In vitro Differenziazione delle cellule T CD8 della memoria residente utilizzando il sistema di co-coltura organoide-cellula T epiteliale

Sommario

Per studiare la differenziazione e la funzione in vitro delle cellule T CD8, le cellule T CD8 possono essere isolate dal topo per essere co-colte a lungo termine con organoidi epiteliali vaginali murini infetti preformati. Qui descriviamo questo processo e valutiamo l'acquisizione dei marcatori residenti delle cellule T della memoria durante la co-coltura.

Abstract

I tessuti mucosali barriera svolgono un ruolo importante nella differenziazione e nella funzione delle cellule T residenti. Tra le diverse popolazioni cellulari presenti in questi tessuti, le cellule epiteliali sono motori chiave della differenziazione delle cellule T. Tuttavia, la nostra comprensione dei segnali derivati dall'epitelio che plasmano la biologia delle cellule T negli ambienti mucosali rimane limitata, in gran parte a causa della mancanza di strumenti specifici e della complessità dei sistemi modello disponibili. Qui descriviamo un sistema di co-coltura organoide vaginale vaginale organoide-cellule T CD8 murine che modella le interazioni dinamiche tra epitelio infetto e cellule T CD8 specifiche per virus. Questo protocollo consente l'analisi fenotipica e funzionale delle risposte delle cellule T all'interno di un microambiente epiteliale tridimensionale fisiologicamente rilevante. Utilizzando questo sistema, dimostriamo la differenziazione delle cellule T effettrici CD8 in cellule T della memoria (TRM) residenti nei tessuti. Questo versatile sistema di coltura in vitro offre opportunità riduzioniste per indagare i dettagli molecolari dei segnali epiteliali dietro la differenziazione delle cellule T CD8 che governano l'immunità protettiva e l'immunopatologia negli organi barriera.

Introduzione

Le cellule T della memoria residenti CD8 (TRM) rappresentano una popolazione unica di cellule T CD8 della memoria che vengono mantenute permanentemente nei tessuti periferici senza circolare regolarmente attraverso il sangue e i tessuti linfoidi. Queste cellule TRM sono posizionate strategicamente negli organi barriera, tra cui pelle, polmoni, intestini e tratto riproduttivo, dove agiscono come sentinelle contro patogeni e tumori^{nascenti 1,2}. Al momento della rilevazione del patogeno, le cellule CD8 TRM rilasciano rapidamente granuli citotossici per eliminare direttamente le cellule infette, mentre contemporaneamente secernono citochine infiammatorie che allertano le cellule dei tessuti circostanti e reclutano effettori immunitari circolanti per contenere la diffusione del^{patogeno 3,4}. L'efficacia dei TRM CD8 nell'immunità agli antipatogeni e nell'immunoterapia oncologica è già stata^{dimostrata 5,6}. Di conseguenza, posizionare una quantità abbondante di CD8 TRM funzionalmente funzionali nei tessuti mucosali barriera è un obiettivo cruciale per i vaccini e le strategie immunoterapeutiche.

La formazione e il mantenimento della TRM CD8 negli organi periferici dipendono in modo critico dalla programmazione locale specifica del tessuto. Questi segnali ambientali locali includono citochine uniche derivate dal tessuto e agenti metabolici, oltre a interazioni intercellulari che rafforzano collettivamente l'identità TRM specifica^{del tessuto 7,8,9}. Questa programmazione tissutale permette a TRM di adattarsi alle esigenze specifiche del tessuto nell'esecuzione dei loro compiti di immunosorveglianza. Tuttavia, la nostra comprensione della natura di queste interazioni è incompleta, a causa della mancanza di sistemi modello robusti che catturino fedelmente questi processi. I modelli animali di piccole dimensioni, pur essendo molto informativi, spesso soffrono di una rete di interazioni altamente interconnesse e complesse che ostacolano studi rapidi ad alta produttività.

