Modello di amputazione dell'arto posteriore del ratto sotto il ginocchio e reinnervazione muscolare mirata immediata

Sommario

Questo protocollo dimostra come eseguire un'amputazione sotto il ginocchio nei ratti e come eseguire immediatamente una reinnervazione muscolare mirata (iTMR) per indagare strategie per trattare e prevenire il dolore correlato all'amputazione e per comprendere meglio i meccanismi dolorosi associati all'amputazione.

Abstract

Il dolore legato all'amputazione riduce la qualità della vita del paziente, contribuisce all'uso di oppioidi e può ridurre la riabilitazione funzionale e l'uso di protesi. I modelli preclinici che producono in modo affidabile dolore post-amputazione mantenendo la mobilità sono essenziali per studiare i meccanismi biologici alla base di questi esiti. Qui presentiamo un protocollo chirurgico dettagliato e riproducibile per roditori utilizzando ratti Sprague-Dawley per modellare l'amputazione dell'arto posteriore sotto il ginocchio. La procedura consiste nell'isolare e trasettare i rami del nervo sciatico, inclusi i nervi tibiale, peroneale comune e surale, produendo patologie nervose post-amputazione prolungate e comportamenti legati al dolore. I ratti si ripresero bene da questa procedura e possono camminare immediatamente dopo l'intervento senza difficoltà a mangiare o bere. Gli animali possono essere successivamente valutati con misure riflessive e spontanee del dolore. I comportamenti dolorosi derivanti da questa procedura sono robusti nel tempo, e i comportamenti riflessi standard del dolore possono essere ottenuti dal moncone. È importante sottolineare che la mobilità preservata consente test comportamentali longitudinali senza compromettere la motricità. Sebbene questo protocollo sia incentrato sull'amputazione, può essere facilmente adattato per incorporare la reinnervazione muscolare mirata (TMR) come intervento post-amputazione, coappungendo i nervi transectati ai rami motori vicini dei nervi, al bicipite femorale e al semimembranoso, permettendo di indagare sugli interventi di reinnervazione e sui loro effetti sul dolore post-amputazione. Abbiamo già utilizzato con successo questo modello per valutare le differenze specifiche per sesso nei comportamenti dolorosi dopo l'amputazione e per studiare gli effetti della TMR. Questo protocollo fornisce una piattaforma solida e flessibile per indagare il dolore correlato all'amputazione, la formazione dei neuromi e gli esiti funzionali, con applicabilità a studi traslazionali volti a migliorare il dolore post-amputazione.

Introduzione

Il dolore cronico è una delle complicazioni più debilitanti dopo amputazioni gravi dell'arto, colpendo fino al 70% dei pazienti ^1,2,3. Le strategie convenzionali di gestione del dolore, come interventi farmacologici, fisioterapia, blocchi nervosi e terapie psicologiche, spesso forniscono un sollievo limitato o^{transitorio 4}. Pertanto, rimane un importante bisogno clinico di strategie efficaci di gestione del dolore a lungo termine.

La reinnervazione muscolare mirata (TMR), inizialmente sviluppata per migliorare il controllo delle protesi mioelettriche, si è rivelata un approccio promettente per alleviare il dolore dopo l'amputazione^{dell'arto 5}. La tecnica chirurgica consiste nel reindirizzare nervi motorio-sensoriali misti trassectati verso rami motori vicini. Clinicamente, la TMR ha mostrato riduzioni sostanziali nel dolore agli arti fantasma, nel dolore residuo degli arti e nei sintomi correlati ^{al neuroma 6,7,8}. Le interfacce rigenerative dei nervi periferici (RPNI) sono un altro intervento chirurgico utilizzato per lesioni nervose e dolore correlato all'amputazione. Le estremità nervose amputate vengono cucite e poi avvolte in un innesto muscolare libero (denervato, avascolare^{) 9}. Gli assoni amputati neurotizzano le giunzioni neuromuscolari denervate creando una contrazione muscolare nell'innesto che può essere utilizzata per creare un segnale di controllo della mioprotesi. A differenza della TMR, l'RPNI è stato ampiamente studiato in un modello di roditori. Simile alla TMR, è stato dimostrato che l'RPNI previene la formazione di neuromi e riduce il dolore associato alla lesione da transezione^{nervosa 10,11}. Clinicamente, è stato dimostrato che la RPNI riduce sia il dolore fantasma che quello residuo degli arti negli^{amputati 12}.

