Analisi ottimizzata delle proteine di ovociti ed embrioni di Xenopus mediante immunoblotting

Sommario

Questo articolo descrive un protocollo per l'analisi delle proteine degli ovociti e degli embrioni di Xenopus mediante immunoblotting. Vengono descritte le fasi di raccolta, seguite dalle fasi corrispondenti all'elaborazione del campione, alla SDS-PAGE, al trasferimento, alla colorazione degli anticorpi e all'imaging. Il protocollo enfatizza lo studio di complessi proteici regolatori traduzionali con anticorpi endogeni e anticorpi contro i tag di affinità proteica.

Abstract

L'analisi delle proteine mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) seguita da immunoblotting (western blotting) è una parte vitale del kit di strumenti del biologo molecolare. Questa tecnica separa una miscela proteica complessa in base al peso molecolare e quindi analizza la presenza di proteine bersaglio utilizzando anticorpi specifici. L'immunoblotting ha una varietà di applicazioni. Gli esempi includono l'uso come approccio mirato per studiare gli interattori proteina-proteina o come controllo per confermare l'espressione o la deplezione dei bersagli proteici. Tuttavia, l'esecuzione di successo dell'immunoblotting richiede esperimenti complicati e in più fasi. I protocolli devono essere ottimizzati per ogni organismo, proteina bersaglio e applicazione. Pertanto, esistono lacune di conoscenza per l'uso degli immunoblot in molti modelli, tra cui la rana modello Xenopus laevis.

A causa delle loro grandi dimensioni, dell'abbondante materiale per esperimenti biochimici e della facilità di manipolazione, gli ovociti e gli embrioni di X. laevis sono stati vitali per lo studio dei principi del controllo traslazionale. Tuttavia, questa specie manca di protocolli specifici per l'immunoblotting robusto e di routine. In questo caso, offriamo un protocollo approfondito per il western blotting ottimizzato per campioni provenienti da più stadi di sviluppo di Xenopus . Analizziamo quindi i regolatori traslazionali durante lo sviluppo.

Introduzione

La comprensione dei meccanismi cellulari richiede il monitoraggio di specifiche specie proteiche. Le domande comuni includono come cambiano nell'espressione spazialmente e temporalmente, con quali proteine interagiscono e se vengono modificate in risposta a condizioni diverse. L'immunoblotting, colloquialmente noto come "Western blotting", è una metodologia chiave per affrontare queste sfide. Un esperimento di immunoblot separa le proteine da un campione complesso, ad esempio il lisato di cellule intere, e le identifica utilizzando gli anticorpi. In particolare, le proteine vengono denaturate e quindi separate mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) in base alle dimensioni. Le proteine frazionate di dimensioni vengono trasferite su un supporto solido, come una membrana di nitrocellulosa, e la proteina di interesse viene identificata utilizzando reagenti anticorpali. L'immunoblotting è diventato una parte standard del kit di strumenti del biologo molecolare. È comunemente usato per monitorare l'espressione proteica in diversi contesti o come endpoint per esperimenti come i saggi di immunoprecipitazione. Nonostante questi vantaggi, l'analisi dei livelli proteici allo stato stazionario con l'immunoblotting si rivela impegnativa, poiché il test deve essere ottimizzato per ogni fase e contesto sperimentale (Figura 1).

Un contesto impegnativo è l'analisi del materiale della rana artigliata africana Xenopus laevis. X. laevis è un organismo importante per lo studio delle interazioni RNA-proteina. Questo sistema ha numerosi vantaggi, primo tra tutti che X. laevis produce centinaia di ovociti e successivamente sviluppa embrioni in modo sincrono alla volta. Ogni ovocita ha ~25 μg^{di proteina} 1 non tuorlo, fornendo materiale abbondante per esperimenti biochimici. Le grandi dimensioni (~1250 μm)¹ degli ovociti e degli embrioni facilitano anche la microiniezione di mRNA per esprimere esogenamente proteine marcate o mutate alla scala². Queste qualità consentono potenti esperimenti per saggiare il controllo traduzionale in X. laevis, come il saggio della funzione legata, in cui l'impatto di una proteina regolatrice traduzionale su un mRNA può essere analizzato indipendentemente dalla capacità di quella proteina di legare l'RNA 3,4,5,6. Tuttavia, l'immunoblotting negli ovociti e negli embrioni di Xenopus presenta difficoltà, tra cui l'interferenza di grandi masse di piastrine del tuorlo in queste cellule precoci⁷, che oscurino i risultati se non vengono rimosse.

Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per l'immunoblotting efficace in X. laevis, con particolare attenzione al rilevamento delle proteine regolatorie traduzionali. Forniamo istruzioni su come raccogliere ed elaborare ovociti ed embrioni per l'imaging dell'immunoblot finale. Sono incluse anche istruzioni dettagliate per il caricamento e l'imaging ottimali delle proteine, oltre a prevenire la contaminazione del tuorlo del campione. Inoltre, discutiamo possibili modifiche al protocollo e strategie per trovare anticorpi compatibili con le proteine Xenopus . Intendiamo fornire ai ricercatori una guida per eseguire senza sforzo l'immunoblotting come parte dei loro esperimenti in questo organismo modello sottoutilizzato.

Figura 1: Flusso di lavoro per la preparazione del campione di Xenopus e la successiva analisi dell'immunoblot. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Tutto il lavoro con gli animali (X. laevis) rappresentati in questo protocollo è conforme ed è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'UW-Madison. I dettagli dell'attrezzatura, dei reagenti utilizzati e delle concentrazioni di anticorpi impiegati sono elencati nella Tabella dei materiali. Una selezione di apparecchiature può essere visualizzata nella Figura 2, di seguito.

