
  8. Preparare un morsetto per ogni fila di reazione bloccando i bordi delle carte per cromatografia, lasciando esposta la maggior parte della superficie delle carte. Assicurati che i bordi etichettati siano visibili.
  9. Etichettare le provette microfughe da 1,7 mL con l'identificazione del campione. Due provette per campione; uno per l'omogeneizzato e uno per il surnatante.
  10. Prima dell'inizio del saggio, preparare entrambe le miscele di reazione + e - G6P, vedere la Tabella 3 per ulteriori informazioni. Preparare aliquote da 2.400 μl di ciascuna miscela di reazione.

2. Reazione radiochimica all'attività della glicogeno sintasi

ATTENZIONE: Questo passaggio contiene l'uso di [14C]-UDP-glucosio, che è un materiale radioattivo. Maneggiare, conservare e smaltire in modo approvato dalla Nuclear Regulatory Commission (NRC).

  1. Aggiungere 30 μL di [14C]-UDP-glucosio (0,1 μCi/μL) a 2.400 μL di aliquote di entrambe le miscele di reazione (+/- G6P) per una concentrazione finale di 0,0012 μCi/μL. Questa ricetta è adatta per 18 campioni.
    NOTA: Il volume di glucosio [14C]-UDP può essere modificato per preservarne l'uso e garantire un'adeguata sensibilità. Ad esempio, utilizzare 50 μl per il tessuto cerebrale di topo e 25 μl per il cuore di topo.
  2. Miscele di reazione a vortice e aliquotare 50 μL in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti che conterrà campioni, bianchi e totali (Tabella 2). Successivamente coprire con pellicola e posizionare a 4 C.
  3. Preparare gli inibitori della proteasi a scongelare a temperatura ambiente. Questi inibitori sono dettagliati nella Tabella 4 con ulteriori informazioni.
  4. Eliminare 30-50 mg di tessuto congelato. ~30 mg è ottimale per campioni di muscolo scheletrico e cuore; ~50 mg per il cervello. Conservare i fazzoletti e le provette per microfugi nell'N2 liquido e pesare rapidamente il fazzoletto per assicurarsi che rimanga congelato. Usa un pestello raffreddato per macinare ulteriormente il tessuto.
  5. Preparare il tampone di omogeneizzazione con inibitori della proteasi su ghiaccio.
  6. Un campione alla volta, spostare la provetta con il tessuto dal liquido N2 al ghiaccio con un tappo freddo per 1 minuto. Aggiungere un tappo freddo (tappo della provetta con tre piccoli fori raffreddati nel liquido N2) alla provetta del campione mentre è ancora nel liquido N2. In questo modo si evita la perdita di tessuto poiché il liquido residuo N2 nella provetta evapora. Una volta esaurito il liquido N2, i campioni devono rimanere nel ghiaccio.
  7. Una volta sul ghiaccio, aggiungere al campione un volume (10-30 μL/mg di tessuto) di tampone di omogeneizzazione e omogeneizzare il campione con Tissue-Tearor. Dopo aver completato questi due passaggi, passare all'esempio successivo.
    NOTA: Il volume del tampone aggiunto ai campioni può essere ottimizzato a seconda della fonte di tessuto. Ad esempio: 30 μL/mg per il muscolo scheletrico, 15 μL/mg per il cuore e 10 μL/mg per il cervello.
  8. Centrifugare i campioni per 5 minuti a 4 °C a 3.600 g e trasferire il surnatante in una provetta per microfughe pulita. Fare attenzione a non toccare il pellet. Vorticare e aggiungere ~150 μL ai pozzetti corrispondenti in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V su ghiaccio. Conservare il resto come surnatante per il test di Bradford (vedere il passaggio 2.15)
    NOTA: Se lo si desidera, è possibile salvare aliquote di campioni aggiuntive per saggi successivi come l'immunoblotting.
    ATTENZIONE: I passaggi da 2.9 a 2.14 richiedono la manipolazione di 14C. Smaltire tutti i materiali contaminati in modo approvato dall'NRC.
  9. Togliere la piastra di miscelazione di reazione da 4 °C e scaldare a 30 °C sul termociclatore con la pellicola rimossa. Durante questo periodo, ottenere 1 L di etanolo al 66% a -20 °C e aggiungerlo a un becher di lavaggio con un'asta di agitazione sulla piastra di agitazione.
  10. Avviare la reazione aggiungendo 25 μl di surnatante del campione ai pozzetti di reazione e 25 μl di tampone di omogeneizzazione ai pozzetti bianchi e totali. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere a 1 fila alla volta sulla piastra di reazione, attendendo almeno 1 minuto tra le file. Registrare l'ora in cui è stata avviata la reazione per ogni riga. Per ulteriori informazioni, vedere la Tabella 2 . Utilizzare una pipetta multicanale e assicurarsi che vengano aggiunti volumi uguali di liquido.
  11. Attendere 10-15 minuti affinché la reazione venga eseguita; Tuttavia, il tempo di esecuzione deve essere identico tra le righe.
  12. Aspirare 55 μl da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale ed erogare sulle rispettive carte per cromatografia preparate in precedenza. Miscelare la reazione pipettando su e giù prima dell'aspirazione. Spot liquido al centro delle carte per cromatografia.
  13. Rimuovere le carte con i totali dalla pinza usando una pinza dopo aver individuato il liquido dal pozzo. Questi possono essere stesi su un foglio di alluminio in modo sicuro per asciugare. Immergere tutte le altre carte per cromatografia nel bagno di etanolo, agitato al 66%. Il glicogeno è insolubile in etanolo al 66%, mentre il glucosio [14C]-UDP è solubile e lava via le carte cromatografiche.
  14. Ripetere i passaggi 2.11 e 2.12 per ogni riga sulla piastra di reazione. Assicurati che il tempo di reazione di ogni riga sia lo stesso registrando i tempi di inizio e fine della reazione.
  15. Una volta aggiunte tutte le file all'etanolo al 66% in fermento, lavare per 15 minuti.
    NOTA: Durante questa fase e le successive fasi di lavaggio, le aliquote dei campioni possono essere preparate per saggi complementari, come il test di Bradford, responsabile della determinazione del volume totale di proteine per la normalizzazione, necessaria per calcolare l'attività enzimatica.
  16. Smaltire l'etanolo al 66% senza perdere la carta per cromatografia. Lavare con 1 L di etanolo nuovo al 66% per 30 minuti. Questo etanolo al 66% può essere a temperatura ambiente.
  17. Ripetere il passaggio precedente per un totale di tre lavaggi di 30 minuti con etanolo al 66%.
    NOTA: Se lo si desidera, l'etanolo al 66% della fase di lavaggio finale può essere conservato e conservato a -20 °C per i test successivi.
  18. Dopo aver rimosso l'etanolo al 66%, immergere tutte le carte per cromatografia nel becher di lavaggio in acetone. L'acetone facilita il processo di essiccazione.
  19. Rimuovere la carta per cromatografia dall'acetone e adagiarla su un foglio di alluminio. Conservare o smaltire l'acetone.
  20. Asciugare le carte per cromatografia sotto una lampada riscaldante per 15 min.
    NOTA: La carta asciutta può essere conservata a tempo indeterminato. I documenti possono essere conservati in modo sicuro fino al momento di procedere al rilevamento a scintillazione.