Qui descriviamo un'alternativa in vitro al modello murino che permetterà di indagare i dettagli molecolari dei segnali derivati dalle cellule epiteliali dietro la differenziazione del TRM CD8. Co-collevando organoidi epiteliali vaginali preformati (VEO) con cellule T CD8 attivate, abbiamo generato in vitro la TRM CD8. Una descrizione dettagliata del processo di attivazione e co-coltura delle cellule T CD8 permetterà un'adozione più ampia di questo processo nei tessuti, portando a una maggiore comprensione delle interazioni cellulari che modellano la memoria delle cellule T CD8 nei tessuti di prima linea.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate e approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali della Brown University (Protocollo numero 22-10-0001).

1. Configurazione e preparazione di base di una piastra di attivazione

1. Un giorno prima di iniziare l'esperimento, preparare una piastra di coltura tissutale non trattata per la semina con cellule T CD8 naïve. Prepara una soluzione di anticorpi attivanti in dPBS sterile a una concentrazione finale di 1 μg/mL per anti-CD3ε (2C11) e 0,167 μg/mL per B7-1 Fc. Per una piastra a 24 pozzi, eroga 600 μL di questa soluzione per pozzo. Incubare tutta la notte a 4 °C fino a quando non è pronto all'uso.
2. Prepara il tampone di arricchimento dei linfociti in dPBS sterile aggiungendo il 2% di FBS scappato con carbone e 1 mM di EDTA al dPBS sterile. Conserva a 4 °C fino a quando non è pronto all'uso.
3. Prepara il tampone di lisi per globuli rossi di ammonio-cloruro-potassio (ACK RBC) in ddH_2Oaggiungendo 10 mM di bicarbonato di potassio, 155 mM di cloruro di ammonio e 0,1 mM di EDTA. Filtra sterilizza e lascia a temperatura ambiente.
4. Prepara la quantità appropriata di substrato per la raccolta in RPMI aggiungendo il 5% di FBS svogliata a carbone. Conserva a 4 °C fino a quando non è pronto all'uso. Per ogni topo da prelevare, si raccomandano 50 mL di substrato per la raccolta.
   NOTA: Penicilina/streptomicina e anfotericina B sono opzionali, ma una concentrazione finale di 100 unità/mL di penicillina, 100 μg/mL di estreptomicina e 0,2 μg/mL di anfotericina B può aiutare a prevenire la contaminazione batterica e fungina della coltura di cellule T durante l'isolamento tissutale se ciò dovesse presentare un problema.
5. Preparare il mezzo delle cellule T in RPMI aggiungendo il 10% di FBS stratificato con carbone, 2 mM di L-glutamina, 100 unità/mL di penicillina, 100 μg/mL di estreptomicina, 1x amminoacidi non essenziali e 1 mM di piruvato di sodio. Per una piastra a 24 pozzi, si utilizzano 2 mL di mezzo a cellule T per pozzo e 50 mL di mezzo a cellule T per una piastra completa. Conserva a 4 °C fino a quando non è pronto all'uso.
6. Prepara strumenti di dissezione (forbici micro-dissezionali da 0,4 mm e pinze micro-dissezionanti fine curve da 0,8 mm) tramite autoclaving in una sacca di sterilizzazione o ammollandoli al 70% di etanolo.