Figura 2: Estratto di embrione trattato e attrezzatura per l'immunoblotting. (A) Estratto di ovociti centrifugato di X. laevis stadio VI. I lipidi e le proteine liposolubili salgono in cima mentre la vitellogenina (tuorlo) e i detriti pigmentati formano una pallina. (B) Apparecchiatura per SDS-PAGE per separare le proteine in base al peso molecolare. (i) Alimentatore, (ii) Serbatoio per elettroforesi verticale, (iii) Coperchio del serbatoio per elettroforesi, (iv) Gruppo elettrodo, (v) Diga tampone, (vi) Gel per elettroforesi prefabbricato; Notare il pettine verde (in alto) e l'adesivo blu (in basso), ognuno dei quali deve essere rimosso. (C) Apparecchiature per il trasferimento di membrane. Il serbatoio e il coperchio dell'elettroforesi verticale vengono riutilizzati per il trasferimento dopo un accurato risciacquo. (i) Rullo per rimuovere le bolle, (ii) Clip di trasferimento, (iii) Piccola barra di agitazione, (iv) Membrana di nitrocellulosa tra due fogli di carta blu protettivi, (v) Carta da filtro per cromatografia di cellulosa, (vi) Cuscini in spugna di trasferimento, (vii) Teglia in vetro per il montaggio di trasferimento, (viii) Impacco di ghiaccio, (ix) Nucleo di trasferimento. (D) Altre attrezzature. (i) Rilasciatore di gel (per il taglio dei pozzetti del gel prima del trasferimento), (ii) Leva di apertura della cassetta del gel, (iii) Pinze (per la manipolazione della membrana), (iv) Contenitore (per contenere la membrana), (v) Coperchio del contenitore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Raccolta di ovociti ed embrioni di Xenopus

1. Preparazione degli ovociti
   1. Ottenere ovociti defollicolati di X. laevis da un fornitore commerciale (Ecocyte Bio Science, Austin, Texas) o isolare e defollicolare come descritto⁸.
   2. Coltura di ovociti isolati in soluzione di Barth modificata (MBS; 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,4 mM CaCl₂, 0,33 mM Ca(NO₃)₂, 0,8 mM MgSO₄, 5 mM Tris-HCl, 2,4 mM NaHCO₃, pH 7,4) fino all'uso.
2. Preparazione dell'embrione
   1. Isolare le uova di X. laevis e fecondarle come descritto ^9,10.
   2. Coltura di embrioni fecondati in 0,25x Marc's Modified Ringer's^{solution 11} (MMR) (1x MMR: 0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES).
   3. Preparare una soluzione di cisteina al 2% in MMR 0,1x con il pH regolato a 8,2 utilizzando NaOH.
   4. Rimuovere 0,25x MMR dal piatto utilizzato per la fecondazione e coprire gli embrioni con la soluzione di cisteina per rimuovere il rivestimento gelatinoso¹². Mescolare delicatamente la soluzione in modo che gli embrioni siano esposti in modo uniforme.
   5. Monitora attentamente gli embrioni con uno stereomicroscopio con un ingrandimento da 2x a 25x. Dopo che il rivestimento gelatinoso si è sciolto (in genere 3-5 minuti), gli embrioni si impacchettano strettamente. Evitare l'esposizione prolungata alla cisteina.
   6. Rimuovere la soluzione di cisteina e sciacquare gli embrioni più volte con MMR 0,25x.
   7. Coltura in MMR 0,25x fino allo stadio di crescita desiderato.
3. Raccogliere il numero desiderato di embrioni o ovociti (si consiglia almeno cinque per campione) in una provetta da 1,5 ml.
4. Rimuovere il terreno in eccesso con un pipettatore, evitando di danneggiare le cellule.
5. Utilizzare i campioni immediatamente o conservare a -80 °C fino al momento dell'uso. Gli ovociti e gli embrioni possono essere conservati per diversi anni.

2. Preparazione dell'estratto di Xenopus

1. Scongelare i campioni con ghiaccio se congelati.
2. Aggiungere 10 μl di tampone di lisi cellulare 10x refrigerato diluito a 1x con doppia acqua deionizzata (vedi Tabella dei materiali) per embrione/ovocita e omogeneizzare i campioni con un micropestello su ghiaccio.
3. Centrifugare i campioni a 5000 g a 4 °C in una centrifuga da banco per 10 minuti per pellettare i detriti, compresi il tuorlo e i pigmenti insolubili.
4. Rimuovere il surnatante in una provetta separata da 1,5 mL, facendo attenzione a evitare il pellet (Figura 2A).
5. Aggiungere al surnatante un volume uguale di 2 tamponi campione Laemmli integrati con il 5% p/v di 2-mercaptoetanolo e far bollire per 10 minuti a 95-100 °C per denaturare le proteine del campione.
6. Utilizzare immediatamente i campioni o conservarli a -20 °C per mesi o anni.

3. PAGINA SDS

1. Preparare il tampone di corsa SDS: 1x tampone Tris-MOPS-SDS (6,06 g di base Tris, 10,46 g di acido 3- (N-morfolino)propansulfonico [MOPS], 1,0 g di SDS, 0,3 g di acido etilendiamminotetraacetico [EDTA], doppia acqua deionizzata a 1000 mL).
2. Rimuovere un gel prefabbricato bis-tris SDS al 4-12% dalla confezione. Rimuovi l'adesivo sul fondo del gel.
3. Inserire il gel nel gruppo elettrodo di fronte a una diga tampone. Posizionare il gruppo elettrodo nel serbatoio dell'elettroforesi verticale (Figura 2B).
4. Riempire il gruppo elettrodo e il fondo del serbatoio dell'elettroforesi con 1x tampone di corsa Tris-MOPS-SDS.
5. Rimuovere delicatamente il pettine di gel dal gel e pipettare il tampone di scorrimento nei pozzetti per rimuovere le bolle ed equilibrare il tampone.
6. Caricare con cautela 5 μl di standard proteici precolorati nel primo pozzetto e 10 μl di ciascun campione nei pozzetti aggiuntivi.
7. (FACOLTATIVO) Caricare i pozzetti rimanenti con 10 μl di tampone per campioni Laemmli 1x per far funzionare il gel in modo più uniforme.
8. Posizionare il coperchio sul serbatoio dell'elettroforesi e collegarlo a un alimentatore. Applicare 200 V.
9. Interrompere l'elettroforesi quando il tampone del colorante del campione esce dal gel.

