L'asse Mettl3/Nrf2 sopprime la progressione della malattia di Parkinson inibendo la piroptosi indotta da NLRP3 nei neuroni della serotonina

La malattia di Parkinson (PD) è la seconda malattia neurodegenerativa più diffusa tra gli anziani, colpendo circa il 2-3% degli individui di età pari o superiore a 65 anni, il che rappresenta un onere significativo sia per le famiglie che per la^società1. Sebbene i meccanismi precisi alla base del PD rimangano parzialmente compresi, l'accumulo di prove indica una connessione tra lo sviluppo del PD e le sfide nella trasmissione neuronale, insieme alla neuroinfiammazione guidata dalle cellule microgliali, che è un tratto comune osservato nell'invecchiamento del cervello e in varie malattie neurodegenerative, tra cui il PD 2,3,4,5 . Le microglia fungono da cellule immunitarie innate all'interno del sistema nervoso centrale (SNC) e sono vitali per sostenere l'omeostasi cerebrale⁶. Tuttavia, l'iperattivazione persistente di queste microglia può innescare risposte neuroinfiammatorie croniche, contribuendo in ultima analisi alla progressione della malattia neurodegenerativa.

Sia i processi infiammatori centrali che quelli periferici influenzano significativamente la patologia della PD ^7,8. L'attivazione delle cellule microgliali provoca risposte infiammatorie che influiscono sulla sopravvivenza neuronale⁹, con prove emergenti che evidenziano il suo innesco da parte delle ubiquitina^{ligasi 10}. Tra le varie vie infiammatorie, l'attivazione dell'inflammasoma della proteina 3 contenente il dominio NOD, LRR e pirina (NLRP3) contribuisce principalmente alla regolazione infiammatoria microgliale¹¹. L'attivazione porta all'espressione di NLRP3 e al successivo assemblaggio del complesso dell'inflammasoma composto dalla proteina adattatrice del dominio di attivazione e reclutamento della caspasi (CARD) e dalla pro-caspasi-1, che culmina nella scissione della proteina e nel rilascio di citochine¹². Un'elevata attivazione di NLRP3 è stata osservata nei pazienti con PD e in vari modelli animali della malattia, con conseguente morte neuronale. In particolare, l'inibizione di NLRP3 ha dimostrato effetti protettivi contro la patologia del PD in modelli murini, sottolineando il ruolo cruciale dell'inflammasoma NLRP3 nell'insorgenza del PD^13,14.

La segnalazione della serotonina (5-HT) è un meccanismo significativo di regolazione neurale, che influenza numerosi comportamenti e funzioni fisiologiche attraverso interazioni con almeno 14 sottotipi di recettori postsinaptici^15,16, inclusi i ruoli nella patologia del SNC come dettagliato in panoramiche complete¹⁷. L'ampia influenza neuromodulatoria del sistema 5-HT è governata da circa 26.000 neuroni nel cervello del roditore¹⁸. Mentre una notevole letteratura associa la PD prevalentemente alla perdita di neuroni dopaminergici, la relazione tra i neuroni 5-HT e la PD è meno esaminata.

La modificazione della N6-metiladenosina (m6A), la modificazione dell'mRNA più diffusa nelle cellule eucariotiche, è fondamentale per regolare lo splicing, la stabilità e l'esportazione dell'mRNA, influenzando così varie attività cellulari¹⁹. I livelli di m6A sono modulati dalle metiltransferasi e dalle demetilasi. Elevate modificazioni di m6A nel cervello sono state collegate al neurosviluppo, con la sua disregolazione strettamente legata a condizioni neurodegenerative^20,21, inclusa l'alterata espressione di METTL3 nei modelli di Alzheimer²². Ad esempio, l'accumulo di metiltransferasi-simile 3 (METTL3) nella frazione insolubile dei tessuti cerebrali post-mortem dei pazienti di Alzheimer è stato correlato positivamente con i livelli di proteina Tau^{insolubile 23}. Inoltre, una diminuzione significativa dei livelli di m6A nello striato può portare a un calo sostanziale dei livelli di neurotrasmettitori dopamina²⁴. In particolare, dodici polimorfismi a singolo nucleotide correlati a m6A hanno mostrato associazioni significative con la suscettibilità alla PD²⁵. Questo protocollo stabilisce metodologie complete per studiare come le modificazioni m6A mediate da METTL3 regolano la piroptosi microgliale attraverso l'asse Nrf2/NLRP3, influenzando in ultima analisi la sopravvivenza dei neuroni della serotonina nei modelli PD. Il modello acuto MPTP in vivo e il modello LPS in vitro sono stati selezionati per la loro robusta induzione di risposte neuroinfiammatorie, sebbene i paradigmi cronici potrebbero integrare studi futuri come discusso di seguito.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti sotto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Ospedale del popolo di Feicheng (numero di approvazione IACUC-2024-118) ed eseguiti in stretta conformità con le linee guida istituzionali e i principi etici stabiliti per la ricerca sugli animali da laboratorio. I protocolli di studio hanno garantito la cura e il trattamento umano di tutti gli animali, con particolare enfasi sulla riduzione al minimo della sofferenza e dell'angoscia, aderendo sia agli standard istituzionali che alle linee guida ARRIVE per pratiche di ricerca animale responsabili.

