Articolo metodologico

Raccolta multiorgano da modelli topini per studi sull'invecchiamento

DOI:

10.3791/69128

⸱

12 dicembre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo fornisce un metodo standardizzato per la raccolta degli organi in topi giovani e anziani per valutare i cambiamenti anatomici e istologici legati all'età su più tessuti, supportando sia il disegno sperimentale etico che quello economico.

Abstract

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L'invecchiamento è un processo biologico sistemico e multifattoriale che colpisce progressivamente quasi tutti gli organi e i tessuti, portando a alterazioni strutturali, cellulari e molecolari. Questo protocollo delinea un approccio standardizzato e riproducibile per valutare i cambiamenti anatomici e morfologici legati all'età nei topi attraverso la raccolta completa degli organi per analisi istologiche e molecolari. Utilizzando topi giovani (2-3 mesi) e di età (20-24 mesi), descriviamo procedure passo dopo passo per la dissezione anatomica grossolana e il prelievo sistematico degli organi principali per sezioni a valle, colorazione istologica e valutazione microscopica. Il protocollo consente la raccolta di un'ampia gamma di organi e tessuti (inclusi cervello, occhi, esofago, timo, cuore, aorta, polmoni, linfonodi, fegato, pancreas, stomaco, intestino tenue, colon, milza, rene, vescica, pelle, muscolo scheletrico, osso e tessuto adiposo) da un singolo animale. Massimizzando la resa dati per soggetto, questo flusso di lavoro sostiene l'uso etico degli animali attraverso la riduzione, aumenta la riproducibilità tra gli studi e facilita analisi integrative dell'invecchiamento dell'organismo.

Introduzione

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L'invecchiamento è un processo sistemico che colpisce quasi tutti gli organi, eppure la maggior parte degli studi sperimentali si concentra su un singolo tessuto, limitando le intuizioni su come i cambiamenti legati all'età co-avvengono o interagiscono nel corpo. L'invecchiamento si manifesta sia in alterazioni specifiche dei tessuti che sistemiche, tra cui disfunzioni immunitarie, cambiamenti metabolici, perdita di capacità rigenerativa e degenerazionestrutturale 1,2. Sebbene le ricerche specifiche per organo abbiano fornito preziose intuizioni, è necessaria una prospettiva più ampia per comprendere come l'invecchiamento cellulare attraverso i sistemi contribuisca al declino dell'organismo completo. L'analisi multi-organo in modelli preclinici in vivo, come i topi, è essenziale per identificare cambiamenti strutturali, cellulari e molecolari coordinati che contribuiscono alle malattie associate all'età e alla perdita di resilienzafisiologica 3,4.

Il topo da laboratorio rimane un modello preclinico essenziale e ben consolidato per la ricerca sull'invecchiamento grazie alla sua trattabilità genetica, alla breve durata della vita, ai percorsi di invecchiamento conservati e alla sua capacità di ripetere caratteristiche chiave dell'invecchiamento umano, tra cui disfunzione immunitaria, fibrosi tissutale, declino metabolico e aumento dellaneoplasia 5,6,7. Tuttavia, protocolli efficienti e standardizzati di dissezione multiorgano non sono ampiamente utilizzati. Tali protocolli sono necessari per ottimizzare i confronti istologici, ridurre l'uso degli animali e integrare dataset omici tra tessuti dello stessosoggetto 8,9.

Qui presentiamo un protocollo riproducibile ed efficiente in termini di tempo per la perfusione, la dissezione e la conservazione multiorgano nei topi. Questo protocollo fornisce una guida passo dopo passo per la dissezione anatomica e la raccolta degli organi principali da topi giovani (2-3 mesi) ed equati (20-24 mesi), inclusi cervello, occhi, timo, cuore, polmoni, aorta, linfonodi inguinali, tratto gastrointestinale (esofago, stomaco, intestino tenue, colon), fegato, pancreas, milza, reni, vescica, tessuto adiposo, muscoli scheletrici, ossa e pelle. Sono incluse istruzioni dettagliate per la conservazione dei tessuti compatibili con i flussi di lavoro istologici, molecolari e di criosezionamento. Questo approccio standardizzato consente ai ricercatori di valutare i segni specifici e sistemici dell'invecchiamento all'interno degli stessi soggetti sperimentali, supportando una ricerca integrata e di alta qualitàsull'invecchiamento 4,10,11,12.

Protocollo

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I topi C57BL/6J erano mantenuti presso l'Università della California, San Francisco. Tutte le procedure animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e supervisionate dal Laboratory Animal Resource Center. I topi sono stati ospitati in un ciclo chiaro-buio di 12 ore, con meno di cinque topi adulti per gabbia. L'eutanasia è stata eseguita in conformità con le Linee Guida per l'Eutanasia degli Animali dell'American Veterinary Medical Association (AVMA) 13. Per questo protocollo, i topi giovani venivano sacrificati a 3 mesi e quelli anziani a 22 mesi. Prima di procedere con la dissezione e la raccolta degli organi, stampa e completa la checklist per la preparazione (Tabella 1) e la checklist per la raccolta dei tessuti (Tabella 2). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Lussazione cervicale

NOTA: La lussazione cervicale deve essere eseguita da un individuo addestrato per minimizzare traumi eccessivi alle strutture cervicali.