4. Trasferimento a umido di proteine su una membrana

1. Durante l'elettroforizzazione dei campioni, preparare 1 L di tampone di trasferimento (3,0 g di Tris Base, 4,08 g di bicine, 900 mL di acqua a doppia deionizzazione, 100 mL di metanolo). Pre-raffreddare il tampone di trasferimento a 4 °C.
   ATTENZIONE: Maneggiare le scorte di metanolo concentrato in una cappa aspirante ed evitare il contatto con la pelle. Il metanolo può essere sostituito con etanolo.
2. Prima che l'elettroforesi sia completa, iniziare ad assemblare il "sandwich" di trasferimento nella clip di trasferimento (Figura 2C).
   1. Riempire una teglia di vetro con il tampone di trasferimento freddo. Nelle successive fasi di assemblaggio del sandwich, assicurarsi che i materiali siano immersi in questo tampone.
   2. Posizionare la clip di trasferimento nella piastra con la metà nera appoggiata al fondo della piastra, la metà bianca aperta e rivolta verso l'alto e la clip di trasferimento aperta a sinistra.
   3. Appoggiare una o due spugne di fibre sulla metà nera della clip di trasferimento.
   4. Tagliare a misura due carte per cromatografia cellulosica da 0,35 mm (carte da filtro) e adagiarne una sopra le spugne.
3. Al termine dell'elettroforesi, rimuovere il gel dal serbatoio dell'elettroforesi.
4. Sollevare con cautela le piastre del gel con la leva di apertura della cassetta del gel, assicurandosi che il gel rimanga attaccato a una delle piastre (Figura 2D). Taglia i pozzetti dalla parte superiore del gel con il gel releaser.
5. Posiziona il gel, ancora attaccato a metà della cassetta di plastica, sulla carta da filtro. Rimuovere la metà della cassetta in modo che il gel rimanga sulla carta da filtro.
6. Tagliare un quadrato di membrana in nitrocellulosa da 0,45 μm per adattarlo alle dimensioni del gel. Rimuovere la membrana dalla carta protettiva, bagnarla brevemente nel tampone di trasferimento e posizionarla sul gel.
   NOTA: Maneggiare la membrana con cura dagli angoli con guanti o pinze per evitare la contaminazione proteica indesiderata della membrana.
7. Posizionare una seconda carta da filtro sopra la membrana di nitrocellulosa. Rimuovere delicatamente ma con fermezza eventuali bolle utilizzando un rullo sopra la carta da filtro.
8. Impila una o due spugne in più di fibre sopra la carta da filtro.
9. Chiudere la cassetta di trasferimento e agganciarla saldamente, completando il "sandwich".
10. Inserire il sandwich di trasferimento nell'anima di trasferimento con la clip di trasferimento rivolta verso l'alto e il lato nero della clip di trasferimento rivolto verso il lato nero dell'anima.
11. Posizionare il nucleo di trasferimento nel serbatoio dell'elettroforesi. Aggiungere un impacco di ghiaccio e una barra di agitazione al serbatoio in modo che la barra di agitazione possa ruotare liberamente.
    NOTA: In aggiunta o in sostituzione di un impacco di ghiaccio, il trasferimento può essere eseguito in una cella frigorifera a 4 °C al punto 4.13.
12. Riempire il serbatoio con un tampone di trasferimento raffreddato. Fissare saldamente il coperchio sulla parte superiore.
13. Collegare l'apparato di trasferimento all'alimentazione, assicurandosi di allineare i colori degli elettrodi. Eseguire il trasferimento per 1 ora, 100 V, a 4 °C, con l'ancoretta rotante.

5. Lavorazione della membrana post-trasferimento

1. Preparare 10 soluzioni saline tamponate Tris (100 mM di base Tris; 1,5 M di NaCl). Regolare il pH a 8 e sterilizzare con il filtro.
2. Preparare 1 soluzione salina tamponata Tris con Tween-20 (TBSTw) diluendo 10 volte la soluzione TBS 1:10 in 500 mL di acqua a doppia deionizzazione e aggiungendo 500 μL di Tween-20.
3. Preparare il tampone bloccante (500 ml di TBSTw, 25 g di latte scremato in polvere).
   NOTA: Il latte scremato può essere sostituito con il 2-5% di albumina sierica bovina (BSA) nel tampone bloccante. La BSA deve essere utilizzata se l'applicazione sperimentale prevede la visualizzazione di proteine biotinilate, poiché il latte contiene biotina.
4. Una volta completato il trasferimento, rimuovere e smontare con cura il sandwich e rimuovere la membrana in nitrocellulosa. Segna quale lato della membrana stava entrando in contatto con il gel e tieni questo lato rivolto verso l'alto nei passaggi successivi.
5. Preparare 50 ml di colorante Ponceau (0,5% Ponceau S, 1% acido acetico), un colorante reversibile per la visualizzazione delle proteine.
   ATTENZIONE: La macchia di Ponceau è corrosiva. Evitare il contatto con la pelle.
6. Posizionare la membrana in un piccolo contenitore (come mostrato nella Figura 2D) in modo che sia a filo contro il fondo del contenitore. Coprire la membrana con la macchia di Ponceau fino all'immersione e oscillare delicatamente su un dondolo per 5-10 minuti.
7. Versare la macchia di Ponceau.
   NOTA: La macchia Ponceau può essere riutilizzata più volte.
8. Sciacquare la membrana in ripetuti lavaggi di acqua a doppia deionizzazione fino a quando l'eccesso di Ponceau non viene rimosso e le bande proteiche nelle corsie iniziano a risolversi.
9. Confermare l'efficienza del trasferimento con la presenza di corsie diritte e uniformi con bande chiaramente risolte.
10. Versare il liquido rimanente e immergere il blot nel tampone bloccante per evitare che gli anticorpi aspecifici si leghino alla membrana nelle fasi a valle.
11. Oscillare delicatamente su un dondolo per 30-60 minuti a temperatura ambiente.