1. Coltura cellulare e modello di attivazione microgliale

1. Preparazione e manutenzione delle celle BV2
   1. Scongelare rapidamente le parti di cellule microgliali BV2 congelate in un bagno d'acqua a 37 °C per 2 minuti, garantendo un leggero vortice per evitare shock termici.
   2. Centrifugare la sospensione cellulare scongelata a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) per rimuovere il crioprotettore.
   3. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno DMEM completo ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% di FBS, l'1% di penicillina-streptomicina e 2 mM di L-glutammina.
   4. Eseguire la valutazione della vitalità cellulare utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano (miscelare 10 μL di sospensione cellulare con 10 μL di blu di tripano allo 0,4%, contare utilizzando l'emocitometro), garantendo la vitalità del >95% prima di procedere.
   5. Piastre le cellule in fiasche di coltura T75 a una densità di 1 × 10⁶ cellule per fiaschetta e mantenute in un incubatore di coltura cellulare umidificato a 37°C con il 5% di CO₂.
   6. Celle di passaggio ogni 48 ore quando si raggiunge l'80-85% di confluenza utilizzando le procedure standard di tripsinizzazione.
      NOTA Mantenere un numero costante di passaggi (passaggi 3-8) per garantire risposte infiammatorie riproducibili. Tutti gli esperimenti di coltura cellulare sono stati ripetuti in modo indipendente almeno tre volte, con tre repliche tecniche per condizione per ridurre al minimo la variabilità.
2. Attivazione microgliale indotta da LPS
   1. Seminare le cellule BV2 in piastre a 6 pozzetti a 2 × 10⁵ cellule per pozzetto in 2 mL di terreno completo 24 ore prima del trattamento.
   2. Preparare la soluzione madre di LPS a 1 mg/mL in PBS sterile, sterilizzare con filtro attraverso un filtro da 0,22 μm e conservare in aliquote monouso a -20 °C.
   3. Convalidare l'attività di LPS utilizzando il saggio Limulus Amebocyte Lysate (LAL) per confermare la concentrazione di endotossine prima di ogni esperimento²⁶.
   4. Diluire il brodo LPS a una concentrazione di lavoro di 1 μg/mL in DMEM privo di siero immediatamente prima dell'uso.
   5. Rimuovere il terreno di coltura dai pozzetti e lavare le cellule due volte con PBS sterile.
   6. Aggiungere 2 mL di terreno contenente LPS (1 μg/mL di concentrazione finale) ai pozzetti di trattamento e DMEM privo di siero per controllare i pozzetti.
   7. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C con il 5% di CO₂ per l'attivazione infiammatoria.
   8. Includere pozzetti di controllo positivi trattati con 100 ng/mL di fattore di necrosi tumorale (TNF)-α e pozzetti di controllo negativo con solo veicolo (PBS) per convalidare la risposta infiammatoria.
      NOTA: Preparare una soluzione di LPS fresca per ogni esperimento per mantenere una bioattività costante. Se la risposta infiammatoria è debole (ad esempio, aumento di <2 volte delle citochine), controllare la stabilità del reagente o estendere l'incubazione a 48 ore.
3. Sovraespressione e knockdown di Mettl3
   1. Progettare e sintetizzare piccole sequenze di RNA interferenti (siRNA) che hanno come bersaglio Mettl3 e sequenze di controllo criptate utilizzando protocolli standard di sintesi di oligonucleotidi. Selezionare sequenze target dalla regione codificante dell'mRNA di Mettl3 (accesso GenBank: NM_019721) con una lunghezza di 19-21 nucleotidi, garantendo un contenuto di GC del 40-60%²⁷.
   2. Convalidare le sequenze di siRNA utilizzando l'analisi BLAST per confermare la specificità ed evitare effetti off-target (garantire <70% di omologia con geni non bersaglio).
   3. Preparare vettori di sovraespressione contenenti cDNA Mettl3 a lunghezza intera clonato nel vettore pcDNA3.1 utilizzando i siti di restrizione EcoRI e XhoI.
   4. Trasfettare le cellule al 70-80% di confluenza utilizzando un reagente cationico di trasfezione lipidica:
      1. Miscelare 2 μL di reagente di trasfezione lipidica cationica con 50 pmol di siRNA o 2 μg di DNA plasmidico in 100 μL di terreno Opti-MEM.
      2. Incubare la miscela per 15 minuti a RT.
      3. Aggiungere il complesso di trasfezione goccia a goccia alle cellule e incubare per 4-6 ore prima di passare al terreno completo fresco.
   5. Incubare le cellule trasfettate per 48 ore prima del trattamento con LPS per consentire adeguati cambiamenti nell'espressione proteica.
   6. Confermare l'efficienza della trasfezione utilizzando la co-trasfezione con reporter fluorescente (100 ng di pEGFP-C1 per pozzetto), con l'obiettivo di raggiungere un'efficienza del >70% mediante microscopia a fluorescenza prima di procedere.