  1. Immobilizza il topo afferrando saldamente la base della coda con una mano.
  2. Posiziona pollice e indice della mano opposta alla base del cranio.
  3. Applica una pressione ferma e rapida per slogare le vertebre cervicali. Palpare il collo per confermare la separazione tra il cranio e le vertebre adiacenti.
  4. Confermare l'eutanasia riuscita (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) assicurandosi l'arresto respiratorio e l'assenza di risposte agli stimoli nocivi prima di procedere.
  5. Annota il peso corporeo del topo prima della perfusione e della raccolta dei tessuti.

2. Toracotomia e perfusione

NOTA: La perfusione è opzionale. Eseguire tutte le procedure che coinvolgono il paraformaldeide (PFA) in una cappa chimica certificata indossando l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) appropriata, inclusi camice da laboratorio, guanti in nitrile e occhiali di sicurezza. Smaltire le soluzioni PFA in conformità con le linee guida istituzionali per la sicurezza chimica. Raccogliere tutti i materiali PFA e contaminati (ad esempio, guanti, fazzoletti, contenitori) in un contenitore di rifiuti pericolosi chiaramente etichettati e smaltirli tramite l'ufficio per la Salute e Sicurezza Ambientale dell'istituzione, seguendo i protocolli conformi alle normative locali, statali e federali.

ATTENZIONE: Se usi il paraformaldeide (PFA) per la fissazione, esegui tutti i passaggi sotto una cappa per evitare l'esposizione ai vapori di formaldeide.

  1. Posiziona un coperchio in polistirolo coperto con un materiale assorbente per raccogliere il liquido dalla perfusione in un vassoio di raccolta dei prodotti. Posizionare il topo su questa superficie di dissezione in posizione supina e fissare gli arti con perni per stabilizzare il corpo: gli arti anteriori posizionati lateralmente per aprire la cavità toracica e gli arti posteriori estesi caudalmente per creare una lieve tensione lungo la parete addominale.
    NOTA: Questa posizione migliora la visibilità, minimizza le ostruzioni e massimizza lo spazio di lavoro per la raccolta degli organi.
  2. Applica il 70% di etanolo nella zona del petto.
  3. Usa forbici affilate per realizzare un'incisione trasversale al livello del diaframma, seguita da due tagli a V che si estendono per esporre la gabbia toracica (Figura 1A).
  4. Utilizzando le pinze a estremità smussata, solleva delicatamente la pelle e taglia con cura eventuali attacchi residui per esporre completamente l'area toracica.
  5. Effettuare due incisioni a forma di V lunghe circa 2 cm lungo entrambi i lati della gabbia toracica per aprire la cavità toracica.
  6. Tira verso l'alto lo sterno e fissalo sulla spalla del topo insieme alla testa.
  7. Usando pinze smussate, espone con cura il cuore. Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate dalla linea di perfusione, poi inserire un ago o una cannula a farfalla nella punta del ventricolo sinistro fino a una profondità di circa 3-4 mm. Effettuare un'incisione lunga circa 5 mm nell'atrio destro per permettere l'uscita del perfuso (Figura 1B).
  8. Iniziare la perfusione con una soluzione fisiologica priva di calcio e magnesio (ad esempio, PBS, soluzione salina o HBSS) per liberare il sistema circolatorio.
    NOTA: La perfusione può essere eseguita utilizzando una siringa da 20 mL, una pompa o un sistema alimentato per gravità. In media, sono necessari 15-20 mL di soluzione di perfusione per topo per ottenere la completa eliminazione del sangue dal vascolo. Una buona perfusione è indicata da una rapida pulizia (sbollentamento) di fegato e polmoni, così come da una zona della bocca e della lingua che appaiono pallide. La perfusione completa porterà a un flusso chiaro e senza sangue dal cuore.
  9. Se desiderato, iniziare la perfusione PFA sostituendo la linea di perfusione dalla soluzione fisiologica priva di calcio e magnesio (usata per il pre-lavaggio e la rimozione del sangue) a una siringa da 50 mL contenente il 4% di paraformaldeide (PFA), mantenendo l'ago in posizione. Fai attenzione a evitare di introdurre bolle d'aria nella conduzione. Continuare la perfusione con il 4% di PFA finché il grado desiderato di fissazione non sarà giudicato dall'irrigidimento progressivo del corpo. Circa 30 mL di fissativo sono sufficienti per un solo topo.