6. Incubazione degli anticorpi

1. Diluire l'anticorpo primario in 10 mL di tampone bloccante fresco alla concentrazione desiderata.
   NOTA: La concentrazione ottimale dovrà essere determinata empiricamente per ogni nuovo anticorpo. Un tipico punto di partenza è 1:1000, oppure seguire le raccomandazioni del produttore.
2. Rimuovere il tampone bloccante e sostituirlo con la miscela di anticorpi. Incubare, dondolando delicatamente, per una notte (~16 h) a 4 °C.
3. Versare la soluzione di anticorpi primari e sciacquare la membrana con TBSTw immergendola nella soluzione e versandola rapidamente.
   NOTA: La maggior parte delle miscele di anticorpi può essere conservata e riutilizzata due o tre volte. Questo deve essere determinato empiricamente per ogni anticorpo.
4. Lavare la membrana immergendola in TBSTw e facendola oscillare delicatamente a temperatura ambiente per 5 min. Eseguire tre lavaggi totali di 5 minuti.
5. Diluire l'anticorpo secondario in 30 mL di TBSTw alla concentrazione desiderata.
   NOTA: La concentrazione dovrà essere determinata empiricamente per ciascun anticorpo. In genere utilizziamo 1:30.000.
6. Versare la soluzione di lavaggio TBSTw e sostituirla con la miscela di anticorpi secondari. Incubare, dondolando leggermente, per 45 minuti a temperatura ambiente.
7. Sciacquare rapidamente la membrana una volta con TBSTw seguito da tre lavaggi TBSTw di 5 minuti.

7. Imaging della membrana su uno sviluppatore di film

1. In una camera oscura, accendi lo sviluppatore di pellicole e lascialo riscaldare.
2. Taglia due quadrati di pellicola trasparente abbastanza grandi da racchiudere la membrana. Usando una pinza, posizionare la membrana di nitrocellulosa 'a faccia in su' sul primo quadrato di pellicola trasparente.
3. In una provetta da 1,5 mL, miscelare quantità uguali di Luminol a chemiluminescenza potenziata (ECL) e reagenti Enhancer. L'uso di 1 mL di soluzione miscelata dovrebbe coprire la maggior parte delle membrane.
4. Pipettare il reagente ECL sulla membrana e manipolare delicatamente la membrana utilizzando l'involucro di plastica per garantire una copertura completa. Incubare per 1 minuto.
5. Rimuovere il reagente ECL in eccesso afferrando la membrana con una pinza e scrollando delicatamente di dosso il liquido o allontanando il liquido toccando un angolo della membrana con un tovagliolo di carta.
6. Posiziona la membrana a faccia in su sul secondo quadrato di pellicola trasparente e piega la pellicola trasparente sulla membrana fino a quando non è sigillata in modo lasco. Fissare saldamente la membrana avvolta in una cassetta per autoradiografia.
7. Nella camera oscura, posizionare una pellicola all'interno della cassetta, coprendo la membrana nastrata. Chiudere saldamente la cassetta ed esporre la pellicola alla membrana per 1 minuto.
8. Rimuovere con cura la pellicola, facendo attenzione a non trascinare la pellicola esposta lungo la membrana. Inseriscilo nello sviluppatore del film.
9. Dopo aver valutato la pellicola sviluppata, regolare il tempo di esposizione con le pellicole successive fino a ottenere la visualizzazione delle proteine desiderata. Se la visualizzazione della proteina fornisce un segnale debole, ripetere la fase di incubazione del reagente ECL con un reagente ECL più sensibile e ricreare l'immagine.
10. Allineare la pellicola sviluppata con i marcatori fosforescenti e utilizzare questo riferimento per contrassegnare la posizione degli standard proteici precolorati sulla membrana sulla pellicola.
11. Una volta completata l'imaging, rimuovere con cautela la membrana dall'involucro di plastica e immergerla in TBSTw per lavare via il reagente ECL rimanente.

8. (Facoltativo) Incubazioni di anticorpi aggiuntive

NOTA: Lo stripping di un immunoblot si riferisce alla rimozione degli anticorpi primari e secondari iniziali con una soluzione denaturante (tampone di stripping) in modo che il blot possa essere nuovamente sondato con un anticorpo diverso. Il re-probing consente di analizzare lo stesso immunoblot per l'espressione di diversi bersagli proteici e di confrontare proteine sconosciute con proteine ben caratterizzate che funzionano come standard. Sonda per prima con l'anticorpo che produce il segnale relativamente più debole. In questo modo si evitano artefatti causati da anticorpi non completamente rimossi nelle esposizioni successive e si riduce al minimo l'impatto della perdita di proteine dovuta allo stripping ripetuto di un blot.

1. Spogliare gli anticorpi legati immergendo la membrana nel tampone di stripping e facendo oscillare delicatamente per 5-10 minuti.
2. Rimuovere la membrana dal tampone di strippaggio e risciacquare brevemente in TBSTw per rimuovere eventuali residui di soluzione di stripping.
3. Immergere la membrana nel tampone bloccante e agitare delicatamente per 30 minuti.
4. Preparare una nuova soluzione di anticorpo primario nel tampone bloccante con la concentrazione desiderata.
5. Aggiungere la nuova diluizione dell'anticorpo primario alla membrana e incubare delicatamente dondolando per una notte a 4 °C.
6. Procedere dal passaggio 6.3 in poi. La membrana può essere sverniciata e ritestata fino a tre volte aggiuntive.