2. Sviluppo di modelli animali e progettazione sperimentale

1. Preparazione e randomizzazione degli animali
   1. Ottieni topi C57BL/6J dal Vital River Laboratory, garantendo un rapporto maschio-femmina uguale, di età pari a 8 settimane, con un peso di 19-26 g.
   2. Animali d'appartamento in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (SPF) con ciclo luce-buio 12:12 ore, temperatura controllata (22 ± 2°C) e umidità (50-60%).
   3. Consentire un periodo di acclimatazione di 7 giorni con accesso ad libitum al cibo e all'acqua standard.
   4. Eseguire valutazioni comportamentali di base durante l'acclimatazione: condurre valutazioni comportamentali complete, tra cui test di posizionamento degli arti anteriori (10 prove per lato), valutazione del rotarod accelerato (4-40 giri/min in 5 minuti) e analisi dell'attività locomotoria in campo aperto (sessioni di 10 minuti in un apparecchio da 50 cm × 50 cm × 50 cm)28,29,30.
   5. Assegna in modo casuale gli animali ai gruppi sperimentali (n = 6 per gruppo) utilizzando la randomizzazione computerizzata per ridurre al minimo i pregiudizi: sham, Model, Model+Nrf2-KD, Model+oe-Nrf2.
   6. Implementare un disegno sperimentale in cieco in cui i ricercatori che eseguono valutazioni comportamentali non sono a conoscenza delle assegnazioni di gruppo.
2. Modello di malattia di Parkinson indotta da 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP)
   1. Preparare la soluzione di MPTP a 30 mg/kg in soluzione fisiologica sterile immediatamente prima dell'iniezione sciogliendo 15 mg di MPTP cloridrato in 5 mL di soluzione fisiologica sterile e regolando il volume in base al peso dell'animale.
      ATTENZIONE: L'MPTP è altamente neurotossico. Maneggiare in una cappa chimica con adeguati dispositivi di protezione individuale, inclusi doppi guanti e camice da laboratorio.
   2. Somministrare MPTP tramite iniezione intraperitoneale a 30 mg/kg di peso corporeo (volume di iniezione 10 ml/kg) per tre giorni consecutivi alla stessa ora ogni giorno (09:00 ± 30 min).
   3. Iniettare negli animali del gruppo fittizio volumi equivalenti di soluzione fisiologica sterile seguendo un programma di iniezione identico.
   4. Monitorare quotidianamente gli animali per segni di sofferenza, perdita di peso (>15% considerato endpoint) o reazioni avverse durante il periodo di somministrazione dell'MPTP utilizzando fogli di punteggio standardizzati.
   5. Mantenere gli animali per 8 giorni dopo l'iniezione finale per consentire lo sviluppo della neurodegenerazione.
      NOTA: Gli animali possono essere alloggiati normalmente durante questo periodo con un monitoraggio continuo.
3. Iniezione virale stereotassica
   1. Preparare vettori virali AAV9 mediante tripla trasfezione di cellule HEK293T utilizzando polietilenimmina (PEI; rapporto DNA:PEI 1:3), raccogliere a 72 ore dopo la trasfezione, purificare utilizzando l'ultracentrifugazione a gradiente di iodixanolo (177.000 × g per 2 ore) e concentrare utilizzando dispositivi di filtro centrifugo per ottenere 1 × 10¹² copie del genoma/mL.
   2. Convalida del titolo virale tramite la reazione a catena della polimerasi quantitativa (PCR) utilizzando primer mirati alle regioni ITR, garantendo che i titoli raggiungano 1 × 10¹² copie del genoma/mL con analisi della curva standard.
   3. Convalida del titolo virale utilizzando la PCR quantitativa basata su SYBR Green con primer specifici per ITR, eseguendo diluizioni seriali di standard noti e calcolando le copie del genoma utilizzando l'analisi della curva standard. Confermare l'assenza di contaminazione virale competente per la replicazione utilizzando p24 ELISA.
   4. Anestetizzare i topi con isoflurano (3% di induzione, 1,5-2% di mantenimento) somministrato a 0,8-1,0 L/min di portata di ossigeno attraverso un cono nasale, monitorando la frequenza respiratoria (60-100 respiri/min) e il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi durante tutta la procedura. Fissare il mouse nella cornice stereotassica e applicare un unguento oftalmico per prevenire l'essiccazione della cornea.
   5. Fissare il mouse nella cornice stereotassica e applicare un unguento oftalmico per prevenire l'essiccazione della cornea.
   6. Praticare un'incisione del cuoio capelluto sulla linea mediana di 1,5 cm utilizzando una lama di bisturi sterile e identificare il punto di riferimento della bregma utilizzando coordinate stereotassiche con una precisione di 0,1 mm.
   7. Calcola le coordinate di iniezione per lo striato: anteriore-posteriore -0,5 mm, mediale-laterale ±2,0 mm, dorsale-ventrale -3,0 mm da bregma.
   8. Eseguire iniezioni pilota con tracciante fluorescente (ad es. proteina fluorescente verde [GFP]) per convalidare l'accuratezza del targeting, confermando la co-localizzazione dell'>80% con marcatori microgliali (Iba1) tramite immunoistochimica prima delle iniezioni sperimentali.
   9. Abbassare l'ago di iniezione (33-G) per raggiungere la profondità a una velocità di 1 mm/min e iniettare 2 μl di sospensione virale a 0,2 μl/min utilizzando una micropompa a siringa con un controller automatizzato. Abbassare l'ago per iniezione alla profondità target e iniettare 2 μL di sospensione virale a una velocità di 0,2 μL/min utilizzando una microsiringa.
   10. Mantenere la posizione dell'ago per 5 minuti dopo l'iniezione per evitare il riflusso.
   11. Estrarre lentamente l'ago a una velocità di 0,5 mm/min, chiudere l'incisione con suture di seta 4-0 utilizzando uno schema interrotto e consentire il recupero dall'anestesia su un tampone di recupero riscaldato.
   12. Somministrare analgesia post-operatoria (carprofene 5 mg/kg per via sottocutanea una volta al giorno per 3 giorni) e monitorare il recupero per 24 ore con schede di osservazione dettagliate.