2. Prelievo e dissociazione di organi linfoidi secondari di topo adulto

1. Raffredda rapidamente una centrifuga a 4 °C con adattatori appropriati per contenere tubi conici da 15 mL.
2. Prepara il ghiaccio per il trasporto di tessuti e linfociti durante i periodi di raccolta e incubazione.
3. Prepara un tubo conico sterile da 15 mL con almeno 5 mL di substrato per la raccolta per topo, da dissezionare.
4. Anestetizzare ed eutanasiare un topo transgenico adulto a cellule T CD8 (~8 settimane) secondo il protocollo istituzionale in una cappa a flusso laminare.
5. Fissa gli arti del topo su una superficie pulita in polistirene con aghi di qualsiasi misura e spruzza il busto con etanolo al 70% per evitare che il pelo ostruisca l'incisione e si attacchi agli strumenti.
6. Utilizzando forbici micro-dissezionanti pulite e pinze, realizza un'incisione addominale verticale e separa la pelle dal sottile strato di tessuto connettivo sottostante. Fissa la pelle sulla superficie della schiuma di polistirene usando aghi di qualsiasi dimensione e taglia il tessuto connettivo rimasto per esporre gli organi all'interno del torso.
7. Individuare e rimuovere con attenzione la milza, rimuovendo il grasso in eccesso con le pinze curve, e trasferirla nel tubo conico da 15 mL contenente il materiale di raccolta. Lasciare la milza sul ghiaccio e isolare quanti più linfonodi possibile (ad esempio, iliaco e inguinale) per combinarli con la milza nello stesso tubo conico sul ghiaccio.
   NOTA: I linfonodi iliaci si trovano ai lati della vena cava caudale nella regione inferiore addominale sotto il tratto gastrointestinale, mentre i linfonodi inguinali si trovano vicino alla ramificazione della vena epigastrica superficiale su entrambi i lati della pelle inferiore dell'addome. Isolare più linfonodi per migliorare la resa delle cellule T CD8 dopo l'arricchimento; tuttavia, isolare la sola milza è generalmente sufficiente a fornire diversi milioni di cellule T CD8.
8. Trasferire milza e linfonodi in un vaso segnato da 60 mm e, utilizzando l'estremità piatta di uno stantuffo da 3 mL, dissociare meccanicamente milza e linfonodi macinando il tessuto finché non restano frammenti grandi.
9. Raccogli la sospensione passandola attraverso un filtro sterile a celle da 70 μm in un tubo conico fresco sterile da 15 mL. Lavare la piastra da 60 mm con 5 mL di materiale di raccolta per garantire il trasferimento completo delle celle disaggregate e filtrare nello stesso tubo conico da 15 mL.
10. Centrifuga la sospensione a 584 × g per 5 minuti a 4 °C. Scarta il sovrantato e sposta il tubo facendo passare rapidamente e con forza il fondo attraverso la griglia di un portatubo centrifuga per allentare il pellet.
11. Lisare eritrociti risospendendo il pellet allentato in 2 mL di buffer di lisi ACK RBC. Vortice e incuba a temperatura ambiente per 2 minuti.
12. Dopo 2 minuti, neutralizza il buffer di lisi aggiungendo 2 mL di materiale di raccolta. Aspirare la sospensione usando una pipetta sierologica da 5 mL e filtrare attraverso un filtro sterile da 70 μm nello stesso tubo conico da 15 mL.
    NOTA: Questa filtrazione è importante per garantire la rimozione di tutti gli grumi.
13. Centrifuga la sospensione a 584 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il soprantantante e risospendere il pellet in 950 μL di Lymphocyte Enrichment Buffer.

3. Arricchimento e attivazione delle cellule T CD8

1. Procedere ad arricchire le cellule T CD8 naïf dai linfociti utilizzando un kit di isolamento disponibile in commercio. Segui il protocollo del produttore.
2. Una volta arricchite le cellule T CD8, trasferire la sospensione arricchita in un nuovo tubo conico sterile da 15 mL e riempire il volume fino a 10 mL con un mezzo di raccolta.
3. Contare con un emocitometro.
   NOTA: Da un topo adulto è possibile isolare almeno 5-10 milioni di cellule T CD8 naïve con purezza >95%.
4. Placcare almeno 500.000 celle in 2 mL di mezzo per cellule T per pozzo di una piastra a 24 pozzi. Mescola accuratamente le cellule T prima della placcatura per garantire una sospensione omogenea a singola cellula. Integrare il mezzo delle cellule T con una concentrazione finale di 100 unità/mL di IL-2, 2,5 ng/mL di IL-12 e beta-mercaptoetanolo di 55 μM.
5. Rimuovere la piastra di coltura tissutale precedentemente rivestita di anticorpi dal 4 °C e aspirare con cura la soluzione di rivestimento senza toccare il fondo dei pozzi.
6. Immediatamente placca le cellule T. Incubare a 37 °C con il 5% di_CO2 per 2 giorni.