Nonostante l'adozione clinica, i meccanismi biologici alla base degli effetti analgesici di TMR e RPNI restano poco compresi. I modelli preclinici sono fondamentali per chiarire questi meccanismi. Lavori precedenti hanno utilizzato modelli di transezione nervosa con modifiche per superficializzare il nervo e testare direttamente il dolore da^{neuroma 10,11}. Questi modelli possono quantificare il dolore neuromato con stimolazione diretta e il dolore neuropatico valutando i comportamenti del riflesso spinale nella distribuzione nervosa intatta rimasta nel piede. La lesione nervosa risparmiata, ad esempio, mantiene il nervo surale, mentre i nervi tibiali e peroneali comuni vengono secchiati. Il test del comportamento doloroso viene eseguito sul^{piede laterale 13}. Il modello di amputazione dell'arto posteriore rappresenta la lesione più grave possibile all'arto. Di conseguenza, si verifica una perdita neuronale diffusa e le significative esigenze infiammatorie e di guarigione associate a una lesione di questo tipo. Quando c'è una lesione nervosa, i neuroni sani nel DRG aiutano a mantenere i neuroni danneggiati. Con l'amputazione, la popolazione di neuroni sani disponibili si riduce notevolmente e, per ogni nervo lesionato, c'è una perdita neuronale maggiore rispetto a se solo un singolo nervo fosse stato^{lesionato 14, 15, 16}. Le segnalazioni precedenti di interventi di sopravvivenza da amputazione dell'arto posteriore da roditori sono rare^17,18. Tuttavia, ci sono vantaggi rispetto a un'amputazione dell'arto superiore, come l'abbondanza di dati storici che esaminano dolore e rigenerazione legati al nervo sciatico, oltre a molteplici test comportamentali^{ambulatorii 19,20}.

Per colmare questa lacuna, abbiamo recentemente sviluppato un modello di amputazione dell'arto posteriore del ratto che incorpora la TMR immediata (Figura 1). La tecnica per la creazione di RPNI è stata precedentemente pubblicata e può essere adattata al modello di amputazione dell'arto^{posteriore 21}. Questo modello rispecchia da vicino le procedure cliniche, permettendoci di valutare vari comportamenti del dolore, la formazione dei neuromi e la preservazione dei neuroni (Figura 2)^22. Il nostro lavoro ha dimostrato significativi benefici analgesici per la TMR rispetto all'amputazione standard, la prevenzione dei neuromi e ha dimostrato risposte sessualmente dimorfiche in sensibilità al^{freddo 22,23}.

Il protocollo qui presentato fornisce una dimostrazione visiva dettagliata e standardizzata della tecnica chirurgica, garantendo riproducibilità e coerenza negli approcci sperimentali. Illustrando chiaramente i passaggi chiave, tra cui l'isolamento nervoso, la transezione precisa e la coaptazione nervosa senza tensione, questo protocollo offre ai ricercatori un quadro solido per indagare i meccanismi alla base dell'analgesia mediata da TMR e della prevenzione dei neuromi.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali devono essere approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e rispettare la Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio del National Institutes (NIH).

1. Preparazione preoperatoria

NOTA: Sono stati utilizzati ratti maschi e femmine di Sprague-Dawley (Charles River Laboratories), di età compresa tra 8 e 10 settimane e dal peso di 250–300 g.