3. Raccolta di organi e tessuti

NOTA: La sequenza della raccolta degli organi è fondamentale quando si confrontano topi giovani e anziani. Gli organi negli animali anziani tendono a essere fragili e suscettibili all'autolisi o a danni meccanici, rendendo essenziale una gestione rapida e costante dei tessuti. Standardizzare l'ordine di raccolta riduce la variabilità post-mortem, riduce la manipolazione degli artefatti e garantisce una qualità di fissazione uniforme tra gli animali14,15. La coerenza è fondamentale per rilevare sottili cambiamenti morfologici legati all'età, poiché un campionamento ritardato o incoerente può introdurre bias. Se non è stata eseguita la perfusione di PFA, gli organi dovrebbero essere prelevati rapidamente. Pancreas, stomaco, polmoni e cervello sono particolarmente soggetti a rapida autolisi e degrado istologico se non trattati immediatamente. Poiché i topi anziani sviluppano frequentemente lesioni neoplasiche, si esamina attentamente milza, fegato, linfonodi, polmoni e timo per individuare asimmetria, ingrossamento, noduli o decolorazioni. Annota questi risultati come parte del carico complessivo della malattia (vedi Tabella 2).

  1. Si inizia con l'animale in posizione supina dopo la perfusione o la lussazione cervicale per raccogliere gli organi principali delle cavità toracica e addominale (Figura 1C).
  2. Applica delicatamente etanolo al 70% usando garze o uno spruzzino dopo l'appuntamento, riducendo così al minimo la contaminazione del pelo e mantenendo l'idratazione dei tessuti nelle zone sensibili. Questo metodo si è dimostrato efficace nelle nostre mani per ridurre i detriti di pelo e migliorare la visibilità durante la dissezione, evitando al contempo gli svantaggi dell'immersione totale.
  3. Utilizzando forbici e pinze smussate, apri con cura la cavità addominale facendo un'incisione mediana dal diaframma al bacino, seguita da due incisioni laterali come indicato dalle linee rosse nella Figura 1A. Solleva la pelle e la parete addominale per esporre completamente gli organi interni.
  4. Stomaco, intestino tenue e colon: stacca lo stomaco all'esofageo lasciando l'estremità pilorica continua con l'intestino tenue. Libera delicatamente il tratto gastrointestinale recidendo i legamenti di supporto, poi rimuovi il tratto, compresi intestino tenue e colon. Taglia distalmente al retto.
    1. Per eliminare i contenuti luminali, si recide l'intestino tenue prossimalmente alla flessione duodenojejunale e distalmente alla giunzione ileocecale. Per il colon, separa prossimalmente al ceco. Risciacqua l'intestino tenue e il colon con circa 20 mL di soluzione fisiologica utilizzando una siringa dotata di un ago per l'alimentazione, fissando delicatamente il tessuto con pinze a punta fine per evitare danni.
  5. Esofago: Isola l'esofago dalla cervicale alla giunzione gastrica.
  6. Milza e pancreas: Isolare milza e pancreas dai tessuti circostanti tramite una dissezione fine, minimizzando i danni meccanici. Stacca con cura il pancreas dalla milza. Dissezionare e tagliare immediatamente il pancreas in piccoli pezzi (≤5 mm) e immergerli in un fissativo entro 5 minuti dall'eutanasia per minimizzare l'autolisi e preservare la morfologia tissutale ottimale. Ispeziona la milza, annotando dimensioni, colori, forme e la presenza di eventuali anomalie visibili.
  7. Fegato: Usando pinze a punta fine, afferra il tessuto connettivo centrale tra i lobi epatici e tira delicatamente verso l'alto per creare tensione. Con forbici dissecanti, recidi con cura tutti gli attacchi tra il fegato e gli organi adiacenti. Ispezionare il fegato per colore, consistenza e presenza di noduli o altre anomalie.
  8. Grasso viscerale: Raccogliere campioni di depositi viscerali di adiposo.
    NOTA: Gli animali giovani hanno tipicamente un minimo di grasso viscerale, mentre gli animali anziani spesso mostrano un aumento dell'accumulo di grasso, in particolare intorno all'intestino, ai reni e alle regioni gonadiali.
  9. Reni e vescica: Rimuovere entrambi i reni insieme agli ureteri e alla vescica attaccati. Distacca con cura i reni dal tessuto adiposo circostante e dalle strutture connettive usando forbici fini o pinze a estremità smussata. Segui gli ureteri distalmente fino alla vescica, tagliando eventuali attacchi rimasti per isolare l'intero tratto urinario. Ispezionare reni e vescica per dimensioni, colore e anomalie prima di ulteriori lavori.
  10. Linfonodi: Ritrae la pelle dal peritoneo per esporre la regione inguinale. Identifica i linfonodi all'interno del cuscinetto adiposo mammario lungo i vasi linfatici. Isolare e rimuovere i linfonodi con una pinza a punta fine, minimizzando la perturbazione del tessuto adiposo e connettivo circostante.
  11. Cuore: Rimuovere con attenzione il cuore recidendo i vasi principali.
  12. Timo: Espelle con cura il timo per preservarne la struttura. Tieni presente che il timo subisce involuzione con l'età e, nei topi anziani, può essere presente solo tessuto timico minimo o assente.
  13. Polmoni: Utilizzando forbici affilate e pinze a punta fine, rimuovere con cura i polmoni insieme alla trachea attaccata in un unico pezzo.
  14. Aorta: Inserire le pinze chiuse tra l'aorta e la colonna vertebrale e slocare delicatamente l'aorta, separandola lungo la parte dorsale. Fai attenzione a non strappare il vaso. Utilizzando le pinze a punta fine, rimuovere con attenzione i tessuti adiposi e connettivi circostanti dall'aorta al microscopio disseczionale.
  15. Muscolo scheletrico: Risezionare la pelle sopra gli arti posteriori per esporre il femore e la muscolatura circostante. Utilizzando forbici sottili, isola con cura i muscoli attaccati al femore staccandoli dal tessuto connettivo circostante e recidendo le inserzioni dei tendini per preservare l'integrità delle fibre.
  16. Osso (Tibia): Usando forbici di dissecazione, sezioni la pelle e il muscolo soprastanti per esporre la tibia. Usando forbici per la dissezione e pinze smussate, stacca con cura la tibia alle articolazioni del ginocchio e della caviglia. Rimuovere eventuali tessuti molli residui senza danneggiare l'osso.
  17. Occhi: Usando grandi forbici disezionali, decapita il topo. Rimuovi con attenzione gli occhi usando una pinza a punta fine.
  18. Cervello: Risezionare il cuoio capelluto per esporre il cranio anteriore. Usando forbici affilate o bisturi, segui le suture craniche e solleva i segmenti ossei per esporre il cervello (Figura 1D). Taglia i bulbi olfattivi e gli attacchi ventrali. Estrai delicatamente il cervello dalla cavità cranica. Processa immediatamente il tessuto per mantenere la morfologia.
  19. Pelle: Se è necessaria la depilazione per le applicazioni a valle, rimuovi i peli utilizzando un tagliacapelli elettrico. Pizzica una porzione della pelle dorsale con una pinza smussata, espelle con forbici e raccogli il tessuto per un ulteriore lavoramento.
  20. Dopo aver rimosso tutti gli organi di interesse, si colloca l'intera carcassa del topo in un contenitore da 450 mL pre-riempito con PFA al 4% per archiviare eventuali risultati imprevisti o rispondere alle domande dei revisori che potrebbero richiedere il ritorno al tessuto fissato umido.