Risultati

Per dimostrare l'efficienza del nostro protocollo di immunoblotting, abbiamo analizzato le proteine di controllo traduzionale endogene e marcate per affinità in tre tipi di campioni di X. laevis: ovociti in stadio VI, embrioni in stadio 7 (blastula) ed embrioni in stadio 10,5 (gastrula). Questi stadi sono stati scelti perché abbracciano la transizione medio-blastula (stadio 8.5), che segna l'inizio della robusta trascrizione zigotica^13,14. Poiché lo sviluppo prima della transizione della blastula media avviene in assenza di trascrizione, gli embrioni pre-zigoti (cioè controllati dalla madre) si affidano fortemente ai meccanismi di controllo traduzionale per esprimere le proteine del destino cellulare alla corretta risoluzione temporale e spaziale¹⁵. Pertanto, la transizione mid-blastula è un contesto vitale in cui studiare le interazioni RNA-proteina.

Per analizzare l'espressione proteica tramite immunoblotting, agli ovociti e agli embrioni di X. laevis sono stati iniettati 500 pg di mRNA che codifica per la metà C-terminale di X. laevis Bicaudal-C (Bicc1) fusi con 3x tag di affinità per l'emoagglutinina (HA). Abbiamo scelto di analizzare Bicc1 per la sua rilevanza per la biologia di Xenopus e le interazioni proteina-RNA. Bicc1 è una proteina legante l'mRNA e un repressore traduzionale che guida le decisioni sul destino cellulare nell'embrione precoce 16,17,18. Più tardi nello sviluppo, influisce sul modello sinistra-destra ^19,20,21 e sulla funzione degli organi, compresi i reni 22,23,24,25. Bicc1 contiene una regione che dirige la repressione traduzionale⁵ e i domini di omologia hnRNP K (KH) che mediano il legame a specifici mRNA 5,26,27,28.

Gli estratti sono stati preparati da cinque ovociti o embrioni iniettati con HA-Bicc1, insieme ai corrispondenti campioni non iniettati come controlli negativi. Un decimo di ciascun estratto è stato elettroforesato su un gel di bis-tris gradiente al 4-12% e trasferito a umido su una membrana di nitrocellulosa. La colorazione Ponceau della membrana per rilevare la proteina totale ha confermato il successo del trasferimento (Figura 3A). Nell'ambito dei nostri studi, abbiamo generato un anticorpo nei conigli che riconosce la metà C-terminale della proteina Bicc1 umana. Questo anticorpo è stato utilizzato per rilevare la proteina Xl-Bicc1 endogena ed esogena (Figura 3B). Lavori precedenti hanno dimostrato che la proteina Bicc1 è assente dagli ovociti di X. laevis , ma è espressa negli embrioni pre-MBT, prima che il genoma zigotico sia attivo¹⁶. Ciò suggerisce che mentre l'mRNA di Bicc1 si accumula durante l'ovogenesi, viene represso traduzionalmente. In accordo con questo lavoro precedente, il Bicc1 endogeno non è stato rilevato negli ovociti. Al contrario, l'anticorpo ha riconosciuto Bicc1 endogeno (~MW 107 kDa) sia negli embrioni allo stadio 7 che in quelli 10,5. Nel loro insieme, questi risultati convalidano che l'anticorpo riconosce la proteina endogena Bicc1 (Figura 3B, pannello superiore, punta di freccia rossa). L'anticorpo Bicc1 ha riconosciuto una proteina più piccola di circa 70 kDa negli estratti preparati da campioni iniettati con mRNA (Figura 3B, pannello superiore, punta di freccia nera, confrontare le corsie 2, 4 e 6 con le corsie 1, 3 e 5). Come controllo per la specificità dell'anticorpo Bicc1, la membrana è stata rimossa e ritestata con un anticorpo contro il tag di affinità HA. L'anticorpo HA ha identificato la proteina 70 kDa nei campioni iniettati, ma non ha riconosciuto il Bicc1 endogeno (Figura 3B, secondo pannello, punta di freccia nera). L'individuazione del termine C HA-Bicc1 varia di intensità tra gli stadi a causa delle differenze nell'espressione proteica dell'mRNA iniettato nei diversi tipi di cellule.

Successivamente, abbiamo ampliato i risultati testando l'espressione di proteine regolatorie traduzionali endogene che interagiscono con Bicc1. In primo luogo, abbiamo analizzato l'espressione della subunità 1 del complesso di trascrizione Ccr4-Not (Cnot1), una grande proteina dell'impalcatura e parte del complesso Ccr4-Not deadenilasi (CNOT). Il complesso CNOT multi-subunità è una delle principali deadenilasi eucariotiche ed è principalmente noto per il taglio della coda di poli(A) alla fine degli mRNA messaggeri come preludio alla loro degradazione. Tuttavia, questo complesso ha diversi ruoli nel controllo traslazionale che si estendono oltre la deadenilazione²⁹. Eravamo interessati a saggiare l'espressione di Cnot1 a causa dell'importanza del complesso CNOT per la regolazione dell'mRNA e delle precedenti osservazioni che Cnot1 interagisce con Bicc1^20,30. Per analizzare l'espressione di Cnot1, abbiamo utilizzato un anticorpo che riconosce la proteina Cnot1 endogena. Ha identificato due proteine a 250 kDa e 270 kDa in ciascun campione, la dimensione prevista di Cnot1 (Figura 3B, terzo pannello). Pertanto, questo protocollo ci consente di identificare prontamente una componente critica di un complesso normativo. Inoltre, questi dati supportano la capacità del protocollo di identificare con successo le proteine ad alto peso molecolare.

Per testare ulteriormente la generalizzabilità di questi risultati, abbiamo successivamente analizzato i campioni per la presenza di un'importante elicasi DEAD-box coinvolta nella repressione traduzionale, DEAD-box helicase 6 (Ddx6, precedentemente noto come xp54 in Xenopus e me31b in Drosophila). Ddx6 è un componente importante dei granuli ribonucleoproteici, è coinvolto nell'immagazzinamento dell'mRNA e interagisce con Bicc1 e Cnot1 ^6,31,32. Un anticorpo che riconosce la Ddx6 endogena ha identificato una proteina di circa 54 kDa in ciascun campione (Figura 3B, quarto pannello). L'espressione era ridotta negli embrioni zigoti (Figura 3B, confrontando le corsie 5 e 6 con 1-4), come riportato in precedenza³³.