1. Accendi il tappeto riscaldante e prepara un campo chirurgico sterile. Posiziona un tampone sterile perpendicolare al corpo del ratto per una posizione ottimale.
2. Organizzare tutti gli strumenti e materiali chirurgici: soluzione salina sterile (cloruro di sodio allo 0,9%), soluzione antisettica povidone-iodio, meloxicam, cautery, microsutura 10-0, suture intrecciate assorbibili 4-0, righello e adesivo cutaneo.
   NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati tramite autoclaving o sterilizzazione con perle calde.
3. Indurre l'anestesia mettendo il ratto in una camera di induzione con isoflurano al 4%, ossigeno a 10 L/min e aria al 60%. Dopo 4 minuti o una volta che non risponde, passa a un cono nasale e regola l'isoflurano all'1,5%–2,0% a seconda della dimensione del ratto.
4. Rade il sito chirurgico dalla parte bassa della schiena fino a tutto l'arto posteriore. Esegui una tripla preparazione con soluzione antisettica alternata povidone-iodio e tamponi alcolici, terminando con alcol.
5. Somministrare 1 mg/kg di meloxicam in via sottocutanea usando una siringa di tubercolina (tipicamente 0,2 mL per un ratto da 200 g).

2. Amputazione sotto il ginocchio (Figura 1)

1. Usa un righello per segnare la linea dell'articolazione del ginocchio e fai due segni aggiuntivi a 2 cm e 3 cm distali al ginocchio.
2. Fai un'incisione circonferenziale della pelle distale di 3 cm al ginocchio usando un bisturi.
3. Usa una dissezione contundente e netta per separare la pelle circonferenzialmente dalla muscolatura sottostante finché non si ritrae liberamente.
4. Ripeti questo processo di minamento con i muscoli sottostanti, sezionando con cura fino all'osso preservando i piani tissutali. Segna la tibia/fibula a 1 cm prossimale all'incisione circonferenziale utilizzando un cauterio sterile o un marcatore.
5. Usa piccole forbici ossee per trascinare tibia e perone nel punto indicato. Usa la cauterizzazione per ottenere l'emostasi. Esamina l'estremità ossa per cercare bordi affilati e smussa o rifila secondo necessità.
6. Utilizzando una sutura intrecciata assorbibile 4-0, chiudi insieme i compartimenti muscolari anteriore e posteriore sopra l'osso per creare un cuscinetto muscolare. Inizia suturando il bordo anteriore sopra la tibia, il punto di pressione primario. Tipicamente, si utilizzano 4–6 suture interrotte.
7. Chiudi la pelle lateralmente con suture intrecciate assorbibili 4-0 interrotte, evitando di posizionarle direttamente sul moncone portante. Applica l'adesivo cutaneo lungo la linea dell'incisione.

3. Chirurgia di intervento TMR (Figura 1)

1. Eseguire un'incisione longitudinale gluteale di 1,5–2 cm circa 5 mm a posteriore al femore.
2. Utilizzare la dissezione contusiva per separare i muscoli gluteo e muscolo posteriore della coscia, esponendo il nervo sciatico appena prossimale alla sua triforcazione nei nervi tibiali, peroneali comuni (PC) e surali.
3. Identificare i rami motori prossimali: un ramo grande passa sotto la caudofemorale (CFM), dando origine al ramo CFM, semimembranoso (SM) e bicipite femorale (BF).
4. Solleva il CFM con un cotton fioc e dividilo. Neurolizza attentamente i rami SM e BF con una dissezione contusiva al microscopio chirurgico utilizzando pinze di Dumont fine microchirurgiche.
   1. Usa le pinze per afferrare l'epineurio e, con forbici a molla curve fine, apri l'epineurio e lo dividi longitudinalmente, separando i diversi rami tra loro.
   2. Preservare il ramo CFM e dividere gli altri vicino al tronco sciatico. Il motore curva si dirama inferiormente per facilitare la coaptazione.
5. Neurolizza la triforcazione sciatica aprendo l'epineurio e dividendolo con sottili forbici a molla curbate. Stuzzicare delicatamente i rami nervosi con una pinza fine. Impugnare ciascuno dei tre rami (CP, tibiale, surale) da 5 a 10 mm distali rispetto alla triforcazione usando una pinza.
6. Metti la tensione e trasetta ogni nervo il più distalmente possibile. Afferrando l'estremità distale tagliata, eseguire un taglio pulito fino all'estremità prossimale estinendo almeno 5–10 mm.
7. Eseguire le coaptazioni con sutura 10-0 in nylon: la CP alla SM usando una sola sutura, la tibiale al ramo BF grande usando una o due suture e la sural al ramo BF piccolo usando una sola sutura. Utilizzare almeno 3 nodi per sutura, garantire una posizione senza tensione, evitare di stringere abbastanza da piegare il nervo e disporre le coaptazioni senza angolazioni brusche.