4. Conservazione e lavorazione dei tessuti

NOTA: Per preservare l'integrità dei tessuti, minimizzare il tempo tra la dissezione e la conservazione. I ritardi possono compromettere la morfologia e la qualità molecolare dei tessuti; ulteriori dettagli per la tempistica critica della raccolta e conservazione dei tessuti sono mostrati nella Tabella 2.

ATTENZIONE: Se si utilizza il paraformaldeide (PFA) per la fissazione, esegui tutti i passaggi all'interno di una cappa per evitare l'esposizione ai vapori di formaldeide.

  1. Processare i tessuti immediatamente dopo la dissezione, selezionando il protocollo appropriato (passo 4.1, 4.2 o 4.3) in base all'applicazione a valle prevista.
    1. Fissazione del paraformaldeide (PFA): Posizionare tessuti destinati all'analisi istologica al 4% di PFA a 4 °C per 12-24 ore. Dopo la fissazione, lavare accuratamente i tessuti con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere il fissativo residuo, poi trasferirli al 70% di etanolo per la conservazione fino all'incastrazione e sezionamento della paraffina.
  2. Incorporamento composto a temperatura ottimale di taglio (OCT): Inserire tessuti freschi nel composto OCT. Inserire i tessuti in stampi da incorporazione riempiti di composto OCT, eliminando bolle d'aria, incubare per 5 minuti a temperatura ambiente, poi congelare nella fase di vapore dell'azoto liquido. Sigillare con carta stagnola di alluminio e conservare i blocchi OCT a −80 °C fino alla sezionazione.
  3. Congelamento rapido in fase di azoto liquido: tessuti a congelamento rapido destinati all'analisi di RNA, proteine o metaboliti nella fase vapore dell'azoto liquido per minimizzare la formazione di cristalli di ghiaccio. Inserire i tessuti in criotubi etichettati e sospenderli sopra l'azoto liquido per un rapido congelamento. Una volta completamente congelati, trasferire i campioni in una conservazione a −80 °C.

Risultati

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Durante la necroscopia, i topi anziani mostrano frequentemente lesioni neoplastiche e necessitano di un esame attento per documentare i risultatipatologici 13,14,16,17,18. La Figura 2A mostra un maschio C57BL/6 di 22 mesi in posizione supina dopo perfusione. L'imbiancamento completo dei polmoni conferma una perfusione efficace, mentre il fegato mostra solo un sbollentamento parziale. Un'esame più attento del fegato ha rivelato molteplici noduli maligni (Figura 2B), accompagnati da vescicole seminali ingrandite (Figura 2A) e splenomegalia (Figura 2C). Questi risultati sono comuni nei topi anziani e dovrebbero essere documentati come parte del carico totale dellamalattia 18.

La Figura 3 mostra organi macroscopicamente normali raccolti dopo la dissezione e la perfusione, permettendo di valutare l'integrità anatomica e l'efficienza della perfusione. Il tratto gastrointestinale è stato lavato con una soluzione fisiologica per rimuovere i contenuti digeriti, ottenendo un aspetto pulito e traslucido di stomaco, colon e intestino tenue (Figura 3A). Strutture aggiuntive, tra cui esofago, pancreas, milza, depositi viscerali di adiposo, reni con vescica, linfonodi, cuore e timo, erano chiaramente identificabili e potevano essere isolati intatti per analisi a valle (Figura 3B, C, E-I).