3. Attività di misura con rilevamento a scintillazione

  1. Utilizzando una pinza, spostare le carte per cromatografia in fiale di scintillazione conservate in rack di scintillazione. Registra come sono orientati i documenti di esempio.
  2. Aggiungere 5 mL di liquido di scintillazione in ciascuna fiala utilizzando la pompa del coperchio. Avvitare i tappi per ogni flaconcino.
  3. Caricare i campioni nel rivelatore a scintillazione e caricare il rack di arresto dietro i campioni. Assicurarsi che il programma per il monitoraggio 14C sia selezionato. Avviare il rilevamento selezionando Conteggio automatico.
  4. Risultati di stampa
  5. Smaltire i tubi a scintillazione e il contenuto in modo approvato dall'NRC.

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Risultati

Seguendo il protocollo, una stampa creata dal rivelatore a scintillazione conterrà la quantità misurata di radiazioni ionizzanti emesse da ciascuna fiala di carta cromatografica contenente una fiala, direttamente correlata al livello di attività della glicogeno sintasi. Il rivelatore a scintillazione calcolerà i conteggi al minuto (CPM) della radiazione rilevata per ogni campione, bianco e totale in un determinato periodo di tempo. Per prima cosa converti CPM in DPM (disintegrazioni al m...

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Discussione

La misurazione dell'attività dell'enzima glicogeno sintasi è uno strumento prezioso per monitorare il metabolismo del glicogeno in vari stati metabolici e patologici. La misurazione dell'assenza e della presenza di glucosio-6-fosfato (G6P) offre informazioni sullo stato regolatorio dell'enzima e un indice indiretto dello stato di fosforilazione. Il saggio di incorporazione del glucosio [U-14C]-UDP è una tecnica efficiente e ben documentata per misurare l'attività enzimatica de...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Il finanziamento è stato fornito in parte dalla Ball State University, dalla Indiana University School of Medicine-Muncie e da Aro Biotherapeutics.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
[14C] Uridina 5-difosfo-glucosioSostanze chimiche radiomarcate americaneARCO 0154
31 Articolo di cromatografia ETCHRWhatman3031 915
Benzamidina cloridratoSigmaB6506
Beta mercaptoetanoloSigmaM3148
Bagno a seccoTorey Pines ScientificSC25
Etanolo (200 proof)PharmcoAaper111000200
Acido tetraacetico etilenico glicole (EGTA)SigmaE4378
Acido etilendediaminatetraacetico (EDTA)SigmaE5134
Glucosio-6-fosfato sale di sodioSigmaG7879
Glicogeno dal fegato del coniglio (Tipo III)SigmaG8876
Micropiastra a fondo piatto, 96 pozziGreiner655101
Microplacche, PCR, 96 pozziDOT Scientific951-PCR
Contatore a scintillazione multiusoBeckman CoulterLS 6500
Diidrato di fluoruro di potassioSigma221872
Cocktail inibitori della proteasiGoldBioGB-108-2
Cocktail di scintillazioneProdotti di ricerca internazionale111195
Fiale a scintillazioneProdotti di ricerca internazionale125509
Fluoruro di sodioSigmaS7920
Strappo tissutaleProdotti BiospecModello 398
Tosilisina Clorometil Chetone (TLCK)SigmaT7254
Base di Trizma (99,9%)SigmaT1503
Cloridrato di TrizmaSigmaT3253
Uridina 5-difospo-glucosioSigmaU-4625

Riferimenti

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