Infine, per garantire che le differenze osservate tra i campioni fossero dovute a differenze di espressione, abbiamo rimosso e risondato l'immunoblot con un anticorpo che riconosce l'enzima gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (Gapdh). Gapdh funge da "controllo del carico" espresso in modo onnipresente. Livelli equivalenti di espressione di Gapdh confermano la colorazione di Ponceau: una quantità uguale di proteina totale viene analizzata in tutti i campioni (Figura 3B, quinto pannello).

Insieme, questi risultati confermano l'efficacia di questo metodo immunoblot. Siamo stati in grado di identificare Bicc1 esogeno ed endogeno in più stadi di sviluppo di X. laevis rilevanti per lo studio delle interazioni RNA-proteina: ovociti ed embrioni pre-MBT, che contengono solo mRNA depositati dalla madre, ed embrioni post-MBT, che includono anche mRNA trascritti zigoticamente. Siamo stati in grado di generalizzare questi risultati analizzando l'espressione di più proteine di controllo traduzionali a una varietà di pesi molecolari (Bicc1, Cnot1 e Ddx6) e un controllo di carico (Gapdh). Mostriamo anche che questo protocollo può essere utilizzato per gli embrioni di X. tropicalis con modifiche per aumentare la quantità di materiale utilizzato per tenere conto delle loro dimensioni più piccole (Figura 1 supplementare).

Figura 3: Identificazione dei livelli di proteine regolatorie traduzionali attraverso l'immunoblotting in X. laevis. (A) Colorazione di Ponceau dell'immunoblot per identificare la proteina totale da ovociti di stadio VI di X. laevis , embrioni di stadio 7 ed embrioni di stadio 10.5. Ogni corsia rappresenta il 10% della proteina preparata da un estratto (0,5 ovocita o embrione). (B) Analisi immunoblot di proteine regolatorie traduzionali selezionate di X. laevis in ovociti in stadio VI, embrioni in stadio 7 ed embrioni in stadio 10.5. Le corsie 2, 4 e 6 corrispondono a campioni microiniettati con mRNA HA-Bicc1 prima dell'analisi, mentre le corsie 1, 3 e 5 fungono da controlli negativi (non iniettati). L'anticorpo α-Bicc1 è stato utilizzato per saggiare l'espressione di Bicc1 endogeno in tutti gli stadi (pannello superiore). Il blot è stato successivamente rimosso e ri-sondato con un anticorpo al tag di affinità HA come controllo per la specificità anticorpale α-Bicc1 (secondo pannello). I blot sono stati rimossi e ritestati alla ricerca di ulteriori proteine regolatorie utilizzando α-Cnot1 (terzo pannello) e α-Ddx6 (quarto pannello). α-Gapdh (pannello inferiore) fungeva da controllo per un carico proteico uguale. Le punte di freccia rosse segnano la posizione del Bicc1 endogeno, mentre le punte di freccia nere segnano la posizione del termine C HA-Bicc1 espresso esogenamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Analisi immunoblot della proteina Bicc1 in Xenopus laevis rispetto a Xenopus tropicalis. L'anticorpo α-Bicc1 è stato utilizzato per analizzare l'espressione di Bicc1 endogeno ed esogeno in diverse quantità di estratto embrionale di X. laevis e X. tropicalis . Corsia 1: 0,5 embrione di X. laevis non iniettato. Corsia 2: 0,5 HA-Bicc1 embrione iniettato di X. laevis . Corsia 3: 3 embrioni di X. tropicalis non iniettati. Corsia 4: 1 embrione di X. tropicalis non iniettato. Corsia 5: 0,5 embrione di X. tropicalis non iniettato. Sono stati utilizzati due anticorpi che riconoscono il Bicc1 endogeno: uno sollevato contro Bicc1 umano (pannello superiore) e l'altro sollevato contro X. laevis Bicc1 (pannello centrale). α-Gapdh (pannello inferiore) è stato utilizzato per controllare lo stesso carico di proteine. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Sebbene semplice nel concetto, l'immunoblotting è difficile nella pratica a causa di più passaggi che durano diversi giorni. Pertanto, ottenere risultati coerenti e di alta qualità è spesso difficile. Tuttavia, l'immunoblotting è una componente vitale e onnipresente della biologia moderna. Ad esempio, l'immunoblotting è fondamentale per confermare il successo della traduzione e dell'espressione dell'mRNA microiniettato negli ovociti e negli embrioni di X. laevis , evidenziandone l'importanza per la ricerca su X. laevis . Inoltre, gli esperimenti di immunoprecipitazione utilizzano l'immunoblotting per analizzare le interazioni proteina-proteina in vivo . L'individuazione efficiente di proteine specifiche dipenderà in gran parte dalla loro abbondanza e dalla qualità dei reagenti per la rilevazione degli anticorpi. In questo studio, le concentrazioni stimate della proteina endogena che abbiamo analizzato variano a quasi 500 volte nell'uovo di Xenopus (Bicc1: 37,22 nM, Cnot1: 115,08 nM, Ddx6: 980,55 nM, Gapdh: 17.907,26 nM)³⁴, ma tutte sono state rilevate prontamente. Al di sotto di questo intervallo, è possibile apportare modifiche al flusso di lavoro praticamente in ogni fase di un immunoblot, dalla raccolta del campione all'imaging, per migliorare l'accuratezza e l'efficienza del rilevamento, se necessario.