La qualità della perfusione è stata valutata esaminando l'imbiancamento nei tessuti altamente vascolarizzati. Come mostrato nella Figura 3D e nella Figura 3J, fegato e polmoni mostravano differenze nette tra condizioni non perfuse, ben perfuse e parzialmente perfuse. Lo sbollentamento completo ha confermato una perfusione riassunta, mentre uno sbollentamento incompleto ha indicato variabilità tecnica o anomalie sottostanti. Altri tessuti, inclusi aorta, muscolo scheletrico, tibia, cervello, occhio e pelle, sono stati isolati con morfologia preservata, adatti a ulteriori applicazioni istologiche, molecolari o di imaging (Figura 3K-P). Questa procedura standardizzata di dissezione garantisce un recupero costante di tessuti e organi intatti e ben conservati e consente una valutazione anatomica grossoliana a supporto di una varietà di analisi a valle. La dissezione e la raccolta degli organi richiedevano circa 40-60 minuti per animale, a seconda dell'esperienza dell'operatore e della presenza di reperti patologici.

La Figura 4 mostra cambiamenti esemplari associati all'invecchiamento negli organi raccolti dopo l'immersione della paraffina, la sezionazione e la colorazione di ematossilina ed eosina (H&E). Nelle sezioni cutanee di topi anziani sono stati osservati assottigliamenti epiteliali e perdita di follicoli piliferi rispetto ai controlli giovani (Figura 4A). Le sezioni renali hanno mostrato un ingrossamento delle capsule di Bowman insieme a cambiamenti fibrotici e necrotici, oltre a regioni compatibili con linfomi (Figura 4B). Nelle sezioni pancreatiche, è stato osservato un aumento dei corpiapoptotici 19 e delle regioni linfomatote negli animali anziani, indicativo di compromessa dell'integrità tissutale con l'età (Figura 4C). Le sezioni della milza rappresentavano depositi amiloidi e regioni di linfoma negli animali anziani, riflettendo ulteriori tratti distintivi della patologia legata all'età (Figura 4D).

Questi risultati evidenziano caratteristiche istopatologiche rappresentative dell'invecchiamento su più tessuti, dimostrando l'utilità di questo protocollo nel rilevare i segni strutturali del declino legato all'età.

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Figura 1: Panoramica schematica delle procedure di dissezione del topo e esposizione degli organi. (A) Siti di incisione per aprire le cavità toracica e addominale (linee rosse), inclusa un'incisione trasversale al livello del diaframma, seguita da tagli a V lungo entrambi i lati della gabbia toracica per aprire la cavità toracica, e un'incisione mediana dal diaframma al bacino con tagli bilaterali per esporre completamente la cavità addominale. (B) Configurazione per perfusione che mostra l'inserimento di un ago a farfalla nel ventricolo sinistro e l'incisione dell'atrio destro per consentire un drenaggio sanguigno efficace. (C) Disposizione anatomica dei principali organi toracici e addominali dopo l'esposizione delle cavità. (D) Passaggi di dissezione della testa, inclusa la rimozione del cuoio capelluto e l'apertura del cranio lungo le suture craniche per esporre il cervello. Le linee rosse indicano i punti dell'incisione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Identificazione di lesioni neoplastiche in topi anziani. (A) Maschio rappresentativo di 22 mesi di C57BL/6 in posizione supina dopo perfusione con PFA al 4%. Lo sbiancamento completo dei polmoni (punta di freccia rosa) conferma una perfusione efficace, mentre il fegato (punta di freccia verde) mostra solo uno sbollentamento parziale. Le punte di freccia blu indicano vescicole seminali ingrandite. (B) Vista dettagliata del fegato che rivela molteplici noduli maligni (punte di freccia nere). (C) Milza ingrossata da un topo C57BL/6 in età (lato destro) rispetto a una milza normale di un giovane animale (lato sinistro). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Panoramica dei principali organi del topo e dell'integrità dei tessuti dopo la dissezione e la perfusione. (A) Stomaco, intestino tenue e colon prima e dopo il lavaggio con soluzione fisiologica per rimuovere i contenuti digeriti. (B) Esofago. (C) Pancreas con milza attaccata. (D) Fegato senza perfusione, con sbiancamento completo dopo una perfusione efficace, e con sbollentamento parziale indicativo di perfusione incompleta o patologia sottostante. (E) Tessuto adiposo viscerale. (F) Reni con vescica attaccata. (G) Linfonodi inguinali. (H) Cuore. (I) Timo. (J) Polmoni senza perfusione, con sbollentamento completo dopo una perfusione efficace e con sbollentamento parziale. (K) Aorta. (L) Muscolo scheletrico isolato dall'arto posteriore. (M) Tibia con struttura ossea conservata. (N) Cervello. (O) Occhio. (P) Pelle. Barre in scala: 5 mm in A, C, D, E, F, J, L, N, P; 1 mm in tutti gli altri pannelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Analisi istologica degli organi principali utilizzando colorazione di ematossilina ed eosina (H&E). (A) Sezioni cutanee di topi di 3 mesi (giovani) e 22 mesi (anziani). Le sezioni di animali anziani mostrano assottigliamento epiteliale e perdita di follicoli piliferi. (B) Sezioni renali che evidenziano le capsule di Bowman. Le sezioni di animali anziani mostrano ingrandimento capsulale, cambiamenti fibrotici e necrotici e linfomi (punte di freccia arancioni). (C) Sezioni pancreatiche di animali giovani e anziani, con animali anziani che mostrano corpi apoptotici aumentati (punte di freccia blu) e regioni linfomatiche (punte di freccia arancioni). (D) Sezioni della milza di topi di 3 mesi (piccoli) e 22 mesi (anziani). Le sezioni di animali anziani mostrano depositi amiloidi (punte di freccia verde lime) e regioni linfomate. Barra della scala (A-C) 100 μm. Barra di scala (D) 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Lista di controllo per la preparazione. Un elenco passo dopo passo delle preparazioni essenziali per la dissezione e conservazione dei tessuti del topo, inclusi l'etichettatura di tubi e muffi, la preparazione di tamponi e fissativi, la preparazione per l'incorporamento criogenico, la sterilizzazione degli strumenti di disseczione, l'organizzazione delle postazioni di lavoro e la pianificazione della documentazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Lista di controllo per la raccolta dei tessuti. Usa la tabella per registrare i fazzoletti raccolti. Aggiungi il tempo di raccolta e note su condizioni o anomalie. Dai priorità ai tessuti critici per il tuo studio; raccogliere gli organi più rilevanti entro il tempo raccomandato per evitare l'autolisi/degradazione tissutale.*Nota eventuali anomalie (inclusi decolorazione degli organi, noduli, crescita maligna, dimensioni anomale degli organi). **Considera di documentare il metodo di conservazione (inclusa fissazione con PFA, incorporamento OCT o congelamento rapido). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