4. Rimozione dei segnali di attivazione e riposazione delle cellule T CD8 attivate a riposo

1. Osserva i pozzi attivati al microscopio ottico. Dopo 2 giorni di attivazione, si cercano piccoli gruppi di cellule T nei pozzi. Ammassi più grandi indicano una maggiore attivazione. Se non ci sono o pochi cluster, incubare la piastra a 37 °C con il 5% di_CO2 per un altro giorno prima di procedere con il riposo.
2. Prepara il ghiaccio per conservare la sospensione delle cellule T durante i periodi di incubazione e quando non viene utilizzato.
3. Risospendere le cellule T usando una pipetta P1000 pipettando su e giù più volte in ogni angolo del pozzo. Quando le cellule T si sono sollevate, trasferire il contenuto del pozzo in un tubo conico sterile da 50 mL e contare.
   NOTA: Il lavaggio di ogni pozzo con 1 mL di dPBS è opzionale, ma il lavaggio con dPBS in pool con la sospensione a cellule T può aumentare la resa delle cellule T.
4. Riplaccare le cellule T alla stessa concentrazione dello Passo 3.4, 250.000 cellule/mL a 2 mL per pozzo. Prepara la quantità appropriata di mezzo per cellule T integrato con 100 unità/mL di IL-2 e 55 μM beta-mercaptoetanolo.
5. Centrifugare la sospensione a 584 × g per 5 minuti a 4 °C, scartare il surnatant e risospendere il pellet nel volume appropriato di mezzo a cellule T preparato nella fase precedente per il numero di pozzi da placcare. Mescola accuratamente per garantire una sospensione omogenea a singola cella.
6. Lastra 2 mL di sospensione di cellule T (500.000 cellule/pozzo) in una nuova piastra di coltura tissutale non trattata senza rivestimento anticorpale. Incubare a 37 °C con il 5% di_CO2 per 2 giorni.

5. Infettare organoidi epiteliali vaginali murini preformati con un virus

NOTA: Abbiamo utilizzato sia il virus dell'Herpes Simplex-2 (HSV-2) sia il virus della coriomeningite linfocitaria (LCMV) per eseguire infezioni virali degli organoidi. Entrambi sono considerati agenti di Biosicurezza di Livello 2 (BSL-2). Esegui tutte le procedure che coinvolgono agenti infettivi all'interno di un armadietto certificato BSL-2 per la biosicurezza. Pulire le aree di lavoro con il 70% di etanolo sia prima che dopo l'uso, e scartare tutti i materiali secondo le linee guida istituzionali per la biosicurezza. Per questo protocollo, abbiamo stabilito VEO da cellule epiteliali vaginali prelevate dall'epitelio vaginale di topi femmine C57BL/6 come descritto prima^{di 10}.

1. Le placche VEO a una densità di 10.000 cellule in 20 μL di estratto di membrana basale (BME) per pozzo di una piastra a 24 pozzi 7-10 giorni prima dell'infezione.
2. Un giorno prima della co-coltura, si riserva un pozzo di VEO da tripsinizzare e contare per ottenere una molteplicità accurata di infezioni (MOI). Preriscaldare il 0,25% di tripsina-EDTA in un bagno d'acqua a 37 °C per 5 minuti.
   NOTA: 0,25% di tripsina-EDTA non sarà utilizzato durante l'infezione; è necessario solo per dissociare i VO durante i calcoli del MOI. Il rivestimento in plastica (cioè punte di pipetta, tubi conicali) con il 2,5% di BSA in dPBS è opzionale in questa fase, ma può aiutare a ridurre la perdita di organoidi e cellule per un conteggio più accurato.
3. Aspirare il materiale di coltura cellulare dal pozzo designato e lavare con dPBS.
4. Erogare 600 μL di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,25% nel pozzo e risospendere accuratamente con una pipetta P1000 rivestita di BSA per interrompere meccanicamente la BME. Trasferire il contenuto del pozzo in un tubo conico sterile rivestito di BSA da 15 mL.
5. Incubare in un bagno d'acqua a 37 °C per 5 minuti. Dopo 5 minuti, aggiungi 10 mL al 10% di FBS in RPMI per stingere la tripsinizzazione.
6. Centrifuga la sospensione a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il sovrandanante e risospendere utilizzando una punta di pipetta rivestita di BSA in 100-300 μL di mezzo di coltura da cellule T-organoidi o DMEM/F12 semplice.
   NOTA: Il volume dipende dalla dimensione del pellet. Se il pellet è appena visibile, risospendi in un volume inferiore.
7. Contare con un emocitometro. Calcolare la quantità appropriata di virus necessaria per raggiungere 0,1 MOI utilizzando il titolo virale noto e la densità cellulare per ogni pozzo di VEO secondo la seguente equazione:
   