3. Tecniche di biologia molecolare e validazione

1. Estrazione dell'RNA e controllo di qualità
   1. Raccogliere cellule o campioni di tessuto cerebrale striatale immediatamente dopo gli endpoint sperimentali mediante eutanasia umana degli animali tramite inalazione di CO₂ seguita da lussazione cervicale; sezionare il tessuto su ghiaccio, tritare finemente e dissociare enzimaticamente con tripsina allo 0,25% per 10 minuti a 37 °C se si raccolgono le cellule.
   2. Estrarre l'RNA totale utilizzando il reagente TRIzol (1 mL per 1, 10,⁶ cellule o 100 mg di tessuto) con omogeneizzazione meccanica (20-25 colpi in un omogeneizzatore dounce) e separazione di fase del cloroformio (0,2 mL di cloroformio per 1 mL di TRIzol).
   3. Valutare la qualità dell'RNA utilizzando la spettrofotometria (rapporto A260/A280 1,8-2,0) e l'elettroforesi su gel (agarosio all'1%) per confermare le bande ribosomiali 28S e 18S.
   4. Quantificare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro.
   5. Conservare i campioni di RNA a -80 °C in acqua priva di nucleasi a -80 °C con l'aggiunta di un inibitore della RNasi (40 unità/μL) fino all'analisi.
2. Frazionamento citoplasmatico nucleare
   1. Prelevare le celle (minimo 2 × 10⁶ ) e lavare due volte con PBS ghiacciato (5 ml per lavaggio, 5 minuti di centrifugazione a 300 × g).
   2. Utilizzare un kit di frazionamento cellulare commerciale con il seguente protocollo.
      1. Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone di estrazione citoplasmatica con inibitori della proteasi.
      2. Incubare su ghiaccio per 10 minuti con vortice ogni 3 minuti.
      3. Centrifugare a 16.000 × g per 5 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante (frazione citoplasmatica).
      4. Lavare il pellet due volte con un tampone di estrazione citoplasmatica.
      5. Risospendere il pellet in 100 μl di tampone di estrazione nucleare.
      6. Incubare su ghiaccio per 40 minuti con vortice ogni 10 minuti.
      7. Centrifugare a 16.000 × g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante (frazione nucleare)
   3. Convalida l'efficienza del frazionamento analizzando la distribuzione dei marcatori nucleari (U6) e dei marcatori citoplasmatici (GAPDH) utilizzando il Western blot.
   4. Estrarre separatamente l'RNA dalle frazioni nucleari e citoplasmatiche.
   5. Analizza i livelli di mRNA di Nrf2 in ciascuna frazione utilizzando la RT-qPCR con geni di riferimento specifici per frazione.
3. PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)
   1. Sintetizzare il cDNA da 1 μg di RNA totale utilizzando un kit di reagenti a trascrizione inversa con primer casuali.
   2. Esecuzione della qPCR utilizzando il kit Premix Ex Taq II con primer specifici per i geni su un sistema di PCR in tempo reale.
   3. Convalida la specificità del primer utilizzando l'analisi della curva di fusione e conferma un singolo amplicone mediante elettroforesi su gel.
   4. Utilizzare le seguenti condizioni di ciclo termico: denaturazione iniziale a 95 °C per 10 minuti, seguita da 40 cicli di 95 °C per 15 s, 60 °C per 30 s e 72 °C per 30 s.
   5. Calcola i livelli di espressione relativi dell'mRNA utilizzando il metodo ^2-ΔΔCt con β-actina come riferimento interno.
   6. Includere controlli senza modello e convalidare la stabilità del gene di riferimento in condizioni sperimentali utilizzando l'analisi geNorm (valore di stabilità M < 0,5).
      NOTA: Punteggi di riproducibilità: coefficiente di variazione (CV) intra-saggio <10% in tre esecuzioni indipendenti.
4. MeRIP-qPCR per l'analisi delle modifiche m6A
   1. Estrarre l'RNA totale (minimo 20 μg) e frammentarlo in 100-200 nucleotidi utilizzando il reagente di frammentazione dell'RNA (10 mM ZnCl₂, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0) a 70 °C per 5 min.
   2. Eseguire l'immunoprecipitazione utilizzando l'anticorpo specifico m6A (2 μg per 20 μg di RNA) durante la notte a 4 °C con rotazione (10 giri/min) nel tampone di immunoprecipitazione (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl, 0,5% NP-40).
   3. Convalidare la specificità degli anticorpi utilizzando controlli noti dell'RNA modificato e non modificato di m6A.
   4. Lavare i complessi immunoprecipitati cinque volte con il tampone di lavaggio.
   5. Eluire l'RNA legato e trascrivere inversamente utilizzando primer casuali.
   6. La trascrizione inversa dell'RNA eluito utilizzando primer casuali ed esecuzione di analisi qPCR utilizzando primer specifici per Nrf2 che coprono potenziali siti m6A.
   7. Eseguire l'analisi qPCR utilizzando primer specifici per Nrf2 e calcolare l'arricchimento relativo all'RNA in ingresso.
      NOTA: Se il rilevamento è incoerente, ottimizzare il tempo di frammentazione (4-6 minuti) per migliorare la riproducibilità; benchmark quantitativo: rapporto segnale/rumore >15:1 rispetto ai controlli IgG.