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Questo protocollo fornisce una strategia riproducibile per la raccolta sistematica di sistemi di più organi in topi giovani e età, consentendo analisi anatomiche, istologiche e molecolari. Diverse considerazioni tecniche possono influenzare la qualità del risultato e affrontare i limiti del metodo descritto. Innanzitutto, la variabilità nella qualità della perfusione è un fattore importante da considerare. Una perfusione incompleta può lasciare residui di sangue che compromettono istologia, immunoistochimica e analisi molecolari. La perfusione dopo una lussazione cervicale può causare traumi ai tessuti cervicali e portare a contaminazione del sangue nei polmoni. La lussazione cervicale dovrebbe quindi essere eseguita solo da personale formato. Per risultati ottimali, la perfusione deve essere eseguita sotto anestesia terminale come descritto altrove20,21 in conformità con le linee guida IACUC eAVMA 13. In secondo luogo, la fissazione è un determinante fondamentale dell'integrità tissutale. Sebbene il paraformaldeide al 4% (PFA) sia ampiamente utilizzato, può penetrare in modo inadeguato organi grandi o densi, causando una scarsa istologia e conservazione degli antigeni. Questa limitazione può essere mitigata utilizzando formalina tamponata neutra al 10% (NBF) o tagliando tessuti in sezioni da ≤5 mm per migliorare lapenetrazione 22. In terzo luogo, alcuni tessuti, in particolare pancreas, stomaco e cervello, subiscono un'autolisi rapida, richiedendo la fissazione o il congelamento entro 5-10 minuti dall'eutanasia e l'uso di strumenti di dissezionepre-raffreddati 23. Nei topi anziani, la neoplasia può ulteriormente distorcere l'anatomia e complicare la dissezione (dissection). Ulteriori artefatti possono derivare da volume di fissazione inadeguato o congelamento, portando a ritiro ed effetti di bordo; questi possono essere minimizzati mantenendo un rapporto fissativo-tessuto di almeno 10:1, evitando il sovraffollamento e pre-raffreddando gli stampi OCT prima dell'incorporazione. Infine, l'uso di PFA e formalina solleva preoccupazioni per la sicurezza e lo smaltimento; I fissativi a base di glioxali offrono alternative meno tossiche. Una gestione standardizzata, una fissazione ottimizzata e una tempistica accurata sono quindi essenziali per massimizzare la riproducibilità, la qualità dei tessuti e l'affidabilità delle analisi avalle 24.

Prelevando tessuti da oltre 15 organi all'interno dello stesso animale, questo flusso di lavoro massimizza la resa biologica per soggetto e si allinea con i mandati etici per ridurre l'uso degli animali. La procedura sistematica può essere facilmente ampliata fino a studi a media capacità che esaminano il declino fisiologico legato all'età e patologie specifiche per organi25.