8. Aspirare i mezzi di coltura cellulare dai pozzi VEO da infettare e lavare con 500 μL di dPBS preriscaldato (37 °C). Incubare i pozzi con dPBS per 5 minuti a 37 °C.
9. Dopo 5 minuti, si elimina il dPBS e si aggiungono 500 μL di mezzo organoide per pozzo contenente abbastanza particelle virali per ottenere un MOI di 0,1. Incubare a 37 °C con il 5% di_CO2 per 1 ora con un leggero movimento manuale della piastra di coltura tissutale ogni 20-30 minuti.
10. Dopo l'incubazione di 1 ora, aspirare il mezzo organoide virale e lavare con 500 μL di dPBS preriscaldato (37 °C). Aspirare dPBS e sostituirlo con un nuovo substrato organoide.

6. Co-coltura delle cellule T CD8 con organoidi vaginali vaginali murini preformati infettati da virus

1. Prima della co-coltura (idealmente 4-24 ore prima), trasferire la BME da -80 °C a 4 °C per lo scongelamento. Prevedi la quantità appropriata di BME da scongelare in base al disegno sperimentale di co-coltura: pianificare di laminare 8 μL di BME per pozzo di una piastra da 96 pozzi e 20 μL di BME per pozzo di una piastra a 24 pozzi.
   NOTA: La BME è viscosa e un periodo di scongelamento più lungo a 4 °C ridurrà la viscosità e migliorerà la manovrabilità.
2. Prepara il 2,5% di BSA in dPBS e sterilizza con filtro. Usa questa soluzione BSA per rivestire ogni superficie plastica che entra in contatto con i VEO (cioè punte di pipetta, tubi conici).
   NOTA: Questo rivestimento impedirà ai VEO di aderire alla superficie plastica e perdersi durante la manovrazione.
3. Controlla i VEO al microscopio per vedere dimensioni e salute generale. Conferma che i VEO sono 7-10 giorni dopo la coltura e in media ~100 micron di diametro. I VO sani presentano poche o nessuna singola cellula e presentano una morfologia uniforme e rotonda.
   NOTA: Riplaccare i VEO 1:1 in co-coltura se coltivati in una piastra a 24 pozzi e riplaccare in una piastra a 24 pozzi (cioè, un pozzo di VEO riseminerà un pozzo di co-cultura T-organoide). Se si riimpiaccia una piastra a 96 pozzi da una piastra a 24 pozzi, si riplacca i VEO 1:2 (cioè, un pozzetto di VEO riseminerà due pozzi di co-coltura T-organoide).
4. Posizionare il numero necessario di placche di coltura tissutale sterili a 96 o 24 pozzi da utilizzare per la co-coltura nell'incubatore a 37 °C.
   NOTA: Una piastra riscaldata accelererà l'adesione e la solidificazione della BME.
5. Prepara il mezzo di coltura da cellule T e organoidi in DMEM/F12 aggiungendo integratore di B-27 al 2%, 2 mM di L-glutammina, 100 unità/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 1x amminoacidi non essenziali, 1 mM di piruvato di sodio e 0,2 μg/mL di anfotericina B. Conserva a 4 °C fino alla prontezza dell'uso.
6. Aspirare i mezzi di coltura cellulare dai pozzi VEO e lavare ogni pozzo con 500 μL di dPBS sterile freddo (2-8 °C).
7. Aspirare dPBS e aggiungere 200-500 μL di soluzione fredda per la raccolta organoidi (2-8 °C) (almeno 10 volte il volume della goccia organoide BME). Pipetta su e giù con una pipetta P200 rivestita di BSA per disturbare meccanicamente la BME.
8. Incubare la piastra con un lieve scuotimento (~100 rpm) su uno shaker orbitale a 4 °C per 20 minuti. Se non è disponibile uno shaker orbitale freddo, incuba il piatto sul ghiaccio con una scuotazione manuale ogni 5 minuti. Se la BME non si è depolimerizzata dopo 20 minuti, allunga il tempo di incubazione se necessario.