Il tipo di gel e membrana SDS-PAGE da utilizzare sono considerazioni importanti per qualsiasi esperimento di immunoblotting. Nella nostra esperienza, i gel prefabbricati sono più facili e riproducibili rispetto ai gel prodotti internamente. I gel prefabbricati hanno l'ulteriore vantaggio di essere disponibili in formati a gradiente in cui i gel aumentano gradualmente la concentrazione di poliacrilammide dall'alto verso il basso. I gel a gradiente consentono ai ricercatori di risolvere e analizzare un'ampia gamma di proteine con pesi molecolari molto diversi. In questo modo si evita il tipico compromesso tra la scelta di un gel a bassa percentuale di acrilammide (<7%), che risolve le proteine ad alto peso molecolare, rispetto a un gel ad alta percentuale (>12%), che è migliore nel risolvere le proteine a basso peso molecolare. È anche importante considerare se utilizzare una membrana in nitrocellulosa o fluoruro di polivinilidene (PVDF) per il trasferimento delle proteine. Il meccanismo e i vantaggi di ciascun tipo di membrana sono stati ampiamente discussi ^35,36. In breve, il PVDF ha una maggiore capacità di legare le proteine (e quindi una maggiore sensibilità) rispetto alla membrana in nitrocellulosa ed è più durevole per un uso ripetuto. Tuttavia, il PVDF richiede una manipolazione aggiuntiva sotto forma di attivazione mediante incubazione del metanolo ed è più costoso. Sebbene riteniamo che entrambe le membrane siano adatte per la maggior parte delle applicazioni, utilizziamo abitualmente la nitrocellulosa a causa di considerazioni sui costi.

L'imaging dell'immunoblot è una componente cruciale del protocollo. Durante questa fase, i ricercatori devono esercitare il giudizio per catturare un'immagine di un immunoblot che trasmetta tutte le informazioni necessarie ma mantenga al minimo il rumore di fondo. Esistono due metodi di imaging principali per gli anticorpi standard coniugati con HRP: la pellicola a raggi X o i sistemi di imaging digitale. Nella nostra esperienza, l'acquisizione di immagini con la pellicola radiografica ha molti vantaggi. Le pellicole a raggi X sono generalmente molto più sensibili dei sistemi di imaging digitale, facilitando il rilevamento di proteine a bassa abbondanza. Le pellicole a raggi X producono anche una registrazione fisica dell'esperimento che può essere annotata e digitalizzata ad alta risoluzione. Tuttavia, un sistema di imaging digitale avrà una gamma lineare di gran lunga superiore - la relazione tra la potenza del segnale e l'intensità dell'immagine - rispetto a uno sviluppatore di pellicole. A causa della sua sensibilità, una pellicola a raggi X può sovraesporsi rapidamente, perdendo informazioni quantitative. Pertanto, un ricercatore che cerca una quantificazione precisa dei propri risultati dovrebbe utilizzare un sistema di imaging digitale o prestare particolare attenzione a non sovraesporre gli immunoblot in via di sviluppo con pellicola a raggi X.

Se i risultati dell'immunoblotting non sono soddisfacenti dopo aver seguito il protocollo come abbiamo delineato, come bande deboli o "sfocate" all'imaging, è possibile apportare più aggiustamenti per migliorare il risultato. Ad esempio, la quantità di miscela proteica Xenopus analizzata può essere regolata. Le proteine totali provenienti da un minimo di un quinto di un embrione possono produrre ottimi risultati, anche se è possibile caricare fino a due embrioni o ovociti per corsia di gel. Un carico eccessivo di proteine può causare artefatti o segnali di fondo elevati spuri durante l'imaging. Inoltre, l'elettroforesi a una tensione più bassa (100 V) per un tempo di funzionamento più lungo porta generalmente a bande proteiche più nitide. Allo stesso modo, l'esecuzione del trasferimento proteico notturno a 4°C a bassa tensione (30 V) invece di un'ora a 100 V può migliorare il rilevamento delle proteine, soprattutto per le specie ad alto peso molecolare. Infine, alcune incubazioni di anticorpi primari rilevano i loro bersagli in modo più robusto utilizzando incubazioni di 1 ora a temperatura ambiente, rispetto a 4 °C durante la notte. Questa modifica del protocollo deve essere testata per ogni anticorpo primario.

L'identificazione di anticorpi per rilevare le proteine endogene rappresenta una sfida importante per l'immunoblotting in Xenopus, poiché sono disponibili in commercio relativamente pochi anticorpi specifici per Xenopus. I ricercatori possono beneficiare di fonti non commerciali di anticorpi Xenopus come Xenbase³⁷ (https://www.xenbase.org/xenbase/), la Developmental Studies Hybridoma Bank (https://dshb.biology.uiowa.edu/) e l'European Xenopus Resource Centre (https://xenopusresource.org/). In alternativa, gli anticorpi generati per riconoscere le proteine umane o di topo possono essere utili per rilevare le proteine omologhe di Xenopus, a seconda della conservazione delle regioni utilizzate per la produzione di anticorpi. Ad esempio, un anticorpo Bicc1 presentato in questo protocollo è stato sollevato contro la proteina Bicc1 umana. Per tali reagenti, la capacità di reagire in modo incrociato con le proteine Xenopus deve essere determinata empiricamente. Sebbene gli epitopi esatti che le aziende utilizzano per creare anticorpi siano generalmente proprietari, molti forniranno una gamma di aminoacidi per l'epitopo su richiesta. Questa regione può quindi essere allineata con la regione corrispondente della proteina omologa Xenopus. Sebbene il successo non sia garantito, in genere abbiamo avuto successo quando l'epitopo utilizzato per la produzione di anticorpi nella specie bersaglio mostra almeno il 75% o più di somiglianza con il tratto di sequenza comparabile in Xenopus. Gli anticorpi generati contro le proteine non-Xenopus devono essere convalidati prima di un uso estensivo, poiché una verifica impropria degli anticorpi è un importante contributo alla ricerca irriproducibile^38,39. Questo può essere fatto esprimendo una proteina Xenopus marcata di interesse negli embrioni attraverso la microiniezione di mRNA⁴⁰. L'analisi degli stessi campioni con un anticorpo verso il tag di affinità viene quindi utilizzata per confermare che l'anticorpo contro la proteina endogena e l'anticorpo contro la proteina marcata riconoscano entrambi la stessa entità (come nella Figura 3B).