4. Analisi e validazione delle proteine

1. Estrazione e quantificazione delle proteine
   1. Lisare le cellule (1 × 10^{6 cellule} ) o omogeneizzare campioni di tessuto (100 mg di tessuto striatale) in 200 μL di tampone per saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) contenente inibitori della proteasi (1 mM di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), 1 μg/mL di leupeptina, 1 μg/mL di pepstatina A) e inibitori della fosfatasi (1 mM di ortovanadato di sodio, 5 mM di fluoruro di sodio).
   2. Incubare i lisati su ghiaccio per 30 minuti con vortice periodico (ogni 10 minuti per 10 secondi).
   3. Centrifugare a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari e raccogliere il surnatante.
   4. Quantificare la concentrazione proteica utilizzando il dosaggio dell'acido bicinchoninico (BCA) con standard di albumina sierica bovina (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 μg/mL) in misure triplicate.
   5. Convalidare l'integrità delle proteine analizzando i livelli proteici di housekeeping (GAPDH, MW previsto: 36 kDa) in tutti i campioni utilizzando il Western blot.
2. Analisi del western blot
   1. Preparare campioni proteici con un carico uguale (30-50 μg) in tampone di caricamento per elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) (concentrazioni finali: 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerolo, 5% β-mercaptoetanolo, 0,003% blu di bromofenolo) e denaturare a 95 °C per 5 minuti.
   2. Separare le proteine mediante SDS-PAGE utilizzando gel di poliacrilammide al 10%, funzionando a 80 V per 30 minuti seguiti da 120 V per 90 minuti in tampone Tris-glicina-SDS.
   3. Trasferimento di proteine su membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF) utilizzando un sistema di trasferimento semi-secco (400 mA per 90 min) in tampone di trasferimento (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanolo).
   4. Confermare l'efficienza del trasferimento utilizzando la colorazione reversibile delle proteine (Ponceau S: 0,1% in acido acetico al 5% per 5 minuti) prima di procedere all'incubazione degli anticorpi.
   5. Bloccare le membrane con il 5% di latte scremato in TBST (TBS + 0,1% Tween-20) per 1 ora a RT con leggera agitazione.
   6. Incubare con anticorpi primari diluiti 1:1000 in tampone bloccante per una notte a 4 °C con leggera agitazione.
   7. Lavare le membrane tre volte con TBST (10 minuti ciascuna) e incubare con anticorpi secondari coniugati HRP (diluizione 1:5000) per 1 ora a RT.
   8. Rileva le bande proteiche utilizzando la chemiluminescenza potenziata e quantifica utilizzando la densitometria.
   9. Normalizzare l'espressione della proteina bersaglio al controllo del carico (GAPDH) e convalidare la specificità degli anticorpi utilizzando controlli appropriati (blocco peptidico per gli anticorpi primari, controlli solo secondari).

5. Valutazione comportamentale e analisi funzionale

1. Test di posizionamento degli arti anteriori
   1. Lasciare che il mouse si acclimati all'ambiente di test (stanza silenziosa, 22 °C, illuminazione scarsa) per 30 minuti prima della valutazione.
   2. Afferrare delicatamente il mouse per la pelle dorsale, sospendendo tutti e quattro gli arti a circa 0,5 cm sopra il bordo del tavolo e assicurandosi che il mouse non possa vedere la superficie del tavolo.
   3. Sfiorare le vibrisse su ciascun lato contro il bordo del tavolo per attivare il riflesso di posizionamento e registrare il posizionamento riuscito degli arti anteriori entro 2 s.
   4. Esegui 10 prove per lato con intervalli di 30 secondi tra le prove, alternando i lati sinistro e destro.
   5. Eseguire i test in condizioni di illuminazione costanti (50-100 lux) e ora del giorno (13:00-17:00) per ridurre al minimo le influenze circadiane.
   6. Calcola la percentuale di successo come percentuale di posizionamenti riusciti: (posizionamenti riusciti/prove totali) × 100.
2. Accelerazione del test rotarod
   1. Impostare l'apparato rotarod su una velocità iniziale di 4 giri/min con accelerazione lineare a 40 giri/min per una durata di 5 minuti.
   2. Addestrare i topi sul rotarod per 3 giorni consecutivi (3 prove al giorno, intervalli di 15 minuti) prima del test per ridurre al minimo gli effetti dell'apprendimento.
   3. Standardizza le condizioni di test, tra cui RT (22 ± 2 °C), illuminazione (100 lux) e livelli di rumore di fondo (<50 dB).
   4. Posizionare il mouse sull'asta rotante rivolta in avanti e avviare immediatamente il protocollo di accelerazione.
   5. Registra la latenza di caduta (tempo dall'inizio fino a quando il topo cade o completa la prova di 5 minuti) per ogni prova, testando 5 volte per animale con intervalli di riposo di 15 minuti.
   6. Calcola la latenza media delle tre prove più lunghe per ridurre al minimo la variabilità dovuta a fattori motivazionali.
3. Test in campo aperto
   1. Utilizzare un apparecchio a campo aperto (scatola in acrilico trasparente da 50 cm × 50 cm × 50 cm) con un sistema di tracciamento video posizionato a 1 m sopra l'arena.
   2. Pulire l'apparecchio con il 70% di etanolo tra gli animali (spray e salvietta, 5 minuti di asciugatura all'aria) per eliminare i segnali di odore.
   3. Posizionare il mouse al centro dell'apparecchio e registrare l'attività per 10 minuti in condizioni di illuminazione costante (200 lux) con acquisizione video a 30 fps.
   4. Analizza più parametri utilizzando il software di tracciamento automatizzato:
      Distanza totale percorsa (cm)
      Tempo della zona centrale (definito come 10 cm dalle pareti, riportato in s)
      Velocità di movimento (cm/s)
      Tempo trascorso in periferia rispetto alle zone centrali
4. Definisci la zona centrale a 10 cm dalle pareti e quantifica il tempo trascorso e la distanza percorsa nelle zone centrali rispetto alle zone periferiche.

