L&#39;asse Mettl3/Nrf2 sopprime la progressione della malattia di Parkinson inibendo la piroptosi indotta da NLRP3 nei neuroni della serotonina

Hui Wang; Pengcun Li; Chen Liu

doi:10.3791/69124

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

L'asse Mettl3/Nrf2 sopprime la progressione della malattia di Parkinson inibendo la piroptosi indotta da NLRP3 nei neuroni della serotonina

596 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/69124

⸱

7 novembre 2025

Hui Wang¹ , Pengcun Li¹ , Chen Liu²

¹Department of Neurosurgery, Feicheng People's Hospital, ²Department of Neurology, Yantai Yantaishan Hospital

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per studiare come Mettl3 regola Nrf2 tramite la modifica di m6A, sopprimendo così la piroptosi microgliale e salvaguardando i neuroni della serotonina nei modelli di malattia di Parkinson, con applicazioni nella ricerca sulla neuroinfiammazione epitrascrittomica.

Abstract

I meccanismi precisi alla base della patogenesi della malattia di Parkinson (PD) rimangono incompleti e non sono ancora stati compresi, in particolare per quanto riguarda il ruolo dell'infiammazione microgliale e la sopravvivenza dei neuroni della serotonina. Questo protocollo delinea un quadro completo per chiarire come la metiltransferasi-simile 3 (Mettl3) modula il fattore nucleare eritroide-correlato 2 (Nrf2) attraverso la modifica N6-metiladenosina (m6A), attenuando così la piroptosi microgliale e preservando i neuroni della serotonina sia in vitro che in vivo . L'obiettivo principale è quello di fornire ai ricercatori metodologie riproducibili per la dissezione della regolazione epitrascrittomica delle vie neuroinfiammatorie, a partire dall'attivazione microgliale indotta da lipopolisaccaridi (LPS) nelle cellule BV2 per simulare le cascate infiammatorie, seguita dalla PCR quantitativa di immunoprecipitazione dell'RNA metilato (MeRIP-qPCR) per l'analisi m6A. In vivo, descriviamo in dettaglio la creazione di un modello murino di PD indotto da MPTP, integrato dalla somministrazione stereotassica di vettori adeno-associati del virus sierotipo 9 (AAV9) per la modulazione mirata di Nrf2 nello striato. Le valutazioni comportamentali comprendono il posizionamento degli arti anteriori, l'accelerazione del rotarod e i test in campo aperto per quantificare i deficit motori, mentre i saggi molecolari includono il Western blotting per i marcatori della piroptosi (ad esempio, NLRP3, cleaved-caspase-1), il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per le citochine e la colorazione con diidroetidio (DHE) per il rilevamento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) nei neuroni della serotonina. Tecniche avanzate di microscopia, come l'immunoistochimica per Iba1 e TPH2, consentono la visualizzazione della dinamica microgliale e dell'integrità serotoninergica. I risultati confermano che il deficit di Mettl3 aggrava la sottoregolazione di Nrf2, l'iperattivazione dell'inflammasoma NLRP3, la morte cellulare piroptotica e la conseguente degenerazione dei neuroni della serotonina. Questo metodo non solo fornisce una robusta impalcatura sperimentale per sondare la neuroprotezione mediata da m6A, ma evidenzia anche potenziali vie terapeutiche per mitigare la progressione del PD attraverso la modulazione mirata dell'asse Mettl3/Nrf2 in contesti neurodegenerativi.

Introduzione

La malattia di Parkinson (PD) è la seconda malattia neurodegenerativa più diffusa tra gli anziani, colpendo circa il 2-3% degli individui di età pari o superiore a 65 anni, il che rappresenta un onere significativo sia per le famiglie che per la^società1. Sebbene i meccanismi precisi alla base del PD rimangano parzialmente compresi, l'accumulo di prove indica una connessione tra lo sviluppo del PD e le sfide nella trasmissione neuronale, insieme alla neuroinfiammazione guidata dalle cellule microgliali, che è un tratto comune osservato nell'invecchiamento del cervello e in varie malattie neurodegenerative, tra c....