L'analisi delle proteine leganti l'RNA, in particolare quelle con funzioni regolatorie come Bicc1, può rivelarsi impegnativa a causa della scarsità di reagenti e della bassa espressione di potenti molecole regolatorie. Questo problema diventa più evidente nell'immunoblotting, dove ogni reagente deve essere ottimizzato separatamente e trovare anticorpi di sufficiente specificità e sensibilità può essere difficile. Il nostro intento con questo protocollo è quello di affrontare le limitazioni specifiche dell'immunoblotting in Xenopus ed elaborare passaggi applicabili ad altri sistemi, in modo tale che i ricercatori possano superare le difficoltà di analisi delle proteine leganti l'RNA.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fasciatura Premium Heavy Duty di 100 piedi quadrati	Saran	2570000130
Buffer di lisi cellulare 10x	Tecnologia di segnalazione cellulare	#9803
2-Mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	M3148
Piatto da forno/servizio oblungo da 2 quarti	Pirex	71160010116
2x Buffer di campione Laemmli	Bio-Rad	#1610737
Anticorpo ad alta affinità anti-HA	Roche	11867423001	Preparato come indicato e usato a diluizione 1:10.000.
Anti-Coniglio IgG, Anticorpo legato all'HRP	Tecnologia di segnalazione cellulare	7074S	Usata a diluizione 1:30.000.
Cassetta autoradiografia, 5 x 7 pollici	Prodotti di Ricerca Internazionale	420057	Non è necessario se si utilizza un sistema di imaging digitale.
Bel-Art Pestelli usa e getta	Millipore Sigma	BAF199230001
Anticorpo del coniglio Bicaudal-C (umano)	Envigo Bioproducts (ora Inotiv)	N/A	Su misura. Usato a diluizione 1:20.000.
Anticorpo del coniglio Bicaudal-C (Xenopus)	Envigo Bioproducts (ora Inotiv)	N/A	Su misura. Usato a diluizione 1:20.000. Rif. Park et al., 2016
Albumina Sirica Bovina	Sigma-Aldrich	A3294	Un sostituto del latte scremato nel tampone bloccante.
Centrifuga 5425	Eppendorf	13-864-456
CL-XPosure Film	ThermoFisher Scientific	34091	Non è necessario se si utilizza un sistema di imaging digitale.
Anticorpo monoclonale CNOT1 (D5M1K) del coniglio	Tecnologia di segnalazione cellulare	#44613	Usato a diluizione 1:2.000.
DDX6/RCK (D26C11) Anticorpo monoclonale del coniglio	Tecnologia di segnalazione cellulare	#8988	Usato a diluizione 1:5.000.
E-Z Store and Pour Developer	MXR Imaging	103633	Non è necessario se si utilizza un sistema di imaging digitale.
E-Z Store and Pour Fixer	MXR Imaging	114511	Non è necessario se si utilizza un sistema di imaging digitale.
Anticorpo monoclonale GAPDH	ProteinTech	60004-1-IG	Usato a diluizione 1:40.000.
Rilascio gel	Bio-Rad	#1653320
Anticorpo secondario anti-topo IgG (H+L) di capra, HRP	Invitrogen	A16066	Preparato come indicato e usato a 1:40.000 di diluizione.
Impacco di ghiaccio, 8 oz, 5 x 3 x 1"	Uline	S-18256
L-Cisteïna	Sigma-Aldrich	C7352
Processore di film medico	Konica Minolta	SRX-101A	Non è necessario se si utilizza un sistema di imaging digitale.
Mini-PROTEAN  Leva di apertura della cassetta	Bio-Rad	#4560000
Mini-PROTEAN  Cella di elettroforesi verticale tetra	Bio-Rad	#1658004
Serbatoio di elettroforesi MSE PRO da 700ml Western Blot	MSE Supplies	BB2369
Membrana di nitrocellulosa, 0,45 & micro; m	Bio-Rad	#1620115
Latte secco scremato	Sanalac	1570000180
Peroxidasi AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	112-035-003	Preparato come indicato e usato a 1:100.000 di diluizione.
Polisorbato (Preadolescenti) 20	Bioreagenti Fisher	BP337-500
Ponceau S	VWR Scienze della Vita	K793-500ML	Si può fare un'approssimazione con 0,5% Ponceau S, 1% acido acetico
Alimentazione di base PowerPac	Bio-Rad	1645050
Oscillatore 2D a velocità variabile PR1MA	MidSci	R2D-30
Scala degli Standard Duali Proteine Precision Plus Color	Bio-Rad	#1610374	Può essere utilizzata qualsiasi scala proteica preferita.
Carta filtrante per cromatografia a cellulosa pura, 0,35 mm	Fisher Scientific	05-714-4
Ripristina la Barriera di Ripulimento Western Blot	ThermoFisher Scientific	#21059
Cloruro di sodio	Fisher Chemical	S640-10
Scatola di stoccaggio 300 mL	Rosti Mepal	RST46608	Per il blocco della membrana della nitrocellulosa, l'incubazione degli anticorpi e i lavaggi
Substrato di massima sensibilità SuperSignal West Femto	ThermoFisher Scientific	#34094	Un substrato chemiluminescente (ECL) potenziato contenente due componenti: luminolo e potenziatore. Questo reagente ECL ha una bassa sensibilità al femtogramma.
Substrato chemiluminescente SuperSignal West Pico PLUS	ThermoFisher Scientific	#34580	Un substrato chemiluminescente (ECL) potenziato contenente due componenti: luminolo e potenziatore. Questo reagente ECL ha una sensibilità picogramma-femtogramma.
SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 4– 12%, 10 pozzi di geli di poliacrilammide	GenScript	M00652
Polveri tampone di trasferimento	GenScript	M00652
Tris Base Ultrapure	USBiological	77-86-1
Tris-MOPS-SDS Polvere tampone di funzionamento	GenScript	M00138