6. Microscopia avanzata e imaging

1. Colorazione DHE per il rilevamento di ROS
   1. Preparare una soluzione fresca di diidroetidio (DHE) a 10 μM in PBS immediatamente prima dell'uso (proteggere dalla luce).
   2. Eseguire la colorazione in co-immunofluorescenza combinando DHE con l'anticorpo triptofano idrossilasi 2 (TPH2) (diluizione 1:500) per identificare in modo specifico i neuroni della serotonina.
      NOTA: Questo approccio a doppia marcatura consente di discriminare la produzione di ROS all'interno di corpi cellulari neuronali TPH2-positivi dallo stress ossidativo nelle cellule gliali circostanti, sulla base del principio che il DHE, dopo l'ossidazione da parte del superossido, forma prodotti fluorescenti impermeabili alla membrana che rimangono localizzati all'interno della cellula di origine.
   3. Incubare sezioni di tessuto (20 μm di spessore) con una soluzione di DHE per 30 minuti a 37 °C in condizioni di oscurità in una camera umidificata.
   4. Includere controlli negativi (senza DHE) e controlli positivi (100 μM di trattamento H₂O₂ per 30 minuti) per convalidare la specificità di rilevamento dei ROS.
   5. Lavare le sezioni tre volte con PBS e montare con un mezzo di montaggio anti-sbiadimento.
   6. Immagine utilizzando la microscopia a fluorescenza (DHE: 518 nm di eccitazione/605 nm di emissione, TPH2: 488 nm di eccitazione/525 nm di emissione) con impostazioni di esposizione coerenti (200 ms) su tutti i campioni; I sistemi di imaging sono stati calibrati settimanalmente utilizzando perle di fluorescenza standard (rapporto segnale/rumore > 20:1).
   7. Quantificare l'intensità della fluorescenza nelle cellule TPH2-positive solo utilizzando il software ImageJ con protocolli di analisi standardizzati (soglia: 50-255, dimensione delle particelle: 10-∞ pixel²). Stabilire i limiti del ROI in base all'immunoreattività del TPH2 per garantire la misurazione dello stress ossidativo in modo specifico all'interno dei neuroni serotoninergici, escludendo il segnale proveniente da microglia adiacenti, astrociti o altri tipi di cellule. Per ogni animale, analizzare un minimo di 50 neuroni TPH2-positivi su più sezioni di tessuto.
2. Immunoistochimica
   1. Fissare sezioni di tessuto in paraformaldeide al 4% in PBS per 24 ore a 4 °C con leggera agitazione.
   2. Disidratare attraverso una serie di etanolo graduato (70%, 80%, 90%, 95%, 100% × 2, 1 h ciascuno) e incorporare in paraffina utilizzando un processore automatizzato.
   3. Tagliare sezioni da 5 μm utilizzando un microtomo e montarle su vetrini carichi, garantendo 3-4 sezioni per vetrino.
   4. Deparaffinare le sezioni usando xilene (2 × 10 minuti) e reidratare attraverso etanolo graduato in acqua.
   5. Eseguire il recupero dell'antigene utilizzando il tampone citrato (10 mM di citrato di sodio, pH 6,0) in un forno a microonde (750 W per 10 minuti con intervalli di raffreddamento di 2 minuti).
   6. Convalidare la specificità degli anticorpi utilizzando appropriati controlli negativi (nessun anticorpo primario) e tessuti di controllo positivi (sezioni cerebrali note per esprimere proteine bersaglio).
   7. Bloccare l'attività endogena della perossidasi con perossido di idrogeno al 3% in metanolo per 10 minuti a RT.
   8. Applicare gli anticorpi primari per una notte a 4 °C in una camera umidificata.
   9. Rilevare utilizzando anticorpi secondari coniugati con HRP (diluizione 1:500, 1 ora a RT) e il cromogeno DAB (incubare fino a quando non si sviluppa il colore marrone, in genere 2-5 minuti).
   10. Controcolorare con ematossilina (30 s), disidratare, pulire e montare con un mezzo di montaggio permanente.
   11. Quantificare le cellule positive utilizzando metodi stereologici con campionamento casuale sistematico (ogni 5 sezioni, 3 fotogrammi di conteggio per sezione, ingrandimento × 40).