9. Trasferire il contenuto dei pozzi utilizzando una punta di pipetta rivestita di BSA in un tubo conico sterile rivestito di BSA da 15 mL o 50 mL su ghiaccio. Centrifuga la sospensione a 500 × g per 5 minuti a 4 °C.
10. Scartare il sovrantantante e lavare i VEO con 5-10 mL di dPBS freddo (2-8 °C) (almeno 10 volte il volume delle gocce organoidi combinate della BME). Centrifuga la sospensione a 500 × g per 5 minuti a 4 °C.
11. Scartare il dPBS e risospendere il pellet in 1 mL di mezzo di coltura da cellule T-organoidi utilizzando una punta di pipetta P1000 rivestita con BSA. Lasciare la sospensione VEO sul ghiaccio finché le cellule T non sono pronte per la co-coltura.
12. Inizia a raccogliere le cellule T per la co-coltura. Controlla le cellule T a riposo al microscopio per vedere dimensioni e salute generale. Senza segnali attivanti, le cellule T rallenteranno la loro proliferazione ma dovrebbero comunque aver formato alcuni gruppi. Confermare che non ci sono detriti cellulari o frammenti e che le cellule T abbiano una morfologia ingrandita. Sospendere le cellule T utilizzando una pipetta P1000 pipettando su e giù più volte in ogni angolo del pozzo e contando il numero totale di cellule T Live CD8.
    NOTA: Per pozzo di una piastra a 96 pozzi, seminare 100.000 cellule T per ogni co-coltura in 8 μL di BME. Per pozzo di una piastra a 24 pozzi, si seminano 200.000 cellule T per ogni co-coltura in 20 μL di BME.
13. Centrifuga la sospensione a 584 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il soprantantante e risospendere il pellet in 10 mL di mezzo di coltura per cellule T-organoidi. Combinare le cellule T con i VEO trasferendo un numero appropriato di cellule T affinché i pozzi vengano impiegati nel tubo conico contenente i VEO.
14. Centrifuga a 584 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il sovrantante e risospendere VEO e cellule T nella quantità appropriata di BME. Mescola accuratamente utilizzando una punta di pipetta rivestita con BSA, e piastra su piastra di coltura tissutale preriscaldata, 20 μL per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti o 8 μL per pozzo di una piastra da 96 pozzi.
    NOTA: Tieni il BME sul ghiaccio o in un blocco di raffreddamento a 4 °C durante la placcatura. Mettere le punte delle pipette nel frigorifero a 4 °C per 30 minuti prima della piattinatura può aiutare a prevenire la solidificazione prematura della BME.
15. Posiziona la piastra capovolta nell'incubatore a 37 °C e attendi 30 minuti per l'adesione completa e la solidificazione della BME.
16. Durante questo periodo di incubazione, si prepara l'intero mezzo di coltura da cellule T-organoide aggiungendo 100 ng/mL di EGF murino, 55 μM beta-mercaptoetanolo e 10 unità/mL di IL-2 murino al mezzo di coltura prefabbricato per cellule T-organoidi.
17. Dopo il periodo di incubazione, aggiungere con attenzione 500 μL di mezzo di coltura completo da cellule T e organoidi per pozzo di una piastra da 24 pozzi oppure 250 μL di mezzo di coltura integrale da cellule T e organoidi per ogni pozzo di una piastra da 96 pozzi. Distribuire il materiale contro i lati del pozzo per evitare di disturbare la goccia BME. Cambia il supporto ogni 2 giorni fino a quando non viene raccolto per l'analisi.