Un trattamento tempestivo dei tessuti soggetti all'autolisi è essenziale per preservare l'integrità istologica. L'uso di soluzioni fisiologiche prive di calcio e magnesio, seguite da PFA al 4%, preserva in modo affidabile l'architettura degli organi e minimizza l'autolisi nei tessuti sensibili come il pancreas e il sistema digestivo. A differenza dei protocolli focalizzati su organi singoli o modelli di malattia, questo approccio consente una raccolta rapida e coerente di più organi, riducendo la variabilità e migliorando la produttività. L'intera dissezione, dalla perfusione all'escissione finale del tessuto, può essere completata entro 60 minuti per animale, rendendola adatta a studi su larga scala o sensibili al tempo 3,11,26. L'aderenza a una sequenza precisa di perfusione-fissazione minimizza gli artefatti e consente risultati riproducibili.

La coerenza nella raccolta, nel taglio e nell'inserimento dei tessuti è essenziale per una valutazione istopatologica accurata, in particolare negli studi longitudinali o multicentrici. La variabilità nel modo in cui i tessuti vengono trattati può introdurre artefatti, oscurare riscontri patologici o portare a una cattiva interpretazione del carico della malattia. Le Revised Guides for Organ Sampling and Trimming in Rats and Tope, come le guide RENI per il taglio di Ton, forniscono protocolli dettagliati e standardizzati per minimizzare taliincongruenze 22. L'adozione di questi metodi armonizzati migliora la comparabilità dei dati tra studi e istituzioni, rafforza la riproducibilità e rafforza l'integrità degli esiti basati sulla patologia nella ricerca sull'invecchiamento 4,9.

Raccogliere una moltitudine di organi è particolarmente importante nella ricerca sull'invecchiamento, dove comprendere come i sistemi organici interagiscono è essenziale per scoprire i processi che guidano il declino fisiologico dell'intero corpo con l'età. Sebbene questo approccio possa essere utile anche per una varietà di altre domande di ricerca, l'obiettivo di questo protocollo è supportare studi sull'invecchiamento in cui i cambiamenti legati all'età possono influenzare contemporaneamente più sistemi d'organi. Tuttavia, può essere applicato anche a studi focalizzati su fibrosi, rigenerazione e senescenza, in particolare quelli che integrano la trascrivomica o la scoperta di biomarcatori multi-tessuto 9,27,28.

Le valutazioni istologiche hanno rivelato alterazioni caratteristiche associate all'età su più tessuti (Figura 4). Nella pelle, gli animali anziani hanno mostrato assottigliamento epiteliale e perdita dei follicoli piliferi. Nel rene, sezioni di topi anziani hanno mostrato l'ingrossamento della capsula di Bowman insieme a cambiamenti fibrotici, necrotici e linfomatici. Il tessuto pancreasico di animali anziani ha mostrato un accumulo di corpi apoptotici e linfomi, mentre le sezioni della milza hanno mostrato depositi amiloidi e ulteriori regioni linfomatiche. Queste osservazioni sono coerenti con fenotipi di invecchiamento murino consolidati e dimostrano l'utilità di questo protocollo nel rilevare marcatori istopatologici rappresentativi dell'invecchiamento 1,18,19,27,29,30,31,32,33,34.

In sintesi, questo protocollo offre un quadro affidabile e scalabile per raccogliere e preservare i tessuti nei modelli di invecchiamento preclinici. Può essere adottata sia in studi esplorativi che guidati da ipotesi per scoprire meccanismi tessuti specifici e sistemici di invecchiamento, degenerazione e resilienza.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio della Larry L. Hillblom Foundation, dalla borsa AFAR e della Glenn Foundation for Medical Research per docenti junior, da un premio Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation per investigatori e da un New Frontier Research Award per il Program for Breakthrough Biomedical Research (PBBR) assegnato a Hanna Martens. La Figura 1 è stata creata con BioRender.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Assorbente
Età C57BL/6J topi  Il Jackson Laboratory & nbsp;#000664
Vassoi di raccolta  
Tagliacapelli senza filoBravMini+ CLP-41590Per la depilazione
Spray a etanolo 70%Fisher Scientific50-163-3592
Pinze Extra 5 INOXDumontF6521-1EAPinze a punta extra fine per i linfonodi
PinzaMilliporeSigmaXX6200006PPinza all'estremità smussata
Pinza 5 INOXDumontF6521-1EAPinze a punta fine
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) 1x 500 mLGibco14025092
Forbici micro-dissezionanti (dritte, affilate/affilate, 25mm)Roboz SurgicalRS-5668Microforbici standard, acciaio inox, lama da 25 mm (M-37)
Forbici micro-dissezionanti (lame dritte, affilate/affilate, fine)Roboz SurgicalRS-5918Forbici fine per sezionare, lunghezza 4,5" (H-327)
NBFSigma HT501128Per fissazione
Soluzione fisiologica normaleCytiva76081-514
Temperatura di taglio ottimale (OCT)Fisher Scientific23730571
Paraformaldeide (PFA) 4%Scienze della microscopia elettronica15710Per fissazione
Piastre di Petri 100 mL x 15 mLMilliporeSigmaP5856-500EA
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Gibco10010023
SpilleEisco LabsDISPINS1Per fissare il topo durante la dissezione
Siringa di plastica 20 mL, chiusura LuerFisherBrand302830Per la perfusione
Scatola Seal'N Freeze (Contenitore Criogenico)Ted Pella, Inc.20956
Crioragio Seal'N FreezeTed Pella, Inc.20956-1Per posizionare i campioni nel contenitore criogenico
Ago Farfalla Sol-Vet con adattatoreSol-Millennium Medical110301070003per la perfusione
Coperchio in polistirolo
Tissue-Tek Cyromold (Biopsia)Sakura25608-922
Giovani topi C57BL/6JIl Jackson Laboratory & nbsp;#000664