7. Analisi statistica e validazione dei dati

1. Progettazione e analisi statistica
   1. Eseguire l'analisi della potenza per determinare le dimensioni del campione adeguate per rilevare differenze biologicamente significative (dimensione dell'effetto ≥ 0,8, potenza ≥ 0,80, α = 0,05) utilizzando il software G*Power 3.1.9.7.
   2. Convalidare la normalità dei dati utilizzando il test di Shapiro-Wilk e valutare l'omogeneità della varianza utilizzando il test di Levene prima dell'analisi parametrica.
   3. Analizzare i dati utilizzando un software statistico con opportuni test statistici basati sul disegno sperimentale e sulla distribuzione dei dati.
   4. Applicare l'analisi della varianza a una via (ANOVA) per confronti a fattore singolo e l'ANOVA a due vie per disegni fattoriali (ad esempio, interazioni tra trattamento × tempo).
   5. Utilizzare il test post hoc di Tukey per confronti multipli quando l'ANOVA mostra significatività (p < 0,05), applicando la correzione di Bonferroni quando appropriato.
   6. Impostare la soglia di significatività statistica a p < 0,05 per tutte le analisi con notazione aggiuntiva per p < 0,01 e p < 0,001.
   7. Riporta le dimensioni dell'effetto (d di Cohen o η²) e gli intervalli di confidenza al 95% insieme ai valori p per fornire un'interpretazione statistica completa.
   8. Presentare i dati come media ± SEM da un minimo di tre esperimenti indipendenti, con singoli punti dati mostrati quando n ≤ 10.
      NOTA: Tutti gli esperimenti di coltura cellulare devono essere ripetuti in modo indipendente almeno tre volte, con ogni esperimento che include controlli appropriati e più repliche tecniche, e la variabilità osservata (ad esempio, CV <15% per i dati comportamentali) è stata ridotta al minimo attraverso l'accecamento e la tempistica standardizzata.

Il protocollo dimostra con successo che l'espressione di Mettl3 diminuisce nelle cellule microgliali trattate con LPS (Figura 1), come evidenziato dalle riduzioni del livello di mRNA e proteine rispetto ai gruppi di controllo (Figura 1B, C). L'analisi ELISA conferma il successo dell'attivazione infiammatoria mediata da LPS attraverso elevati livelli di IL-6 e TNF-α nei surnatanti di coltura (Figura 1A).

L'analisi MeRIP-qPCR rivela che la sovraespressione di Mettl3 migliora la metilazione dell'mRNA m6A di Nrf2, che paradossalmente aumenta la stabilità e l'espressione della proteina piuttosto che promuovere la degradazione, in linea con l'evidenza emergente che le modifiche di m6A possono migliorare l'efficienza della traduzione in specifici contesti cellulari (Figura 2A, B). Gli esperimenti di frazionamento nucleo-citoplasmatico dimostrano che mentre la distribuzione dell'mRNA di Nrf2 rimane invariata nei compartimenti cellulari, i livelli proteici sono significativamente modulati dallo stato di espressione di Mettl3 (Figura 2C, D).

Esperimenti in vivo con modelli di PD indotti da MPTP mostrano che i deficit comportamentali sono correlati ai cambiamenti molecolari nell'asse Mettl3/Nrf2. Tutti i campioni di tessuto sono stati ottenuti dalla regione striatale (coordinate: da +0,5 a -0,5 mm da bregma, da ±1,5 a ±2,5 mm lateralmente, da -2,5 a -3,5 mm ventrale). I topi del gruppo modello mostrano una ridotta precisione di posizionamento degli arti anteriori, una diminuzione delle prestazioni del rotarod e una diminuzione dell'attività in campo aperto rispetto ai controlli fittizi (Figura 3A). Il knockdown di Nrf2 aggrava questi deficit, mentre la sovraespressione di Nrf2 fornisce una protezione parziale. L'analisi immunoistochimica rivela una diminuzione delle popolazioni microgliali (cellule Iba1-positive) nelle regioni striatali dei modelli di PD, con la modulazione di Nrf2 che influenza di conseguenza la sopravvivenza microgliale (Figura 3B).

I livelli di citochine pro-infiammatorie (IL-1β, IL-18, TNF-α) aumentano significativamente nei modelli di malattia come previsto, con il gruppo modello che mostra livelli elevati rispetto ai controlli Sham e la sovraespressione di Nrf2 che fornisce effetti antinfiammatori (Figura 3C). L'analisi molecolare dimostra che i marcatori di piroptosi sono elevati, tra cui GSDMD-N, cleaved-caspasi-1 e NLRP3 negli animali trattati con MPTP, con risultati di Western blot corretti che mostrano marcatori di peso molecolare appropriati (Figura 3D). La microscopia elettronica a scansione conferma l'aumento della formazione di corpi piroptotici negli animali malati, con la modulazione di Nrf2 che influenza l'entità della morte cellulare piptotica (Figura 3E).