7. Raccolta di cellule T CD8 co-colture per l'analisi della citometria di flusso

1. Una volta che le co-colture raggiungono almeno il giorno 7 in coltura, raccoglie per l'analisi. Se le cellule T non esprimono marcatori simili a TRM in co-coltura entro il giorno 7, ottimizzare la data di prelievo tra il giorno 7 e il 14, a seconda dell'acquisizione fenotipica e della vitalità delle cellule VEO e T.
2. Prepara il tampone di selezione cellulare attivata fluorescente (FACS) per la colorazione e l'analisi della citometria a flusso aggiungendo albumina sierica bovina dello 0,2% w/v e 0,1% w/v azide di sodio al dPBS.
   NOTA: L'azide di sodio è una sostanza chimica acutamente tossica. Segui le raccomandazioni istituzionali nella gestione e nello smaltimento di tutti i rifiuti in conformità con le normative istituzionali sulla biosicurezza.
3. Prepara un cocktail di anticorpi fluorescenti in FACS buffer per la colorazione superficiale, a seconda dei marcatori desiderati per l'analisi. Per ogni pozzo, si prevede almeno 50 μL di cocktail di anticorpi.
4. Prepara un colorante di vitalità fluorescente in dPBS. Per ogni pozzo, si prevede almeno 50 μL di colorante di vitalità.
5. Rimuovere con cura il materiale in ogni pozzo e risospendere accuratamente in un buffer FACS freddo (2-8 °C), pipettando su e giù 10-20 volte per disturbare meccanicamente la BME. Trasferire il contenuto di ogni pozzo su una piastra a fondo arrotondato da 96 pozzi etichettata.
6. Centrifugare a 859 × g per 2 minuti a 4 °C. Abbassare la rampa di decelerazione per tutti i passaggi di centrifugazione in poi per evitare la perdita di campione dovuta al remix dei pellet.
7. Rimuovere il soprandanante invertendo la piastra ed espellendo il liquido con un unico movimento deciso verso il basso. Sospendere in 50 μL di cocktail di anticorpi. Pipetta su e giù almeno 5 volte usando una pipetta multicanale per garantire una risospensione completa del pellet cellulare.
8. Incubare per 30 minuti a 4 °C o a temperatura ambiente secondo necessità, protetto dalla luce. Al termine del periodo di incubazione, aggiungere 150 μL di dPBS a ciascun pozzo utilizzando una pipetta multicanale e una centrifuga a 859 × g per 2 minuti a 4 °C.
9. Fai decantare il soprandanzante girando la piastra sottosopra e facendola girare verso il basso una volta in un movimento continuo. Sospendere con 50 μL di colorante di vitalità. Pipetta su e giù almeno 5 volte usando una pipetta multicanale per garantire una risospensione completa del pellet cellulare.
10. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, protetto dalla luce. Al termine del periodo di incubazione, aggiungere 150 μL di tampone FACS a ciascun pozzo utilizzando una pipetta multicanale e una centrifuga a 859 × g per 2 minuti a 4 °C.
11. Decantare il sovrantantante come prima, e risospendere in 150 μL di buffer FACS se i campioni verranno eseguiti immediatamente su un citometro a flusso oppure fissare 150 μL di paraformaldeide allo 0,5% e lasciarlo a 4 °C. Pipetta su e giù almeno 5 volte usando una pipetta multicanale per garantire una risospensione completa del pellet cellulare. Filtrare i campioni fissi per evitare l'ostruzione dello strumento e far funzionare su un citometro a flusso entro 12-36 ore per evitare la perdita di fluorescenza.
    NOTA: Il paraformaldeide è considerato una sostanza chimica pericolosa. Rispetta le normative istituzionali sulla biosicurezza nella gestione e nello smaltimento.