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. Hallmarks of aging: An expanding universe. Cell. 186 (2), 243-278 (2023).
  2. Schafer, M. J., et al. The senescence-associated secretome as an indicator of age and medical risk. JCI Insight. 5 (12), e133668(2020).
  3. Sladitschek-Martens, H. L., et al. Yap/taz activity in stromal cells prevents aging by controlling cGAS-STING. Nature. 607 (7920), 790-798 (2022).
  4. Tabula Muris, C. A single-cell transcriptomic atlas characterizes aging tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
  5. Farooqi, I. S., Xu, Y. Translational potential of mouse models of human metabolic disease. Cell. 187 (16), 4129-4143 (2024).
  6. Marttala, J., Andrews, J. P., Rosenbloom, J., Uitto, J. Keloids: Animal models and pathologic equivalents to study tissue fibrosis. Matrix Biol. 51, 47-54 (2016).
  7. Yuan, R., Peters, L. L., Paigen, B. Mice as a mammalian model for research on the genetics of aging. ILAR J. 52 (1), 4-15 (2011).
  8. Wang, Q., et al. The mouse multi-organ proteome from infancy to adulthood. Nat Commun. 15 (1), 5752(2024).
  9. Zhuang, J., et al. Comparison of multi-tissue aging between human and mouse. Sci Rep. 9 (1), 6220(2019).
  10. Basisty, N., et al. A proteomic atlas of senescence-associated secretomes for aging biomarker development. PLoS Biol. 18 (1), e3000599(2020).
  11. Wu, C., et al. Spatially resolved transcriptome of the aging mouse brain. Aging Cell. 23 (5), e14109(2024).
  12. Yousefzadeh, M. J., et al. Tissue specificity of senescent cell accumulation during physiologic and accelerated aging of mice. Aging Cell. 19 (3), e13094(2020).
  13. Treuting, P. M., Snyder, J. M. Mouse necropsy. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 223-233 (2015).
  14. Antal, C., et al. Tissue collection for systematic phenotyping in the mouse. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 29 (Unit 29A), 24(2007).
  15. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Mouse tissue fixation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), pdb.prot073403(2014).
  16. Brayton, C., Justice, M., Montgomery, C. A. Evaluating mutant mice: Anatomic pathology. Vet Pathol. 38 (1), 1-19 (2001).
  17. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Limited mouse necropsy. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), pdb.prot073395(2014).
  18. Pettan-Brewer, C., Treuting, P. M. Practical pathology of aging mice. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 1, (2011).
  19. Xiong, Y., et al. Arginase-II promotes tumor necrosis factor-alpha release from pancreatic acinar cells causing beta-cell apoptosis in aging. Diabetes. 66 (6), 1636-1649 (2017).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564(2012).
  21. Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  22. Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 3. A joint publication of the Rita and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 433-449 (2004).
  23. Zhao, H., et al. Identifying specific functional roles for senescence across cell types. Cell. 187 (25), 7314-7334 (2024).
  24. Aversa, Z., et al. Biomarkers of cellular senescence in idiopathic pulmonary fibrosis. Respir Res. 24 (1), 101(2023).
  25. Aghali, A., Koloko Ngassie, M. L., Pabelick, C. M., Prakash, Y. S. Cellular senescence in aging lungs and diseases. Cells. 11 (11), 1781(2022).
  26. Travaglini, K. J., et al. A molecular cell atlas of the human lung from single-cell RNA sequencing. Nature. 587 (7835), 619-625 (2020).
  27. Chen, S., et al. Integration of spatial and single-cell data across modalities with weakly linked features. Nat Biotechnol. 42 (7), 1096-1106 (2024).
  28. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  29. Hoj, K., et al. Age-related decline in pancreas regeneration is associated with an increased proinflammatory response to injury. Gastro Hep Adv. 3 (7), 973-985 (2024).
  30. Roeder, S. S., et al. Changes in glomerular parietal epithelial cells in mouse kidneys with advanced age. Am J Physiol Renal Physiol. 309 (2), F164-F178 (2015).
  31. Russell-Goldman, E., Murphy, G. F. The pathobiology of skin aging: New insights into an old dilemma. Am J Pathol. 190 (7), 1356-1369 (2020).
  32. Sparks, J., et al. Presence of systemic amyloidosis in mice with partial deficiency in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in aging. App Sci. 11 (16), 7373(2021).
  33. Sun, P., Juskevicius, R. Histological and immunohistochemical features of the spleen in persistent polyclonal B-cell lymphocytosis closely mimic splenic B-cell lymphoma. Diagn Pathol. 7, 107(2012).
  34. Vannan, A., et al. Spatial transcriptomics identifies molecular niche dysregulation associated with distal lung remodeling in pulmonary fibrosis. Nat Genet. 57 (3), 647-658 (2025).

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