4. Gruppo solo amputazione

1. Legare CP, nervi tibiali e surali usando una sutura di seta 5-0. Maneggia la seta con le pinze di sutura Dumont per legare. Assicurati che la legatura spieghi il nervo e sia fissata con 4 nodi quadrati.
2. Tira delicatamente ogni nervo prossimalmente usando il nodo e trasetta 1–2 mm distale rispetto alla legatura. Rimuovere 10 mm del segmento nervoso distale.
3. Procedere con l'amputazione come dettagliato nella sezione 2.

5. Cure post-operatorie

1. Rimetti il ratto in una gabbia riscaldata fino a quando non cammina. Somministrare una seconda dose di meloxicam (0,2 mL) sottocutaneamente 24 ore dopo.
2. Monitorare quotidianamente per 7 giorni l'integrità della ferita, segni di infezione, dolore o disagio e intervenire secondo le linee guida IACUC.

Risultati

Questo modello di amputazione dell'arto posteriore induceva in modo affidabile comportamenti neuropatici legati al dolore, preservando al contempo la capacità di deambulazione ed esplorazione nei ratti. Come mostrato nella Figura 2, la transezione del nervo periferico durante l'amputazione senza bersaglio distale provoca una crescita assonale disorganizzata e la formazione di neuroma nel sito di legazione, visualizzata tramite immunocolorazione con B-tubulin...

Discussione

Questo protocollo dettaglia i passaggi chirurgici essenziali per garantire la riproducibilità del modello di amputazione dell'arto posteriore e dimostra la preservazione della deambulazione e del coinvolgimento comportamentale nei test post-amputazione. Vengono enfatizzati principi chirurgici chiave, tra cui un'attenta identificazione anatomica, una minima manipolazione dei nervi e la gestione senza tensione dei nervi tranciati, per garantire coerenza e riproducibilità tra i chirurghi. Q...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10-0 nylon microsuture (Arosurgical)	AROSurgical	T04A10N07-13	Sutura per coapazione nervosa fine. Microsutura 10-0.
4-0 polyglycolic acid suture	Ethicon	AQ1268	Sutura di chiusura per muscoli e pelle. Sutura assorbibile 4-0.
5-0 silk surgical suture	Generic	Generic	Sutura per legatura nervosa
Adult Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	Generic	Animale sperimentale
Alcohol prep pads	Dukal Corporation	Generic	Antisettico per la pelle
Betadine 10%	Avrio Health LP	Generic	Antisettico
Bone scissors	FST	16030	Strumento per il taglio delle ossa
Cautery device	FST	18010-00	Dispositivo per l'emostasi
Cotton tip applicator (ProAdvantage)	ProAdvantage	Ref 76100	Manipolazione dei tessuti
Curved microdissector scissors	FST	15019-10	Forbici fini per la neurolisi
Forceps (fine Dumont)	FST	11254-20	Strumento per la manipolazione dei nervi
Forceps (suture tying Dumont)	FST	11063-07	Strumento per la manipolazione delle suture
Gauze USP type VII (Cardinal Health)	Cardinal Health	Ref 2146	Mantiene il campo sterile
Heating pad warmer (TC1000 temperature controller)	Generic	TC1000	Dispositivo di controllo della temperatura
Induction chamber (Braintree Scientific)	Braintree Scientific Inc.	Generic	Per l'induzione dell'anestesia
Isoflurane (Isospire)	Phoenix	Generic	Agente anestetico
Meloxicam (Ostilox)	VetONE	5 mg/mL	Agente analgesico
Ruler	Generic	Generic	Strumento di misurazione per i punti anatomici
Sterile saline	Baxter	0.9 Sodium Lot Y425131	Soluzione per irrigazione
Surgical blade 15	FST	10015-00	Strumento per l'incisione della pelle
Tuberculin syringe	Generic	Generic	Amministrazione di farmaci
Vaporizer (Surgivet model 100)	Surgivet	Model 100 S/N W2211123	Per il mantenimento dell'anestesia
Vetbond tissue adhesive	World Precision Instruments	Generic	Adesivo per la pelle