Risultati

Visualizzazione microscopica della co-coltura organoide infetta da cellule T CD8
I VEO murini preformati sono stati infettati da LCMV e co-colti con cellule T CD8 specifiche per LCMV. Abbiamo anche eseguito queste co-colture con il modello di infezione da HSV-2 per stabilire la versatilità del protocollo, ma stiamo mostrando dati microscopici per il modello LCMV e abbiamo incluso i dati di differenziazione delle cellule T nel modello HSV-2 qui sotto. Il LCMV esprime p...

Discussione

I TRM CD8 si basano su segnali ambientali locali per differenziazione e manutenzione. Questi segnali instaurano una programmazione specifica per i tessuti che permette ai TRM CD8 di adattarsi all'ambiente circostante e di svolgere i loro compiti di immunosorveglianza secondo necessità. Purtroppo, i TRM non sono sopravvissuti in vitro una volta estratti dal tessuto, e questo ha limitato la loro analisi^{dettagliata 12,13}. I...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione Acquosa al 16% di Paraformaldeide	Scienze della microscopia elettronica	15710-S
Piastre di coltura Tissuce a pozzetti multipli non trattate a 24 pozzi di polistirene	VWR International	10861-558
2-Mercaptoetanolo	Gibco	21985023
Siringhe sterili da 3 mL	Fisher Scientific	14-955-457
5 mL,   Snap Cap,   Provette sterili con fondo rotondo in polistirene	Falcon	352058
Piastre di Petri da 60 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
70 & mu; Filtri cellulari sterili	Fisher Scientific	22-363-548
Micropiastre a fondo rotondo in polistirene non trattato a 96 pozzi	Greiner Bio-One	650101
Piastre di coltura tissutale a pozzetti multipli non trattate a 96 pozzi di polistirene	VWR International	10861-562
Albumina bovina/frazione V	Chimici Termoscientifici	J6465518
Cloruro di ammonio	Fisher Scientific	A661-500
Anfotericina B	Sigma-Aldrich	A9528-100MG
Supplemento B-27	Gibco	17504044
ioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader
DMEM/F12 1:1 Media	Cytiva	SH30271. FS
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 1x	Corning	21031CV
Etilediaminamina, Acido Tetraacetico (Soluzione 0,5 M/pH 8,0)	Fisher Scientific	BP2482-500
Forbici micro-dissezionali extra fini	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Siero fetale bovino - Trattato con carbone/dextrano	R& Sistemi D	S11650
Software Flowjo v10	Becton, Dickinson and Company	FlowJo (RRID:SCR_008520)
Pinza Graefe	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
Soluzione HEPES	Cytiva	SH30237.01
L-Glutamina (200 mM)	Gibco	A2916801
Magnete 5mL	Biolegend	480019
Mouse CD8 Naï Kit di isolamento a cellule T ve	Biolegend	480044
Proteina ricombinante EGF del topo	Gibco	315091MG
Soluzione di amminoacidi non essenziali (100 volte)	Gibco	11140050
Soluzione di penicillina-streptomicina	Cytiva	SV30010
Bicarbonato di potassio	MP Biomedici	0215255780
CD3 e epsilon purificato anti-topo; Anticorpi	Biolegend	100360
Mouse ricombinante B7.1 (CD80)-Fc Chimera (senza carrier)	Biolegend	555406
Mouse ricombinante IL-12 (p70) (senza portanti)	Biolegend	577004
Mouse ricombinante IL-2 (senza carrier)	Biolegend	575406
Estratto di membrana basale a fattore di crescita ridotto	R& Sistemi D	BME001-10
RPMI 1640 Media	Cytiva	SH30027.LS
Azida di sodio	Fisher Scientific	S227I-25
Piruvato di sodio (100 mM)	Gibco	11360070
Tripsina 0,25% proteasi con tripsina suina	Cytiva	SH30042.02
Colorante di Vitalità (Rosso 780)	Cytek Biosciences	13-0865-T100