La colorazione del DHE combinata con l'immunofluorescenza di TPH2 rivela livelli elevati di ROS in particolare nei neuroni della serotonina dei modelli PD (Figura 4A). La co-localizzazione dei prodotti di ossidazione del DHE all'interno dei corpi cellulari TPH2-positivi indica la generazione endogena di superossido in questi neuroni, coerente con la disfunzione mitocondriale indotta da citochine infiammatorie e con la compromissione delle difese antiossidanti. La distribuzione spaziale del segnale DHE corrisponde alla morfologia neuronale piuttosto che all'ossidazione diffusa dei tessuti, supportando lo stress ossidativo specifico del tipo cellulare. L'immunoistochimica mostra una ridotta espressione dei marcatori neuronali della serotonina TPH2 e SLC6A4 nei gruppi Modello e Modello+Nrf2-KD, con effetti protettivi osservati nel gruppo Modello+oe-Nrf2 (Figura 4B). Questi risultati indicano che la piroptosi microgliale porta allo stress ossidativo e al conseguente danno ai neuroni della serotonina.

Il percorso meccanicistico complessivo è riassunto nella Figura 5, che illustra come la modifica m6A di Nrf2 mediata da Mettl3 sopprima la piroptosi microgliale e protegga i neuroni della serotonina.

Gli esperimenti di successo mostrano in genere chiare relazioni dose-risposta tra i livelli di espressione di Mettl3/Nrf2 e i marcatori infiammatori a valle. Risultati non ottimali possono verificarsi a causa di una trasduzione virale incompleta, di un'attivazione inadeguata dell'LPS o di problemi tecnici durante l'elaborazione dei tessuti. Gli esperimenti di controllo dimostrano costantemente un'adeguata specificità anticorpale e l'assenza di legame non specifico nelle analisi immunoistochimiche. L'efficienza dell'infezione virale nello striato è stata convalidata attraverso la co-localizzazione con i marcatori Iba1 e NeuN, confermando il targeting microgliale predominante.

Figura 1: Sottoespressione di Mettl3 in cellule microgliali indotte da LPS. (A) Misurazione ELISA dei livelli di IL-6 e TNF-α in cellule microgliali trattate con LPS. (B) Misurazione RT-qPCR dei livelli di mRNA di Mettl3 in cellule microgliali trattate con LPS. (C) Misurazione Western blot dei livelli di proteina Mettl3 in cellule microgliali trattate con LPS che mostrano Mettl3 a 64 kDa e GAPDH a 36 kDa. **I dati rappresentano la media ± SEM, n = 6 per gruppo. *p < 0,05, p < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Mettl3 influenza la traduzione di Nrf2 attraverso la modifica di m6A nelle cellule microgliali indotte da LPS. (A) Misurazione RT-qPCR dei livelli di mRNA di Nrf2 nei gruppi oe-NC e oe-Mettl3. (B) Misurazione MeRIP-qPCR dei livelli di metilazione di Nrf2 nei gruppi oe-NC e oe-Mettl3. (C) Misurazione RT-qPCR dei livelli di mRNA di Nrf2 nel nucleo e nel citoplasma di gruppi sperimentali. (D) Misurazione Western blot dei livelli di proteina Nrf2 in gruppi sperimentali che mostrano Nrf2 a 110 kDa e GAPDH a 36 kDa. **I dati rappresentano la media ± SEM, n = 6 per gruppo. *p < 0,05, p < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Dimostrazione in vivo dell'asse Mettl3/Nrf2 che innesca la piroptosi microgliale attraverso l'inflammasoma NLRP3. (A) Valutazioni comportamentali tra cui posizionamento degli arti anteriori, rotarod e test in campo aperto. (B) Rilevamento immunoistochimico dell'espressione della proteina Iba nel tessuto cerebrale (barra della scala = 50 μm). (C) Rilevamento ELISA di citochine infiammatorie nel tessuto cerebrale che mostrano l'elevazione attesa nei gruppi modello con riduzione in caso di sovraespressione di Nrf2. (D) Rilevazione Western blot di marcatori di piroptosi con annotazioni sul peso molecolare: NLRP3 a 110 kDa, cleaved-Caspase-1 a 22 kDa, GSDMD-N a 31 kDA e GAPDH a 36 kDa. (E) Rilevamento al microscopio elettronico a scansione di corpi pirottotici (indicati da frecce bianche che mostrano le caratteristiche vescicole legate alla membrana da 1-5 μm). Quantificazione basata su 5 campi per sezione, n = 6 animali/gruppo. **I dati rappresentano la media ± SEM, n = 6 per gruppo. *p < 0,05, p < 0,01 rispetto al gruppo Sham. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: La piroptosi microgliale provoca danni mitocondriali e promuove l'apoptosi dei neuroni 5-HT. (A) Colorazione DHE combinata con immunofluorescenza TPH2 per la rilevazione di ROS in particolare nei neuroni 5-HT (barra della scala = 50 μm). L'approccio di co-localizzazione consente la discriminazione dello stress ossidativo all'interno di corpi cellulari neuronali TPH2-positivi dalle cellule gliali circostanti. (B) Rilevazione immunoistochimica dell'espressione delle proteine TPH2 e SLC6A4 nei neuroni 5-HT (barra della scala = 50 μm). **I dati rappresentano la media ± SEM, n = 6 per gruppo. *p < 0,05, p < 0,01 rispetto al gruppo Sham. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Rappresentazione schematica della soppressione mediata da Mettl3 della progressione della malattia di Parkinson attraverso la modifica m6A di Nrf2 e l'inibizione della morte neuronale 